一种编码缺刻缘绿藻Δ9脂肪酸去饱和酶的DNA序列及其应用

摘要

本发明涉及一种编码缺刻缘绿藻Δ9脂肪酸去饱和酶的DNA序列及其应用。通过对缺刻缘绿藻转录组高通量数据库的筛选，获得1条与已知物种Δ9FAD基因同源的contig序列，并由此设计引物，利用cDNA末端快速扩增技术克隆获得缺刻缘绿藻Δ9FAD基因的全长序列，在油酸合成缺陷型ole1突变株的酿酒酵母中异源表达该基因去叶绿体转运肽的ORF，对转基因酵母的脂肪酸进行GC-MS分析，在该转基因突变株酵母中检测到新产生的物质—棕榈油酸和油酸，从而证明该基因所编码的蛋白具有Δ9FAD的功能。本发明为在植物体中进行遗传操作，以实现PUFA的高效合成创造了条件。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体地说，涉及一种编码缺 刻缘绿藻Δ9脂肪酸去饱和酶的DNA序列及其应用。

背景技术

生物体中存在着大量的多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid，PUFA)， 这些PUFA对于维持生物体正常的生理功能具有重要作用，根据从甲基端第一 个双键开始的位置可以将PUFA分为ω-3系和ω-6系。在ω-6系PUFA中，花 生四烯酸(arachidonicacid，C20:4^Δ5,8,11,14，AA)是最具代表性的脂肪酸之一。 AA属人体必需脂肪酸，是机体中具有重要生理作用的20碳多烯衍生物的前体， 如前列腺素E2、前列环素和白三烯等。AA还是一种重要的营养食品，在大脑 和视力发育方面具有特殊作用，因此被广泛添加到婴幼儿食品配方中。此外， AA还是一种高档化妆品原料，将其添加到一些美容护肤用品及美发用品中，可 以起到保持皮肤湿润、延缓皮肤衰老及预防和治疗脱发的功效。

AA的传统来源是海洋鱼油和动物脏器。但动物组织中AA含量很低，约为 0.2％和0.5％，用这种方法制备的AA价格昂贵，难以满足市场的需要。近年来国 外开始以微生物为原料生产AA，例如，高山被孢霉(Mortierallaalpina)的一个 商业性菌株1S-4已被用于工业化发酵生产AA。而缺刻缘绿藻(Myrmeciaincisa Reisigl)的发现，为利用光生物反应器大规模工业化生产AA提供了新的思路。

缺刻缘绿藻是单细胞绿藻，属于绿藻门、Trebouxiophyceae纲，细胞常聚集 在一起形成类似非定形群体的细胞团。研究发现该藻含有大量的AA，尤其在氮 饥饿条件下，其含量能达到藻体总脂肪酸含量的60％。

在缺刻缘绿藻等微藻中，AA的合成往往是从饱和脂肪酸开始，即由硬脂酸 向油酸转化，该步骤是由Δ9FAD催化，在硬脂酸的C9和C10之间引入第一个 不饱和的双键，生成油酸。之后，油酸沿着ω-6途径，再在Δ12、Δ6及Δ5等 一系列FAD以及Δ6脂肪酸延长酶的作用下，最终合成AA。由此可见，由Δ9FAD 将硬脂酸去饱和生成油酸是AA合成的关键一步。

克隆和鉴定获得缺刻缘绿藻Δ9FAD编码基因对于在植物体中进行遗传操 作，以实现PUFA的高效合成具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种多肽。

本发明的再一的目的是，提供一种分离的核苷酸序列。

本发明的另一的目的是，提供一种重组表达载体。

本发明的第四个目的是，提供一种基因工程化的宿主细胞。

本发明的第五个目的是，提供如上所述的多肽、如上所述的核苷酸序列、 如上所述的重组表达载体、或如上所述的宿主细胞的用途。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种多肽，所述的多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.15的第62-432位或 SEQIDNO.15所示。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种分离的核苷酸序列，所述的核苷酸序列包括：

a)SEQIDNO.3的第341bp至第1453bp、SEQIDNO.3的第158bp至 第1453bp、SEQIDNO.3或SEQIDNO.12所示的核苷酸序列；或

b)与a)所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种重组表达载体，所述的重组表达载体是由如上所述的核苷酸序列与质 粒或病毒所构建的重组表达载体。

作为本发明的一种具体实施方式，所述的质粒是pYES2质粒。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

