新植物鞘氨醇-1-磷酸酯衍生物、其制造方法及包括其的脱毛预防治疗或育毛用组合物

摘要

本发明提供O-环植物鞘氨醇-1-磷酸酯(O-C-P1P)、N-环植物鞘氨醇-1-磷酸酯(N-C-P1P)、药剂学可允许的其盐、或其溶剂化物；其制造方法；及包括其的用于脱毛防止、或育毛的化妆品组合物；以及用于脱毛预防、治疗或育毛的药学组合物。

说明书

技术领域

本发明涉及新的植物鞘氨醇-1-磷酸酯(phytosphingosine-1-phosphate)衍生物、 其制造方法、及包括其的用于脱毛的预防、治疗、或育毛的组合物，更详细地涉及作为 有用于脱毛的预防、治疗、或育毛的新物质的植物鞘氨醇-1-磷酸酯衍生物、其制造方 法、及包括其的用于脱毛的防止或育毛的化妆品组合物、以及用于脱毛的预防、治疗或 育毛的药学组合物。

背景技术

鞘脂(sphingolipid)中的鞘氨醇-1-磷酸酯(sphingosine-1-phosphate)作为生理 活性自分泌(autocrine)分子，通过与G-蛋白质-结合内皮分化基因 (endothelialdifferentiationgene,EDG)受体(receptor)结合，引起强活体反应(非 专利文献1)，在活体内通过鞘氨醇激酶(kinase)产生，通过鞘氨醇裂解酶(lyase)或 鞘氨醇磷酸酶(phosphatase)分解(非专利文献2)。

鞘脂的代谢物质、神经酰胺(Ceramide)和鞘氨醇-1-磷酸酯含量间的动力学平衡和 逆信号过程的调节是决定细胞生与死的重要因素(非专利文献3)。细胞内增加的神经 酰胺在癌细胞中抑制其繁殖，但在炎症细胞中却加剧炎症反应使其恶化，具有两面性。 最近，作为新的鞘脂的功能以下作用被公布：神经酰胺不仅关系到细胞凋亡、细胞增殖 抑制，在神经界还参与神经突起的形成，以及在细胞内的输送中鞘磷脂(sphingomyelin) 的结构非常重要。换句话说，可以认为鞘脂在细胞内膜、外膜上的立体非对称性及水平 结构上的非均匀性对分化、增殖及分泌等多种细胞功能具有影响力。此外，作为新的鞘 脂的功能以下作用被公布，在对抗癌剂具有耐药性的细胞中葡糖神经酰胺(glucosylce ramide)被积累，这种耐药性细胞将细胞凋亡诱导剂(Apoptosisinducer)神经酰胺(C eramide)转换成其他代谢产物糖鞘脂(glycosphingolipid)后加以排除的功能(非专 利文献4)。因此，鞘脂的量的变化影响血液肿瘤或神经类疾病等的病态的可能性较大 (非专利文献5)。

如此，在鞘氨醇(spingosine)代谢中，作为重要中间体的鞘氨醇-1-磷酸酯表现 出多种生理活性，因此，对该物质的生成、代谢、作用、以及合成方法的研究一直比较 集中(非专利文献6)。但是，对具有与鞘氨醇-1-磷酸酯对等的作用的植物鞘氨醇-1- 磷酸酯的研究量一直非常有限，而且所述研究也主要以其在活体内的作用为重点。两个 物质，即公开的鞘氨醇-1-磷酸酯和植物鞘氨醇-1-磷酸酯的制造方法广为人知的有利用 激酶(kinase)的酶(enzyme)合成法和化学合成法。酶合成法(非专利文献7、8、9) 均对最终物质的结构鉴定不足。D-鞘氨醇-1-磷酸酯的化学合成法研究较多，但是，对D -植物鞘氨醇-1-磷酸酯的化学合成法研究非常少，只有3篇论文(非专利文献10、11、1 4)。在这两种合成方法中，依然采用了合成D-鞘氨醇-1-磷酸酯的合成法(非专利文献 12、13)中使用过的方法，关于起始物质用植物鞘氨醇替代鞘氨醇。

基于以下反应式1的的方法作为D-植物鞘氨醇-1-磷酸酯的最初化学合成法被公布 (非专利文献10)。

反应式1

公开了上述合成法全过程的最终产率为43％，以及提供了与最终物质D-植物鞘氨醇- 1-磷酸酯的高性能FAB-MS、¹H-NMR相关的数据。

作为D-植物鞘氨醇-1-磷酸酯的另一个有效化学合成法，公开了基于下列反应式2的 方法(非专利文献14)。

反应式2

所述方法共分6个步骤，公开了全过程的产率为14.2％，并公开了所有中间体的光谱 数据，但是没公开最终目的物质D-植物鞘氨醇-1-磷酸酯的具体光谱数据。

因此，按照上述合成法，D-植物鞘氨醇-1-磷酸酯的产率为43％以下，非常低，可以 认为是合成效率非常低的物质。

植物鞘氨醇-1-磷酸酯因被证明具有与米诺地尔(minoxidil)同等或以上的育毛、 生发功效，植物鞘氨醇-1-磷酸酯衍生物的预防/治疗脱毛、育毛用途登记了专利(专利 文献1)。毛发脱离头皮的脱毛症的起因有多种，大致可分为男性荷尔蒙作用、精神压 力、头皮堆积脂质过氧化物(lipoperoxide)、药物副作用、白血病、结核等慢性疾病、 放射线治疗的副作用、营养不足等。另外，一直被认为是男性问题的脱毛问题，最近女 性群体和年轻群体的脱毛问题越来越突出，防治需求也越来越大。

