一种日本囊对虾微卫星三重PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种日本囊对虾微卫星3重PCR检测方法。本发明包括设计并合成3对PCR引物；提取总DNA；3重PCR反应的组合、体系和反应程序；PCR产物的检测。本发明建立了进行的日本囊对虾微卫星3重PCR检测方法比原有方法效率可提高3倍。本发明具有节省成本，节省时间，高效经济，重复性强、简单易行，检测简单等特点，可在日本囊对虾的育种管理、家系鉴定、个体识别、亲缘关系鉴定、良种选育、连锁图谱构建、遗传多样性检测等方面进行推广应用。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学遗传育种的分子标记辅助技术，具体涉及一种日本囊对虾微卫星三重PCR检测方法。

背景技术

日本囊对虾(Penaeusjaponicus)广泛分布于印度洋，西太平洋地区，以及日本沿海和我国东南沿海等海域均有分布，是我国沿海地区重要的养殖对象。利用分子标记辅助是日本囊对虾良种选育的重要途径之一，目前微卫星为广泛应用的一种分子标记。微卫星广泛分布于基因组中，多态性高，稳定性好，共显性遗传。广泛应用于系谱鉴定、个体识别、基因连锁分析、遗传连锁图谱构建、遗传多样性检测等诸多领域。常规微卫星检测技术为单引物常规PCR，效率低，而多重PCR在同一反应中同时扩增多个位点，极大提高了效率，减少样品浪费，加快了检测进程，大大节约了实验成本等优点。微卫星多重PCR技术在水产动物中应用广泛，主要用于亲子鉴定和遗传多样性检测。在日本囊对虾中尚未见有多重PCR检测技术的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种日本囊对虾微卫星标记的三重PCR检测方法，该发明在大量微卫星分子标记的基础上构建了一个三重PCR检测体系及检测程序，实现了在一个PCR反应中同时检测3个微卫星位点，与常规PCR方法相比效率提高了3倍，所得结果可同时反映日本囊对虾多个微卫星位点的遗传多态性，为日本囊对虾分子标记辅助选择育种提供高效而准确的微卫星检测技术。

为实现本发明的目的，本发明采用下述技术方案予以实现：一种日本囊对虾微卫星三重PCR检测方法，它包括：(1)设计、合成3重PCR引物；(2)提取总DNA；(3)三重PCR反应；(4)电泳检测PCR产物；所述3重PCR反应包括三重PCR反应体系和三重PCR反应程序，所述三重PCR反应体系的引物为SEQ036、SEQ031和SEQ043的组合，所述三重PCR引物的序列如下：

SEQ036正向引物序列：5’-AAGGGAATTTGAGTAGAGTCTG-3'；SEQ036反向引物序列：5'-GTTACATGCGAGTTGCTATT-3'

SEQ031正向引物序列：5'-ACGCTGGTTTCATTGGGATT-3'；SEQ031反向引物序列：5'-AAATGTGGGAGGGCGAAA-3'

SEQ043正向引物序列：5'-ATTGCTGTCGGGATGAGA-3'；SEQ043反向引物序列：5'-TGGTTGTTCGGAAGAGGT-3'

所述的三重PCR反应体系为：10×Buffer2μL；25mMMg²⁺2μL；10mMdNTP2μL，10μM3对扩增引物SEQ036、SEQ031和SEQ043各1μL；5U/μLTaqDNA聚合酶0.1μL；100ng/μL日本囊对虾总DNA：1μL；灭菌双蒸水补足至25μL。

所述的三重PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s，51℃退火1min，72℃延伸1min，共进行28个循环；最后72℃延伸5min；4℃保存结束反应。

本发明步骤(4)采用8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明将需要分别进行3次的日本囊对虾微卫星PCR扩增和3次检测，整合为一次的3重PCR反应体系和一次产物检测，大大提高了日本囊对虾微卫星标记的检测效率。利用该3重PCR反应体系进行日本囊对虾微卫星检测，可以大大节约PCR和电泳试剂、实验耗材、减少电泳检测时间及成本。