一种基因工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞选自于下列中的一种：

a)用如上所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞；

b)用如上所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞。

作为本发明的一种具体实施方式，所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、 植物细胞或动物细胞。

作为本发明的一种具体实施方式，所述的宿主细胞是酵母细胞。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的多肽、如上所述的核苷酸序列、如上所述的重组表达载体、或 如上所述的宿主细胞在合成多不饱和脂肪酸中的用途。

如上所述的多肽、如上所述的核苷酸序列、如上所述的重组表达载体、或 如上所述的宿主细胞在将棕榈酸去饱和为棕榈油酸或将硬脂酸去饱和为油酸 中的用途。

本发明优点在于：

本发明通过对缺刻缘绿藻转录组高通量数据库的筛选，获得1条与已知物 种Δ9FAD基因同源的contig序列(Contig16329)，并由此设计引物，利用cDNA 末端快速扩增技术(RACE)克隆获得缺刻缘绿藻Δ9FAD基因的全长序列。 在油酸合成缺陷型ole1突变株的酿酒酵母中异源表达该基因去叶绿体转运肽 的ORF，对转基因酵母的脂肪酸进行GC-MS分析，在该转基因突变株酵母中 检测到新产生的物质——棕榈油酸和油酸，从而证明该基因所编码的蛋白具有 Δ9FAD的功能，且去饱和效率高。本发明为在植物体中进行遗传操作，以实 现PUFA的高效合成创造了条件。

附图说明

图1.Δ9FAD基因cDNA与DNA序列扩增产物电泳图(A)及其基因结 构(B)。泳道M：DL2000分子量标准；泳道1：5′-RACE末端产物；泳道2： 3′-RACE末端产物；泳道3到6：分别是利用引物对Seq4和Seq5、Seq6和 Seq7、Seq8和Seq9及Seq10和Seq11进行基因DNA序列的扩增产物。灰 线和黑线分别为UTR及内含子，黑框为外显子。

图2.pMD19-T载体图谱。

图3.pYES2载体图谱。

图4.酵母脂肪酸成分的气相色谱和GC-MS图谱。A：气相色谱图；B、C： 分别为图A-c中自左至右出现两个新物质峰的MS图谱。a：ole1突变型对照组； b：转空载体对照组；c：转缺刻缘绿藻Δ9FAD基因的酵母Y-Δ9FAD。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

本发明所采用的主要操作包括：

1)缺刻缘绿藻在温度为25℃、光照强度为115μmolm^-2s^-1的条件下，于 BG-11培养基中培养，光周期为光照14h:黑暗10h，每天不定期地摇晃。收集 藻细胞，提取RNA和DNA。

2)通过对缺刻缘绿藻转录组高通量数据库的筛选，获得1条contig序列 (Contig16329)，根据这条序列设计基因特异引物Seq1和Seq2，利用Clontech 公司RACE技术，分别进行5′-端和3′-端片段扩增。回收这两片段并克隆到 pMD19-T上，然后转化至大肠杆菌，经蓝白斑筛选与测序后，与原contig序列 拼接并经过重新设计引物进行PCR反应与测序验证，得到Δ9FAD基因cDNA 的全长序列(Seq3)。

3)对获得的Δ9FAD基因cDNA全长序列(Seq3)进行生物信息学分析， 发现其开放阅读框(ORF)为1299bp，根据cDNA全长序列设计四对基因特异 引物Seq4和Seq5、Seq6和Seq7、Seq8和Seq9及Seq10和Seq11，扩增内 含子。回收PCR产物，按上述方法进行测序验证并与原序列拼接，得到Δ9FAD 基因的DNA序列(Seq12)。

4)通过生物信息学分析可知，Δ9FAD基因ORF所编码蛋白序列在其氨基 端存在1个由61个氨基酸组成的叶绿体转运肽。根据pYES2载体和Δ9FAD基 因不含叶绿体转运肽的ORF序列设计引物Seq13和Seq14(含EcoRI/XbaI酶 切位点)进行PCR扩增，TA克隆并经EcoRI/XbaI双酶切后，利用T₄连接酶连 接得到重组载体pY-Δ9FAD。

5)将重组载体pY-Δ9FAD在电穿孔仪中用电击法转化酿酒酵母油酸合成缺 陷型ole1突变株BY4389(His^–、Leu^–及Ura^–缺陷型，便于转基因酵母筛选)， 运用含0.005％亚油酸(LA)的尿嘧啶缺陷合成培养基(SC-U)筛选得到转基 因酵母Y-Δ9FAD。

