使用源自Idiomarina loihiensis的苯丙氨酸解氨酶从肉桂酸衍生物生产光学活性苯丙氨酸化合物的方法

摘要

本发明涉及使用源自Idiomarina？loihiensis的苯丙氨酸解氨酶从肉桂酸衍生物生产光学活性苯丙氨酸化合物的方法。本发明涉及制备对映异构体富集的苯丙氨酸化合物的工艺，所述工艺通过在存在立体选择性苯丙氨酸解氨酶时用相应的肉桂酸与氨基供体反应来实现，所述苯丙氨酸解氨酶与SEQ？ID？NO.4(来自Idiomarina？loihiensis的PAL的氨基酸序列)具有至少50％的序列同一性。

说明书

本申请是申请号为200780033815.8的中国专利申请的分案申请，原申 请是国际申请PCT/EP2007/007945的中国国家阶段申请。

技术领域

本发明涉及制备对映异构体富集的(enantiomericallyenriched)苯丙 氨酸化合物的方法，其中使相应的肉桂酸在存在立体选择性苯丙氨酸解氨 酶时与氨基供体反应。

背景技术

对映异构体富集的苯丙氨酸化合物是例如药物制品的重要中间体，尤 其是在对血管紧张素I转化酶抑制剂(ACE)的制备中，ACE被用于治疗高 血压(highbloodpressure，也作hypertension)。例如，光学活性的(S)-吲 哚啉-2-羧酸((S)-indoline-2-carboxylicacid)(可通过(S)-2-氯苯丙氨酸闭环制 备)可用于制备[2S-[1[R*(R*),2a,3ab,7ab]]-1-[2-[[1-(乙氧羰基)丁基]氨基]- 1-氧代丙基]八氢-1H-吲哚-2-羧酸，后者也作为商品名培哚普利(Perindopril) 已知，其可用作抗高血压药(ACE抑制剂)或强心药(cardiotonic)活性成 分。其它有用的应用为例如喷托普利(Pentopril)和吲哚普利(Indolapril)。

从WO2006/069799A1可获知制备对映异构体富集的苯丙氨酸化合物 的工艺，其中在一个特定的实施例中，通过在存在来自R.glutinis的苯丙 氨酸氨裂解酶(PAL)时将3-(2-氯-苯基)丙烯酸与水性NH₃反应，来制备(S)- 2-氨基-3-(2-氯-苯基)-丙酸。来自Rhodotorulaglutinis的氨基酸序列可见 WO01/11071A2和本文的SEQIDNO.9。

WO2006/069799A1中所述工艺的缺点是发生底物抑制。因此，该工 艺需要在低浓度下运行。因此为了生产可接受量的产物，需要大体积或复 杂的补料方案，使得从商业观点来看该工艺较不吸引人。

因此，提供下述工艺是本发明的一个目的，所述工艺用于制备苯丙氨 酸化合物，其中底物抑制被降低。

发明内容

该目的已通过工艺方法达成，所述工艺用于制备对映异构体富集的苯 丙氨酸化合物，其使相应的肉桂酸在存在立体选择性苯丙氨酸解氨酶时与 氨基供体反应，所述苯丙氨酸解氨酶与SEQIDNO.4具有至少50％的序 列同一性。

因此，本发明的工艺提供了用于制备苯丙氨酸化合物的改进的和/或有 商业吸引力的工艺。通过使用与SEQIDNO.4具有至少50％的序列同一 性的PAL，底物抑制得以降低(即随着底物浓度的提高，酶最初活性的降 低)。另外，在E.coli中容易地过表达了与SEQIDNO.4具有至少50％ 同一性的苯丙氨酸解氨酶(PAL)。与SEQIDNO.4具有至少50％同一性的 PAL与来自R.glutinis的PAL相比的另一优点是它们具有更高的活性。

在使用CloneManager6(6.00版/alignPlus4,4.10版(Scientific& EducationalSoftware))的序列比对研究中，使用BLOSUM62作为评分矩阵 来测定本文定义的％同一性。