目前作为毛发生长和育毛的药物主要有：血管扩张剂，其用于向头皮供给足够的血 液；女性荷尔蒙，用于抑制男性荷尔蒙的作用；男性荷尔蒙活性抑制剂，其抑制将睾酮 (testosterone)转换成5-DHT(5-双氢睾酮，5-dihydrotesteone)的5α-还原酶(5-α -reductase)。作为所述血管扩张剂有氯化卡普若尼(caproniumchloride)、米诺地 尔、及各种植物提取物等，作为女性荷尔蒙有雌激素(estrogen)、雌二醇(estradio l)、孕酮(progesterone)等，作为男性荷尔蒙活性抑制剂有非那雄胺(finasteride)、 十五烷酸(pentadecanoicAcid)等。

但是因所述脱毛治疗药物的效果不足或副作用等问题，需要开发更加有效安全的治 疗脱毛或用于育毛的药物。局部用或口服用米诺地尔会引起头皮红斑、炎症、感染、刺 激、或疼痛等皮肤刺激，而且因具有降血压效果，所以问题在于，对正在使用降血压剂 的患者在内的高血压患者要谨慎用药等。此外，非那雄胺因具有男性荷尔蒙活性抑制效 果，因此缺点在于，导致勃起功能障碍、性欲下降等。

所述植物鞘氨醇-1-磷酸酯衍生物因具有促进新的血管生成的效果，被确认为具有 脱毛防治或育毛作用的物质。此外，没有所述现有治疗脱毛药物具有的降压、或性功能 减弱等副作用。

但是，如前述，植物鞘氨醇-1-磷酸酯在合成方面是产率低的物质。因此，需要开 发产率高、又没有所述现有脱毛治疗药物具有的副作用的有效脱毛治疗物质。

【现有技术文献】

【专利文献】

1.韩国登记专利1003532

【非专利文献】

1.Lee,M.J.etal.,Science,279,pp1552-1555,1996

2.Pyne,S.andPyne,N.J.,Biochem.J.,349,pp385-402,2000

3.Cuvillier,O.etal.,Nature,381,pp800-803,1996

4.LavieY.etal.,J.Biol.Chem.,272,pp1682-1687,1997

5.OkazakiT.etal.,Int.J.Hematolo.,65,p40,1997

6.FASEBJ,10:1388-1379

7.Hoppe-Seyler'sZ.Physiol.Chem.,351,635-642,

8.J.Biol.Chem.,273,19437-19442,

9.Biochem.J.,332,525-531

10.J.ofLipidResearch,40,1999,117-125

11.Bull.KoreanChem.Soc.,2003,24,267-268

12.J.ofLipidResearch,35,1994,2305-2311

13.TetrahedronLetters,2000,41,7821-7824

14.Bull.KoreanChem.Soc.,2003,24,267-268

发明内容

本发明人为了解决所述现有脱毛治疗药物具有的问题，研究新的治疗脱毛的活性物 质，结果开发出既对脱毛治疗、育毛有效，而且可以以高产率合成的新的植物鞘氨醇衍 生物，从而完成了本发明。此外，确认到所述开发出的物质除了对脱毛及育毛有效，还 对皱纹改善有效。

因此，本发明的目的在于提供一种新物质，其对脱毛的预防、治疗及育毛有效。

本发明的另一个目的在于提供根据本发明所述的物质的制造方法。

本发明的又另一个目的在于提供一种用于脱毛防止或育毛的化妆品组合物，其包含 所述根据本发明的物质。

本发明的又另一个目的在于提供一种用于脱毛预防、治疗、或育毛的药学组合物， 其包含所述根据本发明的物质。

本发明的又另一个目的在于提供一种用于皱纹的预防、改善或治疗的化妆品组合 物，其包含所述根据本发明的物质。

为了达到所述目的本发明的一侧面提供，下列化学式1a的O-环植物鞘氨醇-1-磷酸 酯(O-C-P1P：O-Cyclicphytosphingosine-1-phosphate)或化学式1b的N-环植物鞘氨醇 -1-磷酸酯(N-C-P1P：N-Cyclicphytosphingosine-1-phosphate)、药剂学(pharmaceu tics)可允许的其盐、或其溶剂化物。