6)将转基因及转空载质粒的酵母接种于YPD培养基，添加适量LA，在2％ 葡萄糖YPD培养基中28℃培养3d，达到一定生物量后转到不含LA的YPD 培养基中，添加2％的半乳糖25℃条件下低转速诱导3d。收集酵母，冷冻干燥。 直接对酵母利用甲醇-硫酸方法进行脂肪酸甲酯化。

7)利用气质联用(GC-MS)在转缺刻缘绿藻Δ9FAD基因的酵母细胞中 检测到棕榈酸和硬脂酸的去饱和产物——分别为棕榈油酸和油酸，说明ole1 突变的酵母BY4389在转入该基因后，恢复棕榈油酸和油酸的合成能力。从而 证明该基因所编码蛋白具有Δ9FAD的功能。

具体操作如下：

1、材料

1)缺刻缘绿藻(MyrmeciaincisaReisigl)H4301购自Culturecollectionofalgae ofCharlesUniversityofPrague(CAUP)。在温度为25℃、光照强度为115μmol photonsm^-2s^-1、光/暗比为14h/10h的条件下培养，培养基为BG-11。

2)pYES2本实验室保存，油酸合成缺陷型ole1突变株酵母BY4389(His^–、 Leu^–及Ura^–缺陷型)购自日本大阪大学。酵母在YPD培养基，于28℃下以200 转/min(rpm)转速振荡培养。

2、方法

1)取100mg新鲜的藻细胞置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨。

2)TRIzol(Invitrogen公司)法抽提总RNA，-20℃保存备用。取1-5μgRNA 用反转录试剂盒(TaKaRa公司)进行cDNA第一链合成，作为基因克隆的PCR 反应模板。利用植物基因组DNA提取试剂盒(天根公司)提取DNA，作为扩 增内含子的PCR反应模板。

3)根据自缺刻缘绿藻转录组高通量文库中筛选到1条与已知物种Δ9FAD 基因同源的contig序列(Contig16329)设计基因特异性引物(genespecific primers，GSP)Seq1(SEQIDNO.1)和Seq2(SEQIDNO.2)，按照SMART^TMRACEcDNA扩增试剂盒(Clontech公司)的使用说明分别建立5′-RACE和 3′-RACE反转录体系，然后应用降落PCR原理进行扩增。25μL的5′-RACE反 应体系包含：17μL的PCR级水、2.5μL的10×Advantage2PCR缓冲液、0.5μL 的dNTP、0.5μL引物(Seq1)、2.5μL的10×UPM、1.5μL的5′-RACEcDNA、 0.5μL的50×Advantage2聚合酶混合液。3′-端的反应体系，除0.5μL的引物(Seq 2)和1.5μL的3′-RACEcDNA外，其它的同5′-端反应体系。反应程序：94℃ 变性30s，72℃延伸150s，5个循环；94℃变性30s，70℃退火30s，72℃ 延伸150s，5个循环；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸150s，30 个循环；72℃延伸7min。随后，对RACE产物进行电泳(图1)和胶回收， 然后连接到pMD19-T载体(图2)并转化到大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α 感受态细胞，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，经菌落PCR验证后送往上海生 工生物工程公司测序。将测序得到的5’-和3’-RACE片段与已知片段的序列进行 拼接，并重新设计引物及测序验证，得到了Δ9FAD基因的全长cDNA序列(Seq 3，SEQIDNO.3)。

该序列全长2442bp，其中，5’-非翻译区(UTR)和3’-UTR分别为157bp 和986bp，开读阅读框(ORF)长为1299bp，编码432个氨基酸残基(Seq15， SEQIDNO.15)。根据全长cDNA序列设计四对基因特异引物Seq4(SEQID NO.4)和Seq5(SEQIDNO.5)、Seq6(SEQIDNO.6)和Seq7(SEQIDNO.7)、 Seq8(SEQIDNO.8)和Seq9(SEQIDNO.9)及Seq10(SEQIDNO.10)和 Seq11(SEQIDNO.11)，分别进行内含子扩增。反应体系包括：1.0μLDNA模 板，引物各0.5μL，10.5μL的无RNase水，12.5μL2×TaqPCRMasterMix。PCR 反应条件：95℃预变性5min，36个循环包含94℃变性1min、68.5℃退火1 min以及72℃延伸3min；最后72℃延伸10min。PCR产物按上述方法经胶 回收、克隆、蓝白斑筛选、菌落PCR验证和测序，并将测序结果与原ORF区拼 接，得到Δ9FAD基因的DNA序列(Seq12，SEQIDNO.12)。