优选地，在本发明的工艺中，使用的PAL与SEQIDNO.4具有至少 50％，更优选地至少53％，更优选地至少55％，更优选地至少57％，进一 步更优选地至少60％，进一步更优选地至少62％，进一步更优选地至少 65％，进一步更优选地至少70％，尤其是至少75％，更尤其是至少80％， 更尤其是至少85％，更尤其是至少90％，进一步更尤其是至少95％，进一 步更尤其是至少97％，进一步更尤其是至少98％，进一步更尤其是至少 99％，最尤其是100％的序列同一性。

本发明工艺中可使用的PAL序列可由本领域技术人员容易地鉴定，例 如在数据库(例如NCBI数据库)中使用BLAST搜索。编码这些PAL序 列的核酸序列可容易地被鉴定，例如使用可通过NCBI的BLAST获得的 程序来进行。或者，也可以按照针对期望的宿主细胞来说优选或优化的密 码子选择，例如由商业公司如GenScript或DNA2.0，从氨基酸序列开始 合成核酸序列。编码本发明工艺中使用的PAL酶的氨基酸序列的核酸序列 可以被克隆在合适的载体中，在引入合适的宿主后，可根据本领域技术人 员已知的标准克隆和表达技术(例如如Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,and Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd,ed.,ColdSpring HarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor, NY,1989中所述)，来(过)表达该序列，产生与SEQIDNO.4具有至 少50％序列同一性的PAL酶。

在本发明的范围内，PAL(苯丙氨酸解氨酶)被定义为具有苯丙氨酸 解氨酶活性(即催化肉桂酸到苯丙氨酸的可逆非还原性氨基化的能力)的 酶。HAL(组氨酸解氨酶)被定义为具有组氨酸解氨酶活性(即催化尿刊 酸到组氨酸的可逆非还原性氨基化的能力)的酶。

优选地，在本发明的工艺中生产的苯丙氨酸化合物是式(1)的化合物或 其盐，

其中Y表示羟基、具有1-10个碳原子的取代的或非取代的烷氧基、 取代的或非取代的芳氧基、或胺基或胺残基-NHR(其中R为包含1-10个 碳原子和任选地一个或多个杂原子的烷芳基(akaryl)、烷基、芳烷基、芳 基)，且其中Z代表芳基上的一个或多个取代基，其选自氢、羟基、具有 1-10个碳原子的任选含有一个或多个杂原子的任选被取代的环状或非环状 脂肪基、具有1-10个碳原子的任选被取代的脂肪族杂环基、任选被取代的 (杂)芳基、具有1-10个碳原子的任选被取代的烷氧基、卤素原子、胺基、 硝基、羧酸、羧酸酯、羧酸酰胺、腈或三氟甲基。在Z是环状或非环状的 脂肪基、脂肪族杂环基、(杂)芳基或烷氧基的情况下，任选的取代为， 在Y是烷氧基或芳氧基的情况下，任选的取代可例如选自三卤化物，例如 三氟甲基、三氯甲基；卤素原子，例如氟化物、氯化物或碘化物；胺基， 例如甲胺、二甲胺、苄胺、乙胺、丙胺、苯胺、4-氟苯胺；烷氧基或芳氧 基，例如甲氧基、乙氧基、异丙氧基、苄氧基、苯氧基、4-氟苯氧基、3- 氟苯氧基、2-氟苯氧基；硫醚，例如甲基硫醚、乙基硫醚、苄基硫醚；三 卤素烷基醚(trihaloalkylether)，例如三氟甲基醚；芳基或杂芳基，例如苯 基、4-氟苯基、3-氟苯基、2-氟苯基、2-三氟甲基苯基、3-三氟甲基苯基、 4-三氟甲基苯基、噻吩、呋喃、吡唑、吡咯(pyrole)、咪唑等等。优选的 是其中Z为氢、卤素原子、三氟甲基、羟基、甲氧基或腈且Y为羟基的化 合物。