【化学式1a】

【化学式1b】

本发明的另一侧面提供下列化学式1a的化合物的制造方法，所述方法包括将下列化 学式4的化合物和三氟乙酸(trifluoroaceticacid)或浓盐酸反应从而解除保护的步 骤。

【化学式1a】

【化学式4】

所述化学式4中，R¹为保护基。

本发明的另一侧面提供下列化学式1b的化合物的制造方法，所述方法包括将下列化 学式5的化合物与三甲基溴硅烷(bromotrimethylsilane)反应后加水而进行反应的步 骤。

【化学式1b】

【化学式5】

所述化学式5中R²为保护基。

本发明另一侧面提供用于防脱毛或育毛的化妆品组合物，所述组合物包含所述化学 式1a或1b的化合物、药剂学可允许的其盐、或其溶剂化物。

本发明另一侧面提供用于预防、治疗脱毛或育毛的药学组合物，所述组合物包含所 述化学式1a或1b的化合物、药剂学可允许的其盐、或其溶剂化物。

本发明另一侧面提供用于防皱或改善或治疗的化妆品组合物，所述组合物包含所述 化学式1a或1b的化合物、药剂学可允许的其盐、或其溶剂化物。

以下对本发明进行详细说明。

本发明中使用的一切术语除非特别定义，其意义与本发明所属领域内一般技术人员 的理解相同。此外，在本说明书中记载了优选方法或试剂，但是与此类似或同等效力的 也包含于本发明的范围之内。本说明书中以参考文献记载的一切刊物的内容均视为本发 明的参考。

本发明人为了既能提高产率，又能解决所述现有脱毛治疗药物的副作用从而达到无 顾虑地安全用药，对治疗脱毛有效的药物进行研究，最终开发出了现有技术中认为是安 全物质的植物鞘氨醇-1-磷酸酯的新的衍生物，即所述化学式1a及化学式1b的化合物。

本发明一侧面提供下列化学式1a的O-环植物鞘氨醇-1-磷酸酯(O-C-P1P：O-Cyclic phytosphingosine-1-phosphate)或化学式1b的N-环植物鞘氨醇-1-磷酸酯(N-C-P1P：N -Cyclicphytosphingosine-1-phosphate)、药剂学(pharmaceutics)可允许的其盐、 或其溶剂化物。

【化学式1a】

【化学式1b】

所述药剂学可允许的盐能够以所述化学式1a或1b的化合物和游离酸(freeacid) 共同形成盐的酸附加盐(acidadditionsalt)存在。所述化学式1a或1b的化合物能够 根据本领域公知的一般方法生成药剂学可允许的酸附加盐。所述游离酸可以使用有机酸 或无机酸，所述无机酸能够使用盐酸、溴酸、硫酸、或磷酸等，所述有机酸可以是柠檬 酸(citricacid)、乙酸、乳酸、酒石酸(tartariacacid)、马来酸(maleicacid)、 富马酸(fumaricacid)、甲酸(formicacid)、丙酸(propionicacid)、草酸、三氟 乙酸(trifluoroaceticacid)、苯甲酸(benzoicacid)、葡萄糖酸(gluconicacid)、 甲磺酸(methanesulfonicacid)、乙醇酸(glycolicacid)、琥珀酸(succinicac id)、4-甲苯磺酸(Toluenesulfonate)、半乳糖醛酸、恩波酸、谷氨酸(glutamica cid)、或天冬氨酸等。尤其所述化学式1a的化合物能够以盐酸盐形式存在。

所述药剂学可允许的盐能够以所述化学式1a或1b的化合物的无机盐存在。所述化学 式1a或1b的化合物能够用本领域公知的通常的方法生成药剂学可允许的无机盐。所述无 机盐有铝、铵、钙、铜、铁、锂、镁、锰、钾、钠、或锌的盐，但不限于此，优选为铵、 钙、镁、钾或钠盐。

此外，根据本发明的所述化学式1a或1b的化合物不但包括药剂学可允许的盐，还包 括通过一般方法可制造的一切盐、水化物在内的所有溶剂化物。

本发明另一侧面提供下列化学式1a的化合物的制造方法，所述方法包括将下列化学 式4的化合物和三氟乙酸或盐酸气体反应从而解除保护的步骤。

【化学式1a】

【化学式4】

所述化学式4中的R¹为保护基。

所述化学式4中的R¹作为保护基，可以是通常用于保护氨基的任意保护基。例如，叔 丁氧羰基(t-Butyloxycarbonyl，t-Boc)、p-硝基苄氧基羰基(p-Nitrobenzyloxycar bonyl)、p-甲氧基苄氧基羰基(p-methoxybenzyloxycarbonyl)、或烯丙氧基羰基(a llyloxycarbonyl)等，但并不限于此。