利用Blastx搜索结果显示缺刻缘绿藻Δ9FAD基因ORF区所编码的蛋白质 与莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)硬脂酰-ACP去饱和酶蛋白具有65％ 的相似度。ChloroP1.1Server预测其N端具有61个氨基酸残基组成的叶绿体转 运肽。在生物体内，转运肽是把胞质中合成的目标蛋白运送到相应细胞器的靶 向蛋白，目标蛋白在进入细胞器时，该转运肽就会被肽酶切除。因此在进行目 的基因的功能鉴定时，应排除转运肽序列。

4)根据pYES2载体和Δ9FAD基因不含叶绿体转运肽的ORF序列(Seq3 的第341bp至第1453bp)设计引物Seq13(SEQIDNO.13，第1bp至2bp为 保护碱基，第3bp至8bp为EcoRI酶切位点)和Seq14(SEQIDNO.14，第1 bp至2bp为保护碱基，第3bp至8bp为XbaI酶切位点)。以缺刻缘绿藻的cDNA 为模板进行PCR扩增。反应体系如下：1.0μLcDNA模板，引物Seq13和Seq14 各0.5μL，10.5μL的无RNase水，12.5μL2×TaqPCRMasterMix。PCR反应条 件：95℃预变性5min，36个循环包含94℃变性1min、68.5℃退火1min 以及72℃延伸90s，最后72℃延伸10min。PCR产物按上述方法经胶回收、 克隆、蓝白斑筛选、菌落PCR验证和测序，以确保目的基因序列的准确性。这 样就获得了pMD19T-Δ9FAD质粒。

5)将携带正确目的基因序列的大肠杆菌进行培养，然后抽提 pMD19T-Δ9FAD质粒，用限制性内切酶EcoRI和XbaI进行双酶切消化反应。同 时对提取的pYES2质粒也进行EcoRI和XbaI双酶切反应。反应体系为2μL的 10×M缓冲液，4μL的0.1％BSA，DNA2μg，EcoRI及XbaI各1μL，加无RNase 水至20μL。37℃消化反应4h。将酶切后的产物进行电泳后割胶回收目的片段， 并用T₄DNA连接酶将酶切后的Δ9FAD基因片段与pYES2片段连接得到重组 载体pY-Δ9FAD。连接反应体系为：2.5μL的连接缓冲液，Δ9FAD基因DNA 约0.3pmol，载体pYES2的DNA约0.03pmol，1μL的T₄DNA连接酶，加无 RNase水至25μL，16℃连接过夜。连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞， 利用含50mg/L氨苄(Amp)的LB培养基筛选，菌落PCR和测序以确保序列 的准确性。从大肠杆菌DH5α中抽提pY-Δ9FAD质粒，-20℃保存备用。

6)酵母感受态细胞制备。将酵母接种于含0.005％LA的YPD培养基中， 28℃复苏培养过夜，然后按1:100放大培养，以250rpm转速振荡培养至细胞 密度约为1×10⁸细胞/mL(约4～5h)。冰上冷却15min使细胞停止生长，4℃条 件下以5000rpm转速离心5min收集酵母细胞，预冷无菌水洗涤细胞2次，同 样条件下离心收集。20mL预冷的1M山梨醇洗涤细胞1次，然后溶于0.5mL 预冷的1M山梨醇，调整细胞的密度在1×10¹⁰细胞/mL。冰上保存细胞(或是 4℃)，便于电击使用。

7)利用电穿孔仪(Bio-Rad)将重组的载体pY-Δ9FAD电击转化酵母BY4389 感受态细胞。取在冰上预冷的待转化的pY-Δ9FAD重组质粒DNA约5～10μL (5～200ng)与感受态细胞混匀，并与0.2cm的电击杯一起冰上预冷，然后将 DNA-细胞混合液转移到预冷的电击杯轻轻混匀，冰浴5min后，选择程序Sc2 电击一次。移走电击杯，立刻加入1mL预冷的1M山梨醇，轻轻转移到新的 YPD培养基中，28℃轻微振荡5h。将菌液涂布于含有0.005％LA及1M山梨 醇的尿嘧啶缺陷合成培养基(SC-U)上，28℃倒置静置培养48-72h，挑取菌 落于含0.005％LA的液体SC-U培养基中培养。菌落PCR验证插入目的片段的 序列后，用含2％葡萄糖或2％棉籽糖的SC-U培养基保存菌种。