更优选地，在本发明的工艺中生产的苯丙氨酸化合物是式(2)的化合物 或其盐，

其中Y如上文针对式(1)所定义，且其中Z如上文针对式(1)所定义， 且其中X代表离去基团，例如选自氟化物、溴化物、氯化物或碘化物、甲 磺酸基(mesylategroup)、间硝基苯磺酸基(nosylategroup)、甲苯磺酸基 (tosylategroup)、三氟甲磺酸、硼酸、硝基等等的组的离去基团。。

在本发明的上下文中，术语“离去基团”表示在制备下述化合物的工 艺中适合用作离去基团的基团，所述化合物为对映异构体富集的任选被取 代的根据式(3)的吲哚啉-2-羧酸或其盐，

其中Y和Z如上文定义，其中在低于约140℃的温度下对对映异构体 富集的手性邻位-X-取代的根据式(2)的苯丙氨酸化合物进行环化，形成对 映异构体富集的根据式(3)的吲哚啉-2-羧酸化合物。可存在于式(3)中Y或 Z中的任何取代基如下文定义。该环化反应已在WO2006/069799A1中公 开，其通过参考并入本文。

根据式(1)、(2)和(3)的化合物的盐的合适例子为例如其HCl盐、HBr 盐、铵盐、乙酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、马来酸盐、酒 石酸盐、柠檬酸盐或葡糖酸盐。

当式(1)、(2)和(3)中的Z为含有一个或多个杂原子的具有1-10个碳原 子的取代的环状或非环状脂肪基、具有1-10个碳原子的取代的脂肪族杂环 基、取代的(杂)芳基、具有1-10个碳原子的取代的烷氧基时，这些杂原 子通常各自独立地选自P、N、O和S的组。当Y含有一个或多个杂原子 时，这些杂原子也通常各自独立地选自P、N、O和S的组。

优选地，在上式(e)中，Y代表OH或OR¹，其中R¹代表通常具有1-10 个碳原子的烷基，优选地为具有1-6个碳原子的烷基，最优选地Y代表 OH。优选地，Z代表H或卤素，例如氟化物、氯化物、溴化物或碘化 物，最优选地Z代表H。优选地，式(2)中的X代表氟化物、溴化物、氯化 物或碘，最优选地代表氯化物或溴化物。由于其低成本和/或从环境的角度 来看，氯化物是最优选的。

苯丙氨酸化合物的合适例子是例如2-溴-苯丙氨酸、2-氯苯丙氨酸、2- 碘-苯丙氨酸、2-溴-苯丙氨酸甲酯、2-氯苯丙氨酸甲酯、2-碘-苯丙氨酸甲 酯、2-溴苯丙氨酸乙酯、2-氯苯丙氨酸乙酯、2-碘-苯丙氨酸乙酯、2-溴苯 丙氨酸苄酯、2-氯苯丙氨酸苄酯、2-碘-苯丙氨酸苄酯、2-溴苯丙氨酸酰 胺、2-氯苯丙氨酸酰胺、2-碘-苯丙氨酸酰胺等等。优选的是2-溴苯丙氨 酸、2-氯苯丙氨酸、2-溴苯丙氨酸苄酯和2-氯苯丙氨酸苄酯。更优选的是 2-溴苯丙氨酸和2-氯苯丙氨酸。进一步更优选的是各自苯丙氨酸化合物例 子的(S)-对映异构体。最优选的是(S)-2-氯苯丙氨酸和(S)-2-溴苯丙氨酸。

本文中定义的“对映异构体富集的”等价于术语“光学活性的”，并 表示化合物的对映异构体之一与另一对映异构体相比过量存在。该过量在 下文中会被称作“对映异构体过量”或e.e.(例如通过手性GLC或HPLC 分析测定的)。对映异构体过量e.e.等于对映异构体数量之间的差除以对 映异构体的总量，所述商可在乘以100以后被表述为百分数。

在本发明的工艺中，苯丙氨酸化合物的光学纯度优选地为至少约 50％，更优选地至少约75％，进一步更优选地至少约90％，尤其是至少约 95％，最尤其是至少约98％。

式(1)或(2)的苯丙氨酸化合物的盐的合适例子为例如其HCl盐、HBr 盐、铵盐、乙酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、马来酸盐、酒 石酸盐、柠檬酸盐或葡糖酸盐。