2、本发明的3重PCR反应所得微卫星产物片段差异显著，可避免不同位点产物片段大小接近时无法区分的缺点。

3、本发明可对日本囊对虾在各个生长发育时期检测，有利于日本囊对虾育种过程中选择具备优良性状的日本囊对虾家系和群体。

4、本发明可以在日本囊对虾群体遗传多样性分析、家系识别、亲子鉴定、育种管理、良种选育中进行推广应用。

附图说明

图1为日本囊对虾3重PCR扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图中M为markerD2000，1为所述3对引物的扩增结果，2，3，4为所述3对引物两两组合的扩增结果，5，6，7为所述单对引物的扩增结果。

具体实施方式

下面结合附图及实施例，具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通或改变都将落入本发明保护范围。

实施例1

(1)、引物设计与组合

利用TandemRepeatFinder从随机克隆测序序列中查找微卫星序列，选取核心重复序列两侧完整的侧翼序列用PremierPrimer设计引物。MPprimer进行引物间的组合评价，取△G的绝对值小于3，降低二级结构形成的几率，提高PCR反应特异性及反应效率。通过对多对微卫星引物间的组合，对日本囊对虾多重PCR体系组合、PCR反应条件及反应程序进行优化，最终建立本发明所述的一种日本囊对虾微卫星3重PCR反应体系、反应程序及检测方法。本发明所选择的3对日本囊对虾引物为：

SEQ036正向引物序列：5’-AAGGGAATTTGAGTAGAGTCTG-3'

SEQ036反向引物序列：5'-GTTACATGCGAGTTGCTATT-3'

SEQ031正向引物序列：5'-ACGCTGGTTTCATTGGGATT-3'

SEQ031反向引物序列：5'-AAATGTGGGAGGGCGAAA-3'

SEQ043正向引物序列：5'-ATTGCTGTCGGGATGAGA-3'

SEQ043反向引物序列：5'-TGGTTGTTCGGAAGAGGT-3'

(2)、日本囊对虾总DNA提取

取肌肉组织约100mg，放入1.5ml离心管，加入pH8.0的TE(10mMTris-Cl，100mMEDTA)475μl，剪刀剪碎，加入10％SDS溶液20μl，加入20mg/ml蛋白酶K5μl，混匀，55℃消化2.5-3小时，至无组织块。用Tris-Cl平衡饱和酚、酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1(体积比)混合溶液、氯仿各抽提一次，每次混匀10min，12000rpm离心10min，取上清，最后上清加1/25体积5MNaCl，2.5倍体积-20℃冰冻无水乙醇沉淀DNA，静置10min，离心10min，沉淀用70％乙醇洗2遍，室温干燥，用灭菌双蒸水100μl溶解，1％琼脂糖凝胶检测DNA质量。

(3)、日本囊对虾3重PCR反应体系

日本囊对虾3重PCR反应体系为：10×Buffer2μL；25mMMg²⁺2μL；10mMdNTP2μL，10μM3对扩增引物SEQ036、SEQ031和SEQ043各1μL；5U/μLTaqDNA聚合酶0.1μL；100ng/μL日本囊对虾总DNA：1μL；灭菌双蒸水补足至25μL。

(4)、日本囊对虾3重PCR反应程序

日本囊对虾3重PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s，51℃退火1min，72℃延伸1min，共进行28个循环；最后72℃延伸5min；4℃保存结束反应。

(5)、PCR扩增产物的检测

PCR反应结束，将产物与载样缓冲液1:1混合后，经8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳仪功率12W，电泳1-2.5h。将电泳后胶板银染显色，记录所得结果。

图1为日本囊对虾3,2,1重PCR扩增变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中M为marker，1为所述3对引物的扩增结果，2，3，4为两两组合的扩增结果，5，6，7为单引物的扩增结果。实验结果表明3对引物组合扩增结果清晰，分辨率高。

依据本发明所提供的日本囊对虾微卫星标记的3重PCR的引物组合及检测方法快速检测日本囊对虾单个个体在3个微卫星位点的遗传变异及多态性，进一步可应用于日本囊对虾的家系识别、亲子鉴定、遗传标记筛选、遗传连锁图谱构建等方面。

以上实例已经仅说明本发明的技术方案，应当理解，对于本领域的技术人员来说，对上述实施例做出修改和/或变通或者采用等同的替代方案是显然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的专业术语用于对本发明的阐述和理解，并不能对本发明做出限制。