10)将保存的菌液接种YPD培养基中，添加适量LA，28℃下以220rpm 转速振荡培养。然后离心收集并洗涤菌体，转移到不含LA的2％半乳糖YPD 培养基中，25℃下以150rpm转速振荡培养72h。离心收集酵母菌体，经去离 子水洗涤3次后液氮冻存。

11)将液氮冻存的酵母冷冻干燥，然后进行脂肪酸甲酯化。称取约25mg 酵母粉末于酯化瓶中，加入1mL含4％硫酸的甲醇溶液。充氮气后，于85℃ 水浴锅酯化反应1h，便于将结合的脂肪酸分子充分解离并甲基化。酯化反应后， 向上述酯化瓶中分别加入1mL去离子水和1mL正己烷，充分混匀，然后在5500 rpm下离心10min。收集上清液至样品瓶中，氮气浓缩，4℃保存备用。

12)采用Angilent7890B型气相色谱仪进行脂肪酸组成分析，色谱柱为HP-88 型毛细管柱(30m×0.25mm)；升温程序为70℃保留1min，然后10℃/min 升温至230℃，最后保留9min；不分流，氮气、氢气、空气的流速分别为25 mL/min、35mL/min、400mL/min。进样量为0.2μL。

13)GC-MS检测新生成的产物。在转基因的酵母中对照脂肪酸标准品及缺 陷型酵母确认有新产物生成时，采用GC-MS检测。GC的色谱柱为HP-INNOWax PolyethyleneGlyco(30m×320μm×0.25μm)连接MS四级杆，150C(最大值 200C)。升温程序50℃保持1min，以10℃/min升到150℃保持1min，然 后再以4℃/min升到230℃保持5min，运行时间37min。氦为载气体，初始 值50℃，压力7.6522psi，流速2.6891mL/min，平均速率59.763cm/s，滞留时 间0.83664min，流速2.6891mL/min，运行时间37min。MS采集参数选用EMV 模式，跟踪检测的离子能为69.922eV。

3、结果

1)利用RACE方法扩增得到缺刻缘绿藻Δ9FAD基因的cDNA全长序列(Seq 3，SEQIDNO.3)。该序列全长2442bp，其中，5’-UTR和3’-UTR分别为157bp 和986bp，ORF长为1299bp，编码432个氨基酸残基(Seq15，SEQIDNO.15)。 以DNA为模板，扩增出了缺刻缘绿藻Δ9FAD基因的DNA序列(Seq12，SEQ IDNO.12)。该序列全长4198bp，存在8个内含子，它们自5’-端开始依次位于 该基因DNA序列的152-578、852-1025、1182-1460、1625-1850、1939-2081、 2178-2350、2503-2659和2823-3029处，从而将该基因的cDNA序列分成8个外 显子，并将5’-UTR分成长分别为151bp和6bp的两段(图1中B)。

2)选用pYES2载体通过限制性内切酶EcoRI和XbaI成功地构建了缺刻缘 绿藻Δ9FAD基因的表达载体pY-Δ9FAD。因Δ9FAD基因序列位于pYES2载体 的GAL1启动子下游，可利用半乳糖诱导基因表达。

3)采用电穿孔仪的电击方法成功地将重组的表达载体pY-Δ9FAD转化到酵 母BY4389中。油酸合成缺陷型ole1突变株酵母BY4389也是His^–、Leu^–、Ura^–营养缺陷型菌株，在转入pY-Δ9FAD质粒后，因pYES2载体携带编码尿嘧啶的 URA3基因，转基因酵母因而能够在尿嘧啶缺陷的合成培养基(SC-U)上生长 以便于筛选。

4)转基因酵母经半乳糖诱导培养后，GC-MS检测酵母甲酯化的脂肪酸。 结果(图4)显示Δ9FAD基因所编码蛋白能在酵母中分别将棕榈酸和硬脂酸 去饱和为棕榈油酸和油酸。质谱(图4中B和C)结果显示，棕榈油酸和油酸 上的不饱和键都位于Δ9碳位置上。表明自缺刻缘绿藻中所克隆到的该基因所 编码的蛋白质具有Δ9脂肪酸去饱和酶的功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些 改进和补充也应视为本发明的保护范围。