合适的氨基供体包括例如NH₃或NH₄OH或B-NH₂，其中B为–COR¹基团，其中R¹可选自具有1-10个碳原子的任选地被取代的环状或非环状 脂肪基、具有1-10个碳原子的任选地被取代的脂肪族杂环基、任选地被取 代的(杂)芳基、具有1-10个碳原子的任选地被取代的烷氧基、任选地被取 代的磺酰基等等。优选的是NH₃和NH₄OH。当然也可能使用多种氨基供 体的组合。R¹上任选地存在的取代基可选自羟基、三卤化物，例如三氟甲 基、三氯甲基；卤素原子，例如氟化物、氯化物或碘化物；胺基，例如甲 胺、二甲胺、苄胺、乙胺、丙胺、苯胺、4-氟苯胺；烷氧基或芳氧基，例 如甲氧基、乙氧基、异丙氧基、苄氧基、苯氧基、4-氟苯氧基、3-氟苯氧 基、2-氟苯氧基；硫醚，例如甲基硫醚、乙基硫醚、苄基硫醚；三卤素烷 基醚，例如三氟甲基醚；芳基或杂芳基，例如苯基、4-氟苯基、3-氟苯 基、2-氟苯基、2-三氟甲基苯基、3-三氟甲基苯基、4-三氟甲基苯基、噻 吩、呋喃、吡唑、吡咯、咪唑等等。

PAL的“立体选择性”表示PAL优先催化化合物(2)的对映异构体之 一的形成。酶的立体选择性可以根据E-比值表达，其为C-S.Chen,Y Fujimoto,G.Girdaukas,C.J.Sih.,J.Am.Chem.Soc.1982,104,7294-7299中 所述的两种对映异构体特异性常数V_max/K_m的比值。在本发明的范围内， 使用下述V_max和K_m测定PAL的E-比值，使用PAL在邻-X-取代的苯丙氨 酸化合物(＝化合物(1))的非氧化性脱氨中测定所述V_max和K_m值。

优选地，PAL形成具有>80％的e.e.的产物，更优选地，PAL形成具 有>90％的e.e.的产物，进一步更优选地，PAL形成具有>95％的e.e.的产 物，最优选地，PAL形成具有>99％的e.e.的产物。优选地，PAL立体选 择性地催化苯丙氨酸化合物(S)-对映异构体的形成，更优选地，形成邻-X- 取代的(S)-苯丙氨酸化合物。

本发明工艺中使用的PAL优选地不受底物抑制，即优选地不受肉桂酸 或其衍生物造成的抑制。

本发明的工艺不以任何方式受到与SEQIDNO.4具有至少50％的同 一性的PAL使用形式的限制。PAL可例如以选自以下的方式存在：粗酶 溶液、纯化的酶溶液、天然或通过遗传修饰具有PAL活性的(可透过的和 /或固定化的)细胞、具有这类活性的细胞裂解液、固定化的形式、化学修 饰的形式或本领域技术人员已知的其它形式，或这些形式中两种或更多的 组合。

本领域技术人员应当明白，该用途也可以由天然存在的(野生型) PAL酶的突变体来实现。例如，可能制造PAL-活性突变体(即对至少一 种底物显示比野生型PAL更高活性的突变体)、PAL-表达突变体(即比 野生型PAL更好地表达的突变体)等等。可如下文所述来制造野生型酶的 PAL-活性突变体：使用本领域技术人员已知的诱变技术(随机诱变、定点 诱变、定向进化、基因改组等)修饰编码野生型酶的DNA，从而使得该 DNA编码与野生型酶至少有一个氨基酸区别的酶，并在合适的(宿主)细 胞中表达由此修饰的DNA。

