一种花榈木组培消毒灭菌配方和组培方法

摘要

本发明公开了一种花榈木组培消毒灭菌配方和组培方法，籽苗茎段以70%乙醇消毒30s+0.1%升汞灭菌8min+70%乙醇消毒30s+植物组织培养抗菌剂0.5ml/L的消毒效果最好；幼苗外植体采集最佳时间为4月份，茎段用70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%升汞浸泡8min消毒效果最好，叶片用70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%升汞浸泡6min消毒效果最好。成年植株叶片以4月份采集较好，用70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%升汞浸泡12min。本发明通过不同的消毒方法对花榈木外植体的籽苗、幼苗和成年植株组培进行消毒，能够获得较好的成活率，并且大大扩展了花榈木组培繁殖材料的来源，针对消毒时间的控制能够大大提高花榈木的组培效果。

说明书

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种花榈木组培消毒灭菌配方，还涉及一种花榈木组培方法。

背景技术

花榈木（OrmosiahenryiPrain）是豆科红豆属常绿乔木，又名花梨木、臭桐柴，属国家二级重点保护植物，高5-13米，奇数羽状复叶，长圆形或长圆倒披针形，四季常绿，无明显落叶现象；小枝及叶背密生灰黄色短柔毛；花期6-7月，黄白色，总状花絮；荚果扁平，成熟时呈黑褐色，种子红色。花榈木木材致密、纹理美丽、有光泽、耐腐蚀、易切削、切面光滑，是珍贵用材树种，又因其树皮青绿光滑，树姿优美成为优质园林绿化树种，适合用作行道树及庭院栽培；其根、枝、叶还是名贵药材，祛风散结、解毒祛瘀。

目前花榈木以种子繁殖为主，但由于花榈木种子种皮包被有蜡质层，阻碍种子吸水发芽，因而自然条件下种子成熟散落后很难自然萌发，人工播种时采用85℃热水对种皮进行人工处理或进行破皮处理，可以显著提高其发芽率。由于花榈木野生植株稀少，结实困难且结实率低，种子繁殖系数低。组织培养具有繁殖速度快、繁殖系数大、后代性状整齐的优点。因而建立花榈木组织培养快繁体系，扩大繁殖系数，对花榈木野生资源的保护和人工培育具有重要意义。

在组织培养过程中，外植体的消毒是极其重要的步骤，选择合适的外植体及适当的外植体消毒方法是组织培养成功的前提。现有的花榈木组培方法是以花榈木无菌萌发幼苗为外植体进行，通过花榈木种子消毒后在无菌环境中萌发得到的无菌籽苗作为外植体，经过增殖、生根等步骤构建组培体系。但由于花榈木种子资源的限制，外植体的获得仍具有一定的局限性。若花榈木组培初代培养材料取自自然萌发生长的植株，由于其带菌系数很高，组培过程中外植体污染严重，成活率极低。只有筛选出更有效的消毒方法，才能进行进一步的组织培养研究。

在文献“花榈木的组织培养和快速繁殖（姚军等，植物生理学通讯，2007，01：123-124）”中采用种子无菌萌发获得的带叶茎段进行组织培养和快速繁殖研究，在文献“花榈木胚轴愈伤组织的诱导及植株再生（高丽等，安徽农业科学，2009，33：16271-16273）”中则采用花榈木种子无菌萌发获得的胚轴进行组织培养及后续的耐冷性诱导，两人采用的外植体均来源于种子无菌萌发的材料，繁殖材料仍然有限。有关花榈木自然萌发植株和成年植株外植体获得组培成功的案例尚未见报道，其原因是自然萌发植株和成年植株外植体内生菌多，无菌培养体系建立困难。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种花榈木组培消毒灭菌配方和组培方法，旨在解决花榈木外植体组培中污染严重、成活率极低和难于诱导问题，以克服现有技术问题的不足。