就用于将化学式4的化合物与三氟乙酸或盐酸气体反应，从而执行解除保护的反应 的溶剂而言，在不妨碍所述反应的前提下可采用任意的溶剂。与三氟乙酸反应时，优选 采用二氯甲烷(MethyleneChloride)，与HCl气体反应时，优选采用乙酸乙酯(Ethyl Acetate)。所述解除保护反应的具体反应条件根据保护基的种类及反应物虽然可能不 同，当根据一个实施例，与所述三氟乙酸反应时可以在室温下进行，与所述盐酸气体反 应时可以冷却到约0℃后进行反应。

所述化学式4的化合物能够通过下列化学式3的化合物和POCl₃反应来制造。

【化学式3】

所述化学式3中R¹为保护基。

就用于将化学式3的化合物和POCl₃反应，从而执行磷酸化的反应的溶剂而言，在不 妨碍所述反应的前提下可采用任意的溶剂，但优选采用吡啶溶剂。优选地，根据一个实 施例，为了所述反应首先将所述化学式3的化合物溶解于吡啶溶剂中，降温至约-20℃后， 添加吡啶溶剂中的POCl₃溶液而进行反应。反应结束后，利用盐酸等强酸将pH调到约2， 以形成如化学式4的化合物。获得的化学式4的化合物不需要经过特别的提纯过程，能够 用于所述化学式1a的化合物的制造。

所述化学式3的化合物通过在下列化学式2的D-植物鞘氨醇的氨基中导入保护基而 制造。

【化学式2】

就在所述D-植物鞘氨醇的氨基中导入保护基的反应而言，能够采用本技术领域公开 的任意方法，比如按照非专利文献14的方法进行。

作为上述说明的化学式1a的化合物的制造方法的一个实施例，能够用下列反应式3 体现。

【反应式3】

本发明另一侧面提供下列化学式1b的化合物的制造方法，所述方法包括将下列化学 式5化合物和三甲基溴硅烷(bromotrimethylsilane)反应后，加水进行反应的步骤。

【化学式1b】

【化学式5】

所述化学式5中的R²为保护基。

所述化学式5中的R²作为保护基，可以是通常用于保护氨基的任意的保护基，比如叔 丁氧羰基(t-Boc)、p-硝基苄氧基羰基(p-Nitrobenzyloxycarbonyl)、p-甲氧基 苄氧基羰基(p-methoxybenzyloxycarbonyl)、或烯丙氧基羰基(allyloxycarbony l)等，但并不限于此。

就用于实施化学式5的化合物和三甲基溴硅烷反应的溶剂而言，在不妨碍所述反应 的前提下能够采用任意的溶剂，优选二氯甲烷(MethyleneChloride)。所述解除保护反 应的具体反应条件可根据所述保护基的种类不同而不同，但根据一个实施例在溶剂中溶 解所述化学式5的化合物后，冷却至约-20℃后加入三甲基溴硅烷进行反应。然后加水， 在约0℃额外进行反应，由此生成化学式1b的化合物。

所述化学式5的化合物能够通过本技术领域公开的任意方法制造，比如通过非专利 文献14的方法制造。

以上说明的化学式1b的化合物的制造方法的一个实施例可通过下列反应式4表达。

【反应式4】

本发明另一侧面提供用于防脱毛或育毛的化妆品组合物，所述组合物包括所述化学 式1a或化学式1b的化合物、药剂学可允许的其盐、或其溶剂化物。

本发明另一侧面提供用于脱毛预防、治疗或育毛的药学组合物，所述组合物包括所 述化学式1a或化学式1b的化合物、药剂学可允许的其盐、或其溶剂化物。

本发明另一侧面提供用于皱纹预防、改善、或治疗的化妆品组合物，所述组合物包 括所述化学式1a或化学式1b的化合物、药剂学可允许的其盐、或其溶剂化物。

以下将所述化妆品组合物及药学组合物统称为“根据本发明的组合物”。

下列实施例证明了所述化学式1a(O-C-P1P)及化学式1b(N-C-P1P)的化合物对脱毛 治疗、预防、及育毛有效。具体利用C3H鼠对本发明的化合物实施了育毛实验。其结果 是，本发明的化合物相比目前作为脱毛治疗剂获得FDA许可在售中的Minoxil3％(米诺地 尔3％液剂，现代药品)育毛效果更加显著。此外，将本发明的化合物分别按照0.005％-0. 02％浓度对C3H鼠实施育毛实验的结果，相比阴性对照组表现出显著的有效性，浓度的不 同对育毛效果几乎没有差异，与阳性对照组米诺地尔3％相比表现出类似的效果，确认到 相比现有脱毛治疗剂，在低300倍以上的低浓度具有有效的育毛作用。此外，将本发明 的化合物以HCl盐及二钠盐的形态对C3H鼠实施了育毛实验的结果，相比阴性对照组，与 盐的种类无关表现出显著的优秀效果。此外，利用本发明的化合物对秃顶患者实施临床 实验的结果，确认到脱毛预防及生毛效果。由此确认到根据本发明的化合物对脱毛治疗、 预防、及育毛是有效的。