或者，可如下文所述来制备PAL-表达突变体：使用本领域技术人员 已知的诱变技术修饰编码野生型PAL酶的DNA，从而如果该DNA在(宿 主)细胞中被表达，则对突变的DNA而言，其PAL的表达水平比未突变 的DNA更高。技术人员知道如何选择这些PAL-表达突变体，例如通过测 量针对至少三种不同底物的相对活性，并通过将活性比值与野生型酶比较 来实现。表达突变体对所有不同的底物都具有更高的活性，而底物之间的 活性比例等于野生型酶的活性比例。PAL酶的突变体关于(立体)选择性 和/或活性和/或稳定性和/或溶剂抗性和/或pH谱和/或温度谱和/或表达抑制 和/或产物抑制和/或底物抑制具有改进的特性，可基于任何这些改进特性 的单独的或其与两个或多个组合的存在，特异地选择所述PAL突变体。

向本发明的过程中添加还原剂，从而减少氧对PAL寿命的负作用可能 是有利的。这类还原剂的例子包括硫化氢、巯基乙酸、硫代硫酸、亚硝 酸、亚硫酸、上述的铵盐和金属盐、二硫苏糖醇、乙硫醇、乙二硫醇 (ethylenemercaptan)、甲硫醇、2-巯基乙醇、氢、一氧化氮、铁(II)化合物、 锰(II)化合物、硫磺和锌。优选地，为了降低氧对PAL寿命的作用，可在 缺氧条件下以本领域技术人员已知的方式进行本发明的方法，例如通过在 氮气氛下进行本发明的方法来实现。本领域技术人员可进行常规实验，以 选择最适反应条件，所述条件尤其涉及温度、pH、浓度和溶剂。

优选地，选择PAL-步骤的温度，使得所选择的PAL活性最佳。例 如，对Idiomarinaloihiensis的PAL而言，优选的反应温度在0到50℃， 尤其是25到45℃，最尤其是27到37℃的范围内。

优选地，选择PAL步骤的pH和氨基酸供体(优选地为NH₃)的浓 度，使得所选择的PAL活性和形成的苯丙氨酸化合物的稳定性和获得这些 化合物的产率最佳。例如，对Idiomarinaloihiensis的PAL而言，pH优选 地处于pH8到pH14的范围内，尤其是pH10到12的范围内，更尤其是 pH10.5到11.5的范围内。

例如，对Idiomarinaloihiensis的PAL而言，水中的氢氧化铵(NH₄OH) 浓度优选地选自约5至约25wt.％之间，尤其是约10到15wt.％，最尤其 是约12到14wt.％。

本发明的工艺可例如在氨水中进行，可向所述氨水中任选地添加共溶 剂、增溶剂或添加剂，从而增强相应肉桂酸化合物的溶解或增强PAL活性 或稳定性。共溶剂的例子包括二甲基酰胺、四氢呋喃乙腈、戊二醛、甘 油、甲苯、乙醇、丙酮、醚和二甲基亚砜(DMSO)。增溶剂的例子包括 TritonX100(由AldrichChemicalCompany,Inc.,Milwaukee,Wis制造)、 Tween-80(由AldrichChemicalCompany,Inc.,Milwaukee,Wis制造)、聚 乙二醇(PEG)。添加剂的例子包括谷氨酸、异亮氨酸、乙二醇和山梨糖 醇。

在本发明的工艺中获得的苯丙氨酸化合物可直接在下一步骤中使用， 或可先进行纯化。可使用本领域技术人员已知的常规方法，从本发明的工 艺获得的反应混合物中纯化苯丙氨酸化合物。例如，可将获得的包含苯丙 氨酸化合物的反应混合物过滤或离心(以去除未溶解的颗粒，例如表达 PAL的宿主细胞)。另外，可例如蒸发氨基供体，之后可优选地通过沉淀 分离苯丙氨酸化合物。

