一种用于检测转重组人乳铁蛋白水稻品系G281的侧翼序列及其特异性鉴定方法

摘要

本发明公开了一种用于检测转重组人乳铁蛋白水稻品系G281的侧翼序列及特异性鉴定方法；本发明首次克隆了转重组人乳铁蛋白品系G281外源基因插入片段的旁侧序列，并明确了转基因水稻品系G281的外源插入片段及其旁侧序列可以作为目的DNA扩增片段，建立灵敏的转基因水稻品系G281的特异性PCR检测。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种转重组人乳铁蛋白水稻品系G281的鉴定方法，特别涉及一种用 于检测转重组人乳铁蛋白水稻品系G281的侧翼序列及其特异性鉴定方法。

(二)背景技术

随着生物技术的发展，植物成为了一种有效的重组蛋白表达系统，在植物中大量 生产重组蛋白具有容易推广、生产成本低等优点。近年来已经有多种重组蛋白在植物 中成功表达并商业化生产。因为种子中蛋白表达量高、易储存和易纯化等特点，植物 种子被认为是表达重组蛋白的理想场所，目前已有多种重组蛋白在水稻种子中大量表 达，如人血清白蛋白、人乳铁蛋白和溶菌酶等。

人乳铁蛋白是母乳中的主要蛋白质，具有众多的生理功能，对人安全无不良影响， 可以广泛应用于营养保健、预防医疗等多个领域。但是人乳铁蛋白主要来源于母乳， 在人初乳里含量大概是6g/L，正常乳汁里含量更低1-2g/L，牛奶里含量更低平均只有 150mg/L，大量提取纯化乳铁蛋白成本高，产量低，因此通过转基因方法生产有生物 活性的人乳铁蛋白具有重要的社会和经济效益。转基因水稻G281是在种子中高表达 重组人乳铁蛋白的优良转化品系，G281种子中人乳铁蛋白含量占干重的0.4％，表达 量甚至高于正常乳汁中的人乳铁蛋白含量。因此，种植G281可以大幅度降低乳铁蛋 白生产成本，提高乳铁蛋白产量，大幅度提高水稻生产的附加值。

水稻是重要的粮食作物之一，转基因产品存在生态风险和食品安全等一系列问 题，因此世界各国制定了严格的安全管理法律法规。对转基因植物进行特异性的检测 有助于对转基因植物进行监督管理，也有利于对转基因品系的保护。转基因植物的外 源插入片段的旁侧序列是每个转基因植物品系所具有的特异性分子特征，因此，外源 插入片段的旁侧序列是转基因品系的特异性检测主要目标。本发明首次公开了重组人 乳铁蛋白转基因水稻G281的侧翼序列，并以该序列为检测目标，建立G281特异性 鉴定方法。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测水稻是否为转人乳铁蛋白水稻品系 G281的侧翼序列及特异性鉴定方法。

首先，本发明提供一种用于检测转重组人乳铁蛋白水稻品系G281的外源插入基 因的侧翼序列，所述侧翼序列为外源插入基因3’端侧翼序列，核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明提供了上述侧翼序列的制备方法，提取转重组人乳铁蛋白水稻品系G281 的基因组，通过TAIL-PCR扩增获得PCR条带，PCR产物测序结果显示该片段核苷 酸序列如SEQIDNO.1所示，其中1-68bp是外源插入基因序列，69-612bp为水稻基 因组序列，说明该序列是外源基因插入造成的。

其次，本发明提供能够特异性检测样品中是否含有重组人乳铁蛋白转化事件 G281存在基因的方法，即所述侧翼序列检测转重组人乳铁蛋白水稻品系G281外源插 入基因的特异性鉴定方法：根据SEQIDNO.1中1-68位碱基间的序列设计特异性检 测正向引物G281L-F，根据SEQIDNO.1中69-612位碱基间的序列设计反向引物 RG-R，以待检测样品基因组DNA为模板进行PCR反应，若PCR产物含有特异性条 带，当获得660bp的PCR扩增产物时，说明样品为含有重组人乳铁蛋白水稻品系G281；