所述根据本发明的用于防脱毛或育毛的化妆品组合物、及用于脱毛防治、治疗、或 育毛的药学组合物，能够包括其他用于脱毛预防、治疗、或育毛的药物或补助剂，从而 作为复合制剂使用。作为其他药物或补助剂有维甲酸(retinoicacid)、米诺地尔(mino xidil)、非那雄胺、锌肽(zincpeptide)、氧化锌(zincoxide)、生物素(Biotin)、 染料木黄酮(genistein)、洋葱提取物、南瓜子油、鸸鹋油(Emuoil)、绿茶提取物、 柳树皮提取物、积雪草(AsiaticPennywort)提取物、荨麻(Nettle)提取物、菖蒲 提取物、迷迭香(Rosemary)提取物、甘菊提取物(Chamomile)等，但不限于此。

所述根据本发明的用于防脱毛或育毛的化妆品组合物，及用于脱毛预防、治疗、或 育毛的药学组合物能够制成包括口服制剂、注射剂、栓剂、皮肤外给药制剂、及鼻腔给 药制剂但不限于此的任意的制剂形态而使用，但是优选制成适合局部头皮或被毛发覆盖 的皮肤使用的制剂。作为这种局部使用制剂有脂质体(liposome)、纳米乳剂(Nano-e mulsion)、洗发液、护发素(HairConditioner)、或护发液(hairlotion)等，但不 限于此。为了增加经皮吸收以促进效果，优选制成脂质体(liposome)、或纳米乳剂(N ano-emulsion)。所述组合物制成制剂时，能够采用化妆品领域或药剂学领域公开的适 合制造各个制剂的载体、稀释剂、或添加剂进行制造。

所述根据本发明的用于防脱毛或育毛的化妆品组合物，及用于脱毛防治或育毛的药 学组合物，相对全部组合物含有所述化学式1a或1b的化合物约0.001重量％至1重量％，优 选含有0.005重量％至0.1重量％，并能够根据活性成分的种类进行增减。将所述根据本发 明的药学组合物局部使用时，将化学式1a的化合物或化学式1b的化合物在需要预防、治 疗脱毛或育毛的部位一天涂抹1至2次。以活性成分为1重量％时为准，一天的涂抹量为0. 5－3mg左右，能够根据涂抹部位的面积进行增减。这样的用药量及次数能够根据患者的 年龄、性别、脱毛严重程度进行适当的增减。

另外，所述化学式1a(O-C-P1P)及化学式1b(N-C-P1P)的化合物对皱纹预防、改善、 或治疗具有效果，在下列实施例中得到证明。具体是，将本发明的化合物以不同浓度处 理后，通过MTT分析(assay)对人成纤维细胞(fibroblast)的增殖效果进行测定，并 测定了成纤维细胞中的胶原蛋白量。其结果是，本发明的化合物的浓度越高成纤维细胞 的生存率越高，胶原蛋白量也越多，被确认具有皱纹预防、改善、及治疗的效果。

所述根据本发明的用于皱纹预防、改善、及治疗的化妆品组合物还能够包含其他用 于皱纹预防、改善、及治疗的物质，作为复合制剂使用。

所述根据本发明的用于皱纹预防、改善、及治疗的化妆品组合物可制成适合局部用 于有皱纹或容易长皱纹的皮肤上的制剂。作为局部用药制剂有脂质体(liposome)或纳 米乳剂(Nano-emulsion)等，但不限于此。所述组合物制成制剂时，能够采用化妆品领 域公开的适合制造各个制剂的载体、稀释剂、或添加剂进行制造。

所述根据本发明的用于皱纹预防、改善、及治疗的化妆品组合物，相对组合物整体 含有所述化学式1a或1b化合物约0.001重量％至1重量％，优选含有0.005重量％至0.1重 量％，能够根据活性成分的种类进行增减。所述根据本发明的药学组合物局部用药时， 将化学式1a的化合物或化学式1b的化合物在需要皱纹预防、改善、治疗的部位一天涂抹 1-2次。以活性成分为1重量％时为准，一天的涂抹量为0.5-3mg左右，能够根据涂抹部位 的面积进行增减。所述用药量及次数可根据使用者的年龄、性别、皱纹的严重程度进行 适当的增减。

如所述说明，根据本发明的所述化学式1a或所述化学式1b的化合物、药剂学允许的 其盐、或其溶剂化物，不但对脱毛的治疗、预防、或育毛，及皱纹预防、改善、或治疗 具有优秀的效果，而且通过合成容易制造从而经济性高，制成脂质微球制剂如脂质体、 纳米乳剂时，容易到达毛囊。此外，相比现有使用的其它脱毛治疗药物米诺地尔、非那 雄胺，对皮肤没有刺激，也没有副作用，因此是非常令人满意的。

附图说明

图1是根据本发明的一个实施例所制造的化学式1a的化合物(O-环植物鞘氨醇-1-磷 酸酯)的¹HNMR光谱。

图2是根据本发明的一个实施例所制造的化学式1b化合物(N-环植物鞘氨醇-1-磷酸 酯)的¹HNMR光谱。

图3是C3H鼠胁腹除毛后，将根据本发明的化合物O-C-P1P、N-C-P1P溶液每天涂抹一 次后，第11天、第14天、及第18天分别与阳性对照组(3％米诺地尔液剂)及阴性对照组 进行比较的照片。