本发明的技术方案：一种花榈木组培消毒灭菌配方，包括70%酒精、0.1%升汞、70%酒精和向诱导培养基中添加0.5ml/L植物组织培养抗菌剂（PPM）。

一种花榈木组培消毒灭菌配方，包括70%酒精，50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混合液以及0.1%的升汞。

一种花榈木组培消毒灭菌配方，包括70%酒精，50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混合液以及0.1%升汞。

一种花榈木组培方法，该方法包括以下步骤：

（1）外植体的采集：采用苗龄10天的花榈木籽苗茎段外植体；

（2）清洗：采用洗涤剂浸泡15分钟，用流水冲洗30分钟；

（3）消毒：将步骤（2）中洗净的外植体拿入无菌工作台内，采用权利要求1所述的一种花榈木组培消毒灭菌配方，依次采用70%酒精、0.1%升汞和70%酒精浸泡，其浸泡时间分别为0.5分钟、8分钟和0.5分钟，每次消毒处理后均用无菌水冲洗4-5次；

（4）接种：将步骤（3）中清洗后的外植体接种在诱导培养基上，所述诱导培养基包括MS培养基及附加成分，并向诱导培养基中添加0.5ml/L植物组织培养抗菌剂（PPM）；

（5）培养：将步骤（4）中放置在诱导培养基中的外植体放入到培养箱中进行培养，采用培养条件为：温度23-27℃，光强2500-3000lx，白天光照12小时。

一种花榈木组培方法，该方法包括以下步骤：

（1）外植体的采集：采用当年生花榈木播种幼苗的带顶芽茎段、带侧芽茎段或叶片外植体，采集时间为4月份；

（2）清洗：采用洗涤剂浸泡30分钟，用流水冲洗1小时；

（3）消毒：将步骤（2）中洗净的外植体拿入无菌工作台内，采用权利要求1所述的一种花榈木组培消毒灭菌配方，依次采用70%酒精、50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混合液以及0.1%的升汞浸泡，针对叶片其浸泡时间分别为0.5分钟、30分钟和6分钟，针对茎段其浸泡时间分别为0.5分钟、30分钟和8分钟，每次消毒处理后均用无菌水冲洗外植体4-5次；

（4）接种：将步骤（3）中清洗后的外植体接种在诱导培养基上，所述诱导培养基包括MS培养基及附加成分；

（5）培养：将步骤（4）中放置在诱导培养基中的外植体放入到培养箱中进行培养，采用培养条件为：温度23-27℃，光强2500-3000lx，白天光照12小时。

一种花榈木组培方法，该方法包括以下步骤：

（1）外植体的采集：采用多年生花榈木成年植株上的当年生叶片，采集时间为4月份；

（2）清洗：采用洗涤剂浸泡1小时，用流水冲洗2小时；

（3）消毒：将步骤（2）中洗净的外植体拿入无菌工作台内，采用权利要求1所述的一种花榈木组培消毒灭菌配方，依次采用70%酒精、50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混合液以及0.1%升汞的浸泡，其浸泡时间分别为0.5分钟、30分钟和12分钟，每次消毒处理后均用无菌水冲洗外植体4-5次；