使用本发明的工艺获得的产率优选地为至少30％，更优选至少40％， 进一步更优选至少50％，尤其优选至少60％，更尤其优选至少80％，最尤 其是至少90％。

在本发明工艺的一个优选的实施方案中，在存在来自Shewanella oneidensis、Idiomarinaloihiensis、Fibrobactersuccinogenes或Vibrio vulnificus的PAL时，通过将相应的2-氯-取代的肉桂酸化合物在氢氧化铵 的水性溶液中反应，来制备邻-氯-取代的(S)-苯丙氨酸化合物(式(2)，其中 X代表Cl且Z代表H)，所述水中的氢氧化铵浓度为约12到14wt.％，所 述PAL的氨基酸序列分别在SEQIDNO.2(与SEQIDNO.4具有60％的 序列同一性)、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6(与SEQIDNO.4具有53％ 的序列同一性)和SEQIDNO.8(与SEQIDNO.4具有63％的序列同一 性)中给出。惊人的是，尽管这四种酶在来自NCBi的GenBank数据库中 被注解为组氨酸解氨酶，但是这四种酶都具有苯丙氨酸解氨酶活性。优选 地，在该实施方案中，温度被选择为25到45℃之间，pH范围从pH10.5 到11.5。

本发明还涉及在存在立体选择性苯丙氨酸解氨酶时制备本发明的对映 异构体富集的苯丙氨酸化合物的工艺，所述苯丙氨酸解氨酶与SEQIDNO. 2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6或SEQIDNO.8具有至少80％、优选地 90％、最优选地95％的序列同一性。

如WO2006/069799A1中所公开的，在本发明的工艺中形成的苯丙氨 酸化合物可用于制备光学活性的(S)-吲哚啉-2-羧酸，其进而是[2S- [1[R*(R*),2a,3ab,7ab]]-1-[2-[[1-(乙氧羰基)丁基]氨基]-1-氧代丙基]八氢- 1H-吲哚-2-羧酸生产中的中间体。

因此，本发明还涉及包含本发明工艺的工艺，其中生产的苯丙氨酸化 合物被进一步转化为活性药物成分，尤其是[2S-[1[R*(R*),2a,3ab,7ab]]-1- [2-[[1-(乙氧羰基)丁基]氨基]-1-氧代丙基]八氢-1H-吲哚-2-羧酸。

本发明将借助于以下的实施例阐述，但不受其限制。

具体实施方式

实施例

在PAL活性的测试中使用以下克隆。

通过PCR扩增具有上文给定的核酸序列的基因，并使用Xi克隆方法 将经纯化的PCR产物与载体pSE420(InvitrogenCorp.CAUSA)的NcoI和 BglII位点融合。通过使用该方法，在克隆基因后将NcoI位点破坏。形成 的质粒被转化至E.coliTOP10细胞(Invitrogen)，并通过限制性分析和琼脂 糖凝胶电泳检查正确的插入，给出克隆上文给定的克隆编号(clone number)。

R.glutinis的PAL基因由GenscriptCorporation,ScotchPlains,USA根 据RhodosporidiumtoruloidesATCC10788的PAL的蛋白质序列合成，其 序列在NCBI的蛋白质数据库中在编号CAA31209下列出。针对在E.coli 中的表达对合成的PAL基因的密码子进行最优化。通过Genscript将合成 的基因连接在pUC57的SmaI位点中，得到pUC57_PAL构建体。将冻干 的质粒(5μg)(得自Genscript)溶于50μlMilliQ水中，并根据供应商的方 案使用1μl该溶液转化E.coliDH5α化学感受态细胞(Invitrogen,Breda,荷 兰)的小份试样。

制备细胞和无细胞提取物

培养含有PAL的E.coli

在补充有羧苄青霉素(100μg/ml)的各20ml2xTY培养基(16g/l胰蛋白 胨；10g/l酵母提取物，7g/lNaCl)中接种含有相应质粒的E.coli，并在 28℃孵育过夜。使用这些培养物接种更大体积的培养基(250μl预培养物 用于250ml培养基)。将细胞在37℃培养直至OD达到～1。用IPTG (0.5mM终浓度)诱导Shewanellaoneidensis(克隆编号1)、Idiomarina loihiensis(克隆编号2)、Fibrobactersuccinogenes(克隆编号3)、Vibrio vulnificus(克隆编号4)的PAL克隆。用IPTG(1mM终浓度)诱导 Rhodotorulaglutinis的PAL克隆。孵育后将培养物在28℃下振动过夜。