图4是C3H鼠胁腹除毛后，将根据本发明的一个实施例所制造的O-C-P1P脂质体每天 涂抹一次后，第14天、及第18天与阳性对照组及阴性对照组进行比较的照片。

图5是C3H鼠胁腹除毛后，将根据本发明的一个实施例所制造的O-C-P1P溶液按浓度 每天涂抹一次后，第13天、及第17天与阴性对照组进行比较的照片。

图6是C3H鼠胁腹除毛后，将根据本发明的一个实施例所制造的O-C-P1P游离碱(fre ebase)、O-C-P1P的盐酸盐、O-C-P1P的二钠盐溶液每天涂抹一次后，第14天、及第18 天与阴性对照组进行比较的照片。

图7a及图7b是将根据本发明一个实施例所制造的O-C-P1P脂质体，向脱毛患者自愿 者每天涂抹1-2次后，按时间经过拍摄的头部照片。

图8是将根据本发明的一个实施例所制造的0.002重量％(A组)、0.01重量％(B组)、 0.05重量％(C组)的O-C-P1P脂质体，向脱毛患者自愿者以双盲测验法进行临床实验后， 按浓度组拍摄涂抹前和16周后的头部的照片。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行更为详细的说明。但这些实施例仅是为了举例说明本 发明，本发明的范围并不限于这些实施例。

实施例1：N-Boc-D-植物鞘氨醇的制造

根据Bull.KoreanChem.Soc.,2003,24,267-268的方法将D-植物鞘氨醇在t-丁 醇(butanol)中与(Boc)₂O进行反应，从而向氨(amino)基导入保护基(Boc)，由此制 造了N-Boc-D-植物鞘氨醇。

实施例2：N-Boc-D-植物鞘氨醇-3-O、P-环磷酸酯(cyclophosphate)的制造

将1.05当量的POCl₃慢慢加入到约冷却至-30℃的吡啶(pyridine)溶剂(总体积的1/ 3)中，制造POCl₃/吡啶溶液。将在所述实施例1中制造的N-Boc-D-植物鞘氨醇(1当量) 在吡啶溶剂(总体积的2/3)中溶解后，冷却至-20℃后维持该温度的同时，加入之前制 造的POCl₃/吡啶溶液。反应温度上升至常温后，在减压状态下除去溶剂吡啶，用6NHCl 将pH调整到2之后，利用乙酸乙酯(EthylAcetate)提取。之后将乙酸乙酯提取物用M gSO₄除去水分后，在减压状态下浓缩溶剂，从而定量地得到需要的物质N-Boc-D-植物鞘 氨醇-3-O、P-环磷酸酯(cyclophosphate)。未经任何额外的提纯过程，用作下列实施 例3及4的起始物质。

实施例3：O-环植物鞘氨醇-1-磷酸酯(化学式1a)的制造(1)

将在所述实施例2中制造的N-Boc-D-植物鞘氨醇-3-O、P-环磷酸酯(cyclophosphat e)在CH₂Cl₂中溶解后，在常温下加入使用了的CH₂Cl₂溶剂总体积1/3的三氟乙酸(trif luoroaceticacid)后常温下搅拌1小时。然后，在减压状态下去除溶剂后，过滤获取 加入浓(Conc)-HCl溶剂并强力搅拌生成的白色固体，水洗后再用丙酮(acetone)洗 涤并干燥获得盐酸盐形式的最终物质O-环植物鞘氨醇-1-磷酸酯(O-C-P1P)(总产率：9 0％)。

实施例4：O-环植物鞘氨醇-1-磷酸酯(化学式1a)的制造(2)

将所述实施例2中制造的N-Boc-D-植物鞘氨醇-3-O、P-环磷酸酯溶解在乙酸乙酯溶 剂后，冷却至0℃注入HCl气体1小时。将生成的白色固体过滤后，用乙酸乙酯清洗后干 燥获得盐酸盐形式的最终物质O-环植物鞘氨醇-1-磷酸酯(O-C-P1P)(总产率：93％)

图1是最终获得物质的¹HNMR(300MHz,CD₃OD:CD₃COOD＝1:1)数据。

将获得的盐酸盐用相同当量的KOH乙醇(ethanol)溶液处理，获得去除盐酸盐后的 O-环植物鞘氨醇-1-磷酸酯。

此外，将所述获得的O-环植物鞘氨醇-1-磷酸酯用3当量的NaOH水溶液处理，从而制 造了O-环植物鞘氨醇-1-磷酸酯二钠盐。

实施例5：N-环植物鞘氨醇-1-磷酸酯(化学式1b)的制造

根据Bull.KoreanChem.Soc.,2003,24,267-268记载的方法制造N-Boc-D-植物 鞘氨醇-1-磷酸二甲酯。将制造的N-Boc-D-植物鞘氨醇-1-磷酸二甲酯溶解于CH₂Cl₂后冷 却至-20℃后，注入5当量的溴化二甲基硅烷(bromodimethylsilane)搅拌约1小时。然 后在加水加热浓缩获得的残留物中加入丙酮生成白色固体，过滤后获得标题中的化合物 (N-C-P1P)(总产率：13％)