（4）接种：将步骤（3）中清洗后的外植体接种在诱导培养基上，所述诱导培养基包括MS培养基及附加成分；

（5）培养：将步骤（4）中放置在诱导培养基中的外植体放入到培养箱中进行培养，采用培养条件为：温度23-27℃，光强2500-3000lx，白天光照12小时。

优选的，上述MS培养基成分如下：

硝酸钾KNO₃1900mg/L

硝酸铵NH₄NO₃1650mg/L

七水硫酸镁MgSO₄.7H₂O370mg/L

磷酸二氢钾KH₂PO₄170mg/L

二水氯化钙CaC_l2.2H₂O440mg/L

四水硫酸锰MnSO₄.4H₂022.3mg/L

七水硫酸锌ZnSO₄.7H₂O8.60mg/L

硼酸H₃BO₃6.20mg/L

碘化钾KI0.83mg/L

二水钼酸钠NaMoO₄.2H₂O0.25mg/L

五水硫酸铜CuSO₄.5H₂O0.025mg/L

六水氯化钴CoC_l2.6H₂O0.025mg/L

乙二胺四乙酸二钠Na₂-EDTA37.30mg/L

四水硫酸亚铁FeSO₄.4H₂O27.80mg/L

甘氨酸2.00mg/L

盐酸硫胺素0.10mg/L

盐酸吡哆醇0.50mg/L

烟酸0.50mg/L

肌醇100mg/L；

上述附加成分为6-BA（6-苄胺基嘌呤，6-Benzylaminopurine）2.0mg/L，NAA（萘乙酸，I-NaphthyIacetic）1.0mg/L，琼脂8g/L，蔗糖30g/L。

本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明有如下效果：

（1）本发明采用70%酒精、0.1%升汞、70%酒精和向增值培养基中添加0.5ml/L植物组织培养抗菌剂（PPM）对籽苗进行消毒，能够大大降低污染率，将污染率控制在6.67%，从而大大提高籽苗的组培成活率，达到93.33%，诱导率达到100%，组培效果显著。

（2）本发明采用70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%升汞浸泡8min对幼苗的茎段进行消毒和和采用70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%升汞浸泡6min对幼苗的叶片进行消毒，都能够大大降低污染率，前者和后者将污染率控制在0，大大提高幼苗外植体的组培成活率，前者存活率达到33.3%，后者存活率达到100%，前者诱导率到达60%，后者诱导率到达64.29%，组培效果显著。

（3）本发明采用70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%升汞浸泡12min对花榈木成年植株当年生叶片进行消毒，能够大大降低污染率将污染率控制在66.67%，从而大大提高成年植株外植体的组培成活率，达到33.33%，叶片诱导率达到80%，茎段诱导率达到20%，组培效果较显著。

（4）本发明采用花榈木外植体的籽苗、幼苗及成年植株叶片进行组培，大大扩展了组培繁殖材料的来源，有效解决了现有技术中只能采用花榈木种子萌发籽苗进行组培的局限性，并且也大大提高了组培的存活率和诱导率。由于籽苗外植体及当年生幼苗外植体较为幼嫩，时间过长会导致外植体死亡，过短会导致消毒效果差，因此，采用本发明中的消毒浸泡时间能够大大提高消毒效果。

（5）本发明采用的消毒配方简单，但能够起到很好地消毒作用，在花榈木的组织培养中根据具体的情况设置浸泡时间和添加植物组织培养抗菌剂，起到了非常好的消毒效果和组培效果。

具体实施方式

现结合如下实例对本发明作进一步的解释说明。

实施例1：一种花榈木组培消毒灭菌配方，包括70%酒精、0.1%升汞、70%酒精和向增值培养基中添加0.5ml/L植物组织培养抗菌剂。

实施例2：一种花榈木组培消毒灭菌配方，包括70%酒精，50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混合液以及0.1%的升汞。

实施例3：一种花榈木组培消毒灭菌配方，包括70%酒精，50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混合液以及0.1%升汞。

实施例4：一种花榈木组培方法，该方法包括以下步骤：

（1）外植体的采集：采用苗龄10天的花榈木籽苗茎段外植体；

（2）清洗：采用洗涤剂浸泡15分钟，用流水冲洗30分钟；

（3）消毒：将步骤（2）中洗净的外植体拿入无菌工作台内，采用实施例1一种花榈木组培消毒灭菌配方进行消毒，依次采用70%酒精、0.1%升汞和70%酒精浸泡，其浸泡时间分别为0.5分钟、8分钟和0.5分钟，每次消毒处理后均用无菌水冲洗4-5次；

（4）接种：将步骤（3）中清洗后的外植体接种在诱导培养基上，所述诱导培养基包括MS培养基及附加成分，并向诱导培养基中添加0.5ml/L植物组织培养抗菌剂（PPM）；