通过离心(4℃下8000RPM)收获细胞(～2g/250ml培养基)，并将 其重悬于pH8.8的0.1MTris/HCl缓冲液中(1ml缓冲液/0.5g细胞)。将 细胞悬浮液分为0.2ml的小份试样，并离心。弃去上清液，将细胞沉淀物 (每份约0.1克)储存于-20℃。

蛋白质测定，SDSPage，CFE的制备

将0.1g细胞重悬于pH8.8的1ml0.1MTris/HCl缓冲液中，并通过 超声处理破碎细胞。对一部分经超声的细胞进行离心，并倾析出无细胞的 提取物(CFE)。通过Bradford所述的方法来测定不同级分中的蛋白质浓 度。

为了测定表达水平，将25μg无细胞提取物和总细胞提取物的蛋白质 应用到NuPAGE凝胶上。

菌株 编号 表达 Shewanella oneidensis 1 ++ Idiomarina loihiensis 2 ++++ Fibrobacter succinogenes 3 +++ Vibrio vulnificus 4 +++ Rhodotorula glutinis 5 ++

++++>50％的总蛋白质；

+++＝30-50％的总蛋白质；

++＝10-30％的总蛋白质。

该分析显示PAL基因在E.coli中良好表达。未形成包涵体。克隆 2(Idiomarinaloihiensis)显示在E.coli中的最高表达水平。

pH9.25下的初始活性

通过在30℃下用硫酸将10wt％氨溶液调节至pH9.25制备反应溶液。

在氨溶液中制备10mM反式-2-溴-肉桂酸溶液。将4.8ml底物溶液加 热至30℃。将100mg细胞沉淀物悬浮于100ml相应的氨溶液中，并添加 至反应混合物中。反应即时进行。通过HPLC分析测定形成的(L)-2-溴-苯 丙氨酸。

在反应的最初30-60分钟中，测量相对初始活性(与含有R.glutinis PAL的E.coli细胞的活性比较)。

PAL克隆 相对初始活性(％) 4.S.oneidensis 10900 12.I.loihiensis 14300 16.F.succinogenes 11400 18.V.vulnificus 8400 19.R.glutinis 100

表1：与R.glutinis的PAL相比，个体PAL克隆的相对初始活性。

如表1中所示，在测试的条件下，较之从R.glutinis克隆的基因，从S. oneidensis、I.loihiensis、F.succinogenes和V.vulnificus克隆的基因的活性 均要高得多。

测定底物抑制

对pH11下的反应：将4.8ml100mM、50mM、20mM和10mM反式- 2-溴-肉桂酸在13wt％氨水中的溶液(在30℃下用硫酸调节至pH11)加 热至30℃。

对pH9.25下的反应：将固体反式-2-溴-肉桂酸悬浮于4.8ml8wt％氨 水(在30℃下用硫酸调节至pH9.25)中，得到50mM、20mM和10mM 的终浓度。将反应混合物加热至30℃。为了起始反应，添加100mg细胞 沉淀物在100ml相应氨溶液中的悬浮液。反应即时进行。通过HPLC分析 测定形成的(L)-2-溴-苯丙氨酸。

不同底物浓度下13％NH₃pH11中的初始活性(相对于R.glutinis的 PAL克隆而言)：

克隆 10mM 20mM 50mM 100mM I.loihiensis 104 197 423 594 R.glutinis 100 38 8 0

不同浓度下8％NH₃pH9.27中的初始活性(相对于R.glutinis的PAL 克隆而言)：

克隆 10mM 20mM 50mM S.oneidensis 8350 12460 11650 I.loihiensis 14300 20000 24110 F.succinogenes 7340 12380 13530 V.vulnificus 6820 8770 8860 R.glutinis 100 nd* nd

*nd:由于在这些条件下活性非常低，所以未检测到活性。

注意：在高于20mM的浓度下，与8％氨水pH9.27的反应是浆体 (slurry)。

从上述结果可以看出，所有的PAL都显示比R.glutinisPAL更少的底 物抑制。从I.loihiensis克隆的PAL显示对高底物浓度的异常耐受，甚至 在底物溶解度高的高pH值下也是如此。