图2是最终获得的物质的¹HNMR(300MHz,CD₃OD:CD₃COOD＝1:1)数据。

实施例6：含有O-C-P1P的脂质体的制造

首先将75％大豆卵磷脂(phosphatidylcholine)(Lipoid公司)1g和所述实施例4 中获得的O-C-P1P0.01g、维他命E醋酸酯(Acetate)0.3g在乙醇20g和乙氧基二甘醇 (ethoxydiglycol)2g的混合液中溶解制造O-C-P1P乙醇溶液。为了溶解进行了5分钟的 超音波处理。然后向所述O-C-P1P乙醇溶液中慢慢添加在蒸馏水71.59g中溶解了薄荷醇 (menthol)0.5g、烟酰胺(niacinamide)0.5g、天然有机硫磺3g、及橙皮苷(Hespe ridin)0.1g的水溶液。添加时强力搅拌。蒸馏水全部添加完了后继续搅拌30分钟。然 后用水浴(bath)型超声波破碎仪(SONICATOR)进行30分钟的超音波处理，使粒子大 小达到100nm左右，制造了含有O-C-P1P的脂质体。

另外，按所述制造法制造脂质体时，作为皮肤透过促进剂添加泊洛沙姆(poloxame r)+聚山梨酯(polysorbate)80(Tween80)，制造出促进透过皮肤的脂质体。

实施例7：含有O-C-P1P的脂质体的制造(2)

在所述实施例6中制造水溶液时，除了追加加入柳树皮提取物1g、绿茶提取物1g、 积雪草提取物3g、荨麻提取物0.5g、菖蒲提取物0.5g、迭迷香提取物0.5g、甘菊(Cham omile)提取物0.5g、及大豆发酵物1g制造水溶液以外，用与所述实施例6相同的方法制 造了含有O-C-P1P的脂质体。只是，减少了相应于各种提取物添加量的蒸馏水量制造了 脂质体。

实施例8：含有N-C-P1P的脂质体的制造(1)

除了用所述实施例5中制造的N-C-P1P将所述实施例6中的O-C-P1P替代以外，用与所 述实施例6相同的方法制造了含有N-C-P1P0.01％的脂质体。

实施例9：含有N-C-P1P的脂质体的制造(2)

除了用所述实施例5中制造的N-C-P1P替代所述实施例7中的O-C-P1P以外，用与所述 实施例7相同的方法制造含有N-C-P1P0.01％的脂质体。

所述实施例6-9制造的脂质体的构成如下表1。

【表1】

实验例1：利用C3H鼠的育毛实验(1)

购买6周龄的C3H鼠，除去部分背部毛后涂抹除毛膏将既有的毛完全去除干净。未 能完全去毛的鼠没有纳入实验，除毛后随机组合每个笼子里饲养5只鼠，共利用了5笼。

除毛后放置1天后，作为试验化合物将在所述实施例4中合成的O-C-P1P和实施例 5中合成的N-C-P1P，在乙醇和乙氧基二甘醇的混合液(9:1，v/v)中以0.01重量％浓度 溶解后，在去毛部位每天涂抹一次。将未使用所述试验化合物、仅涂抹乙醇和乙氧基二 甘醇混合液的组作为阴性对照组，将3％米诺地尔制剂(minoxidil)(Minoxil，现代药 品)作为阳性对照组使用。图3是涂抹药剂后第14天和第18天的除毛部位照片。

根据图3的结果能够知道，未经处理的组(阴性对照组)基本没长出毛，裸露着皮 肤，相反O-C-P1P处理组、N-C-P1P处理组的毛发生长非常快。能够观察到O-C-P1P相 比阳性对照组育毛效果更快，而N-C-P1P组虽然相比阳性对照组效果有些不佳，但相比 阴性对照组具有显著的育毛效果。从这些结果能够明确，根据本发明的化合物促进育毛。

实验例2：利用C3H鼠的育毛实验(2)

将所述实施例6及7中制造的含有O-C-P1P的脂质体，按所述实验例1相同的方法 实施育毛实验。但是，每天涂抹1次持续3周后，拍摄除毛部位的照片。其结果如图4。

根据图4，O-C-P1P脂质体处理组相比阴性对照组表现出显著的育毛效果，其具有 与阳性对照组类似的育毛效果。

实验例3：O-C-P1P不同浓度的育毛实验(3)

将所述实施例4中制造的O-C-P1P按照0.005重量％、0.01重量％、0.02重量％三种 浓度在乙醇和乙氧基二甘醇的混合液(9:1、v/v)中溶解制成试料。将该试料按所述实 验例1相同的方法实施了育毛实验。