（5）培养：将步骤（4）中放置在诱导培养基中的外植体放入到培养箱中进行培养，采用培养条件为：温度23-27℃，光强2500-3000lx，白天光照12小时。

实施例5：一种花榈木组培方法，该方法包括以下步骤：

（1）外植体的采集：采用当年生花榈木播种幼苗的带顶芽茎段、带侧芽茎段或叶片外植体，采集时间为4月份；

（2）清洗：采用洗涤剂浸泡30分钟，用流水冲洗1小时；

（3）消毒：将步骤（2）中洗净的外植体拿入无菌工作台内，采用实施例2一种花榈木组培消毒灭菌配方，依次采用70%酒精、50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混合液以及0.1%的升汞浸泡，针对叶片其浸泡时间分别为0.5分钟、30分钟和6分钟，针对茎段其浸泡时间分别为0.5分钟、30分钟和8分钟，每次消毒处理后均用无菌水冲洗外植体4-5次；

（4）接种：将步骤（3）中清洗后的外植体接种在诱导培养基上，所述诱导培养基包括MS培养基及附加成分；

（5）培养：将步骤（4）中放置在诱导培养基中的外植体放入到培养箱中进行培养，采用培养条件为：温度23-27℃，光强2500-3000lx，白天光照12小时。

实施例6：一种花榈木组培方法，该方法包括以下步骤：

（1）外植体的采集：采用多年生花榈木成年植株当年生叶片，采集时间为4月份；

（2）清洗：采用洗涤剂浸泡1小时，用流水冲洗2小时；

（3）消毒：将步骤（2）中洗净的外植体拿入无菌工作台内，采用采用实施例3一种花榈木组培消毒灭菌配方进行消毒，依次采用70%酒精、50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混合液以及0.1%升汞的浸泡，其浸泡时间分别为0.5分钟、30分钟和12分钟，每次消毒处理后均用无菌水冲洗外植体4-5次；

（4）接种：将步骤（3）中清洗后的外植体接种在诱导培养基上，所述诱导培养基包括MS培养基及附加成分；

（5）培养：将步骤（4）中放置在诱导培养基中的外植体放入到培养箱中进行培养，采用培养条件为：温度23-27℃，光强2500-3000lx，白天光照12小时。

作为优选的，上述实施例4-6中MS培养基成分如下：

硝酸钾KNO₃1900mg/L

硝酸铵NH₄NO₃1650mg/L

七水硫酸镁MgSO₄.7H₂O370mg/L

磷酸二氢钾KH₂PO₄170mg/L

二水氯化钙CaC_l2.2H₂O440mg/L

四水硫酸锰MnSO₄.4H₂022.3mg/L

七水硫酸锌ZnSO₄.7H₂O8.60mg/L

硼酸H₃BO₃6.20mg/L

碘化钾KI0.83mg/L

二水钼酸钠NaMoO₄.2H₂O0.25mg/L

五水硫酸铜CuSO₄.5H₂O0.025mg/L

六水氯化钴CoC_l2.6H₂O0.025mg/L

乙二胺四乙酸二钠Na₂-EDTA37.30mg/L

四水硫酸亚铁FeSO₄.4H₂O27.80mg/L

甘氨酸2.00mg/L

盐酸硫胺素0.10mg/L

盐酸吡哆醇0.50mg/L

烟酸0.50mg/L

肌醇100mg/L；

附加成分为6-BA（6-苄胺基嘌呤，6-Benzylaminopurine）2.0mg/L，NAA（萘乙酸，I-NaphthyIacetic）1.0mg/L，琼脂8g/L，蔗糖30g/L。