正向引物序列为：G281L-F:5’-CTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCC；

反向引物序列为：RG-R:5’-GAGTTGACAGAAAGCTCGGGCTCATG。

PCR反应体系为：

试剂 体积 水稻基因组DNA 1μl G281L-F(10μM) 2μl RG-R(10μM) 2μl 2*Easy Taq PCR SuperMix 25μl ddH₂O 20μl 总体积 50μl

PCR条件是：30个循环，每个循环是94℃，45秒；65℃，40秒；72℃，30秒。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明首次克隆人乳铁蛋白转基 因水稻品系G281的外源基因插入片段的侧翼序列，并明确了该侧翼序列可以作为目 的DNA扩增片段，建立特异性检测转基因水稻品系G281的PCR检测方法。

(四)附图说明

图1：实施例2中G281特异性PCR检测电泳图；CK：阴性对照；G281：G2 81转基因植株不同株系；M：是DNA大小标准样品。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：

实施例1：转基因水稻品系G281的外源插入基因旁侧序列的克隆

称取0.1gG281水稻叶片，采用TaKaRa植物DNA提取试剂盒(TaKaRaCode: D9194)，根据试剂盒操作说明提取G281基因组DNA。使用Liu等报道的TAIL-PCR (ThermalasymmetricinterlacedPCR)方法(Liu，PlantJournal1995，8(3):457-463) 对优良转化事件G281外源转基因DNA插入点左侧的区域序列进行测定。根据T-DNA 左边界区域设计三个巢式特异性PCR引物LB-SP1、LB-SP2、LB-SP4，依次与简并 引物AD4L组进行PCR扩增，引物序列见表1，PCR反应条件见表2。

表1.TAIL-PCR引物序列

引物 序列 LB-SP1 TTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCC LB-SP2 CTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAG LB-SP4 CTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCC AD4L AGGTTATGCTANTCAGSTWTSGWGWT

表2.TAIL-PCR反应条件

PCR反应体系：

试剂 体积 模板DNA 1μl 正向引物(10μM) 2μl 反向引物(10μM) 2μl 2*Easy Taq PCR SuperMix 25μl ddH₂O 20μl 总体积 50μl

第一轮反应：以LB-SP1与AD4L为引物，G281基因组为模板；

第二轮反应：以LB-SP2与AD4L为引物，第一轮产物为模板；

第三轮反应：以LB-SP3与AD4L为引物，第二轮产物为模板。

采用Axygen公司的PCR产物回收试剂盒回收第3轮PCR扩增产物，连接到 PMD20-T克隆载体上(TaKaRa,Code:D107A)，转化大肠杆菌，将得到的阳性克隆经 上海博尚测序公司进行测序。获得的序列信息与网上数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对分析，检索相似的水稻基因组序列。

序列测序分析结果表明，扩增片段长度为680pb，核苷酸序列如SEQIDNO.1， 核苷酸1-68bp之间的序列对应于外源DNA，核苷酸69-612bp水稻基因组DNA。

实施例2：外源基因特异性检测

根据实施例1获得的转人乳铁蛋白水稻品系G281的外源插入片段的侧翼序列设 计用于特异性引物检测待测水稻是否为转基因品系G281。根据SEQIDNO.1中第1-68 位碱基处设计正向引物G281L-F，根据第69-612位碱基处设计反向引物RG-R，引物 序列如下表所示：

引物 序列(5’-3’) G281L-F CTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCC RG-R GAGTTGACAGAAAGCTCGGGCTCATG

PCR反应体系：

试剂 体积 水稻基因组DNA 1μl G281L-F(10μM) 2μl RG-R(10μM) 2μl 2*Easy Taq PCR SuperMix 25μl ddH₂O 20μl 总体积 50μl

PCR条件是：30个循环，每个循环是94℃，45秒；65℃，40秒；72℃，30秒。 PCR的条件可以根据使用的酶和反应体系进行调整。以G281转基因水稻基因组为 PCR模板，常规水稻基因组为对照，对获得PCR产物进行琼脂糖电泳分析。结果显 示，以G281为模板时，PCR产生特异性条带，条带大小约660bp，阴性对照没有特 异性条带产生，如图1。将PCR产物割胶回收，进行序列测定，测序结果与SEQIDNO.1 的序列一致。说明该方法可以特异性检测G281。