图5是涂抹试料后第13天和第17天的除毛部位照片。

根据图5的结果，在0.005-0.02重量％浓度相比阴性对照组具有明显优秀的育毛效 果，但是0.005重量％、0.01重量％、0.02重量％三种浓度间的育毛效果差异不大。与3 重量％3％米诺地尔制剂投药组具有类似的效果，因此可以知道O-C-P1P在低于米诺地尔 低300倍以上的浓度也具有相同的育毛效果。

实验例4：O-C-P1P不同种类盐的育毛试验

对所述实施例4中合成的O-C-P1P盐酸盐、实施例4中制造的O-C-P1P、实施例4 中制造的O-C-P1P二钠盐，按所述实验例1相同的方法实施了育毛试验。

图6是涂抹试料后第14天和第18天的除毛部位的照片。

根据图6的结果知道，与盐的种类无关，相比阴性对照组表现出显著的育毛效果。

实验例5：生发功效临床实验(1)

将所述实施例7中制造的O-C-P1P脂质体向脱毛患者自愿者直接用药，进行了生发 功效比较。向两名自愿者每天涂抹1-2次，每次喷5-7次后涂抹为脂质体溶液不往下流 的状态后使他们用手揉一揉。

图7a及图7b是涂抹试料之前和随时间经过拍摄的头部照片。

根据图7a及7b的结果能够知道，相比涂抹之前随着时间的经过具有优秀的预防脱 毛、生发效果。从而确认到，直接用于人体时具有优秀的预防脱毛及生发效果。

实验例6：生发功能临床试验(2)

按照所述实施例7中的记载，制造0.002重量％(A组)、0.01重量％(B组)、0.05重 量％(C组)的O-C-P1P脂质体，直接向作为自愿者的脱发患者用药，从而进行了生发功能 比较。用双盲测验法，在实验对象和实验人员均不知浓度的情况下实施了实验。

涂抹后观察4周、8周、12周、16周期间的头发的密度和厚度变化，对不同浓度的 O-C-P1P临床效果进行了评估。表2、表3是各浓度的头发密度变化和厚度变化的观察 结果。评估标准如下(单位：头皮密度和厚度的评估单位，0：没变化；1：能够看出好 转；2：微弱好转；3：好转；4：相当好转；5：好转非常明显)。图8是将涂抹前和16 周后的头部照片，按不同浓度分组比较的结果。

【表2】16周期间的头发密度变化。

平均 0周 8周 12周 16周 A组 0 0.17 1.08 1.92* B组 0 0.22 2.00* 2.78* C组 0 1.11 1.78* 2.78*

*表示结果具有统计意义(statisticalsignification)

【表3】16周期间的头发厚度变化

平均 0周 8周 12周 16周 A组 0 0.00 0.17 0.42 B组 0 0.11 0.78 1.33* C组 0 0.11 0.78 1.56*

*表示结果具有统计意义(statisticalsignification)

根据所述表2及3显示，能够观察到B组和C组的12周和16周具有统计意义的头 发密度及厚度的变化。此外，根据图8能够确认相比涂抹前涂抹后头发的密度增加了。

实验例7：促进细胞增殖及胶原蛋白的合成

为了测定N-C-P1P及O-C-P1P的皱纹改善效果，通过MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2- 基)-2，5-二苯基四唑鎓溴盐， 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)分析(assay)测 定了人成纤维细胞(humanfibroblast)的增殖效果，为了观察胶原蛋白的合成，测定了 在人成纤维细胞(真皮细胞)生成的原骨胶原类型I(procollagentypeI)。

为了测定细胞增殖，将人成纤维细胞在添加了10％FBS和100单位(unit)/mL的 盘尼西林/链霉素的DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基，Dulbecco'smodifiedeagle medium)培养基中培养24小时，培养环境为37℃恒温下5％CO₂培养器中进行培养。之后， 去除培养基，添加不同浓度的N-C-P1P和O-C-P1P进行培养后，通过MTT分析测定细胞增 殖效果的结果如表4。

【表4】N-C-P1P及O-C-P1P的细胞增殖效果

为了测定胶原蛋白的合成，将人成纤维细胞(真皮细胞)按照上述条件培养24小 时后，去除培养基后用新的无血清(serumfree)培养基分阶段注入稀释的N-C-P1P和 O-C-P1P(1uM及10uM)后，再培养24小时后，通过原骨胶原类型I(procollagentype I)C-肽EIA试剂盒(kit)测定培养液的胶原蛋白的量，结果如表5。

【表5】N-C-P1P及O-C-P1P的胶原蛋白合成比较

根据表4及表5的结果，N-C-P1P及O-C-P1P显示出不但能够促进细胞增殖，还能 促进胶原蛋白的合成。因此，确认N-C-P1P及O-C-P1P能够适用于促进人成纤维细胞的 增殖和胶原蛋白合成的改善皱纹、及老化产品。