下列对比试验进一步说明本发明实施及其有益效果。

1材料与方法

1.1实验材料

分别进行了籽苗茎段、幼苗茎段、成年植株茎段和嫩叶的消毒实验。籽苗外植体取自温室内萌发10d的籽苗，剪取3cm长茎段做外植体；幼苗外植体取自苗圃当年生播种苗，分别于4、8、12月份剪取带顶芽长约6cm的茎段做外植体；成年植株外植体取自苗圃7年生及农场20年生花榈木带顶芽枝条，分别于4、8、12月剪取当年生长约20cm半木质化枝条进行试验。将各种茎段剪成1.5cm长带顶芽或带侧芽茎段，将幼苗和成年植株茎段上的当年生叶片切成1cm×1cm大小用作外植体。

1.2消毒方法

将采集的籽苗外植体、幼苗外植体、成年植株外植体分别用洗涤剂浸泡15min、30min、将采集的籽苗外植体、幼苗外植体、成年植株外植体分别用洗涤剂浸泡15min、30min、1h，并用牙刷轻轻刷洗，成年植株外植体需去除表面绒毛，材料在流水下分别冲洗30min、1h、2h。之后在超净工作台内进行药剂表面消毒。所有材料先用70%酒精浸泡30s，用无菌水冲洗2-3次后分别采用表1的措施进行进一步消毒处理。每次处理后均用无菌水冲洗4-5次。

1.3接种方法

将外植体处理后于超净工作台上采用增值培养基接种，增值培养基配方为MS+6-BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L，pH5.8-6.0，每种材料每个处理接种15瓶，每瓶一个外植体。接种后置于培养温度（25±2）℃、光照强度3000lx下培养，光照时间12h/天。

1.4结果统计方法

接种后每天观察材料污染情况，并记录，结果计算公式如下

污染率=（污染数/接种数）×100%

存活率=（存活数/接种数）×100%

诱导率=（成功诱导数/存活数）×100%

灭菌有效值=(1-未污染率)×成活率×诱导率(小数相乘)*100%。

2.结果与分析

2.1籽苗茎段消毒效果分析

由表2可知，用0.1%升汞浸泡后，再用70%酒精浸泡30s的二次消毒处理（3号、4号）可以降低籽苗茎段的污染率，同样处理下用0.1%升汞处理8min优于6min。而相同处理条件下，在培养基中添加PPM的4号处理外植体污染率显著降低，成活率显著提高，比3号处理提高了26.66%。因此，对籽苗茎段而言，用70%酒精浸泡30s+0.1%升汞浸泡8min+70%酒精浸泡30s+PPM消毒效果最好。不论哪一种消毒处理，保存下来的外植体诱导率均达到100%。

2.2幼苗外植体消毒效果分析

2.2.1叶片

对幼苗叶片外植体而言，相同消毒处理条件下，4月份采集的幼苗叶片污染率和存活率相对较低（表3），但诱导率较高，在50%-100%之间。8月份和12月份采集的叶片尽管存活率高，但诱导率均为0。用（100mg/L苯菌灵+100mg/L链霉素）混合液浸泡30min（11-13号处理）和（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min（14-16号处理）均能有效降低4月份叶片的污染，其未污染率均为100%，高于9号、10号处理，但其存活率会降低。11-16号处理中，抗菌素用量产生的效果差异不明显，外植体存活率、诱导率均随升汞处理时间增加而降低，以14号处理效果最好，存活率、诱导率分别为33.33%、60%，灭菌有效值达到19.99%。因此，在4月份采集幼苗叶片做外植体，用70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%升汞浸泡6min消毒效果最好。

2.2.2茎段

试验表明（表4），总体上茎段的污染率为：4月份＞8月份＞12月份，但大多数消毒处理的污染率差异不明显，9-16号处理的污染率平均值比较接近。与叶片消毒相比，9-16号处理的消毒方法均可对茎段产生较好效果，可见幼苗茎段外植体对取材月份要求没有叶片严格。外植体存活率则表现为：12月份＞8月份＞4月份。这可能与4月份幼苗茎段较幼嫩有关；诱导率则以4月份最高，平均诱导率70.86%，12月份次之，平均诱导率58.67%，最低的是8月份的茎段，平均诱导率55.71%。外植体存活率、诱导率均随升汞处理时间增加而降低。从材料有效值看，9号、10号、15号处理对不同月份的材料都比较好。需要注意的是，虽然8月份及12月份的外植体材料有效值高于4月份，但外植体诱导产生的愈伤组织较少且容易褐化。建议4月份采集的茎段用10号消毒处理，即70%酒精浸泡30s+0.1%升汞浸泡6min+培养基中添加PPM；8月份、12月份采集的茎段用15号处理，即用70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%升汞浸泡8min消毒效果较好。

2.3成年植株外植体

2.3.1叶片

试验表明（表5），从污染率看，8月份＞12月份＞4月份，8月份的叶片带菌多，灭菌困难。与幼苗叶片相比，成年植株叶片消毒困难，即使是4月份采集的叶片外植体，污染率也在60%以上，培养基中添加PPM0.5ml/L后灭菌效果仍然很差。4个处理中8号处理效果较好，添加抗菌剂处理之后，污染率为66.67%，存活率为33.33%，诱导率80%，灭菌有效值为8.89%。因此，用成年植株叶片为外植体，以4月份采集，用70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%升汞浸泡12min消毒及诱导效果最好。

2.3.2茎段

成年植株茎段外植体消毒处理比其叶片更为困难（表6），4月份、12月份采集的茎段相对带菌较少，但污染率低于60%，8月份的带菌最多，无论哪种灭菌处理均全部污染。成年植株茎段消毒效果以12月份采集材料，用7号处理消毒效果较好，污染率为63.67%、存活率为33.33%，但从诱导率看，以4月份采集材料，在培养基中添加PPM0.5ml/L（6号处理）效果较好，诱导率高达100%。从灭菌有效值看，6号处理和7号处理效果都比较差，成年植株无菌体系建立还有待进一步探索。

3.小结与讨论

在植物组织培养过程中，无菌培养体系的建立是获取组培苗的重要环节。以不同生长阶段的花榈木叶片、茎段作为外植体的消毒试验结果表明，籽苗外植体以70%乙醇消毒30s+0.1%升汞灭菌8min+70%乙醇消毒30s+培养基中添加PPM0.5ml/l（4号处理）的消毒效果最好。幼苗外植体以4月份采集效果较好，幼苗茎段用70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%Hgcl浸泡8min（15号处理）消毒效果最好，幼苗叶片用70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%Hgcl浸泡6min（14号处理）消毒效果最好。成年植株外植体叶片以4月份采集较好，最佳消毒方法为：70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%Hgcl浸泡12min（8号处理）。

外植体消毒的关键之处在于合适消毒方法和消毒时间的选定，合适消毒剂组合的消毒方法以及合适的消毒时间的确定对植物无菌快繁体系的建立均具有重要作用。判断某种消毒方法是否合适，要以存活率为主要依据，并综合考察污染率及诱导率。研究发现，采用抗菌剂（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液及（100mg/L苯菌灵+100mg/L链霉素）混合液浸泡在花榈木外植体的消毒中均能起到一定的灭菌效果。在培养基中添加低浓度（0.5ml/L）的植物组培抗菌剂（PPM），可以在不影响诱导率的前提下，显著提升外植体的未污染率和存活率。

不同取材部位及取材时间对外植体的消毒难易程度有极大影响。取材时间对多数植物的组织培养都有一定的影响。研究发现，4月份及12月份取材的消毒效果优于8月份取材的花榈木外植体，这可能是由于4月份之后温度上升导致菌类活跃性上升。另外，由于4月份时植物生长较旺盛，因此此时取材的外植体诱导效果更好。同时研究发现，消毒时选用幼嫩叶片及带顶芽茎段比下部茎段消毒效果更好，因为其生长时间不长，杂菌等附着物较少，因而灭菌较容易。