金龙胆草组培快繁体系建立及组培苗GGPPS基因表达量分析

摘要

金龙胆草（Conyza blinii H.Lév.）为我国西南地区所特有的民间中草药，属菊科白酒草属两年生药用草本植物。作为道地中药材，金龙胆草具有清热解毒、止咳平喘、截疟消炎、止血凉血等功效。苦蒿素是金龙胆草中含量最多的一个二萜，仅存在于金龙胆草中，同时也是其特征性次生代谢产物，可作为专属性指标评估其药材品质。近年来的研究表明，苦蒿素能显著抑制大鼠胃溃疡形成并减少溃疡面积，同时降低胃黏膜组织中MDA的水平。因此，苦蒿素有望成为一种新型抗溃疡药物。
　　随着对金龙胆草各项研究的深入，致使野生金龙胆草被长期大量采挖，加之生长环境的改变及人类活动的影响，最终导致野生金龙胆草资源迅速减少，几近枯竭。为保护并丰富野生金龙胆草种质资源，提升药材品质，满足市场需求，本研究以野生金龙胆草叶片为实验材料，探索了金龙胆草组培快繁体系建立的条件，测定组培苗品质。研究了组织培养过程中各阶段的影响因素，确定了从外植体选择与灭菌到组培苗炼苗与移栽过程中的最适条件，最终成功建立了金龙胆草组培快繁体系，并借助荧光定量PCR技术对不同生长时期组培苗GGPPS基因表达量进行了分析，利用高效液相色谱技术对相应时期的苦蒿素含量进行了检测，最终确定了组培苗苦蒿素含量最高的时期。本研究的主要内容及研究结果如下:
　　1.外植体的选择及灭菌。选择金龙胆草幼嫩叶片为外植体，最适消毒灭菌方法为:70％酒精浸泡并震荡10s后立即用大量无菌水冲洗5次，然后再用0.1％升汞浸泡并震荡8min后，再用大量无菌水冲洗5次。
　　2.培养温度及抗褐化剂浓度的选择。金龙胆草愈伤组织的诱导、分化及分化苗的生根过程中，最适培养温度为20℃。金龙胆草愈伤组织的诱导及分化过程中抗褐化剂为Vc的最适浓度为5.0mg/L。
　　3.愈伤组织的诱导及继代培养。金龙胆草愈伤组织诱导的最适培养基为MS+6-BA0.1mg/L+2，4-D1.0mg/L+Vc5.0mg/L，诱导率为94.44％。金龙胆草愈伤组织的继代培养基与诱导培养基保持一致。
　　4.愈伤组织的分化及继代培养。诱导金龙胆草愈伤组织分化为不定芽的最适培养基为:MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Vc5.0mg/L。金龙胆草不定芽增殖继代培养基为MS+Vc5.0mg/L。
　　5.分化苗的生根培养。诱导金龙胆草分化苗生根的最适培养基为1/2MS+0.1mg/L IBA+0.1mg/L GA3。最快生根时间为5d。
　　6.组培苗的炼苗与移栽。组培苗炼苗的最佳方式为，室温自然光闭瓶放置7d，半开瓶放置2d并保持湿度，揭去瓶盖继续放置3d并保持湿度，逐渐降低湿度放置2d。移栽前用1∶1000的多菌灵泡根，移栽基质为腐殖质∶珍珠岩=2∶1，同时用1∶2000的多菌灵拌匀。移栽后保持湿度7d，逐渐降低湿度放置7d，移栽成活率为96.7％。
　　7.组培苗的鉴别。利用SCAR引物及其方法，提取金龙胆草组培苗基因组DNA进行PCR扩增反应，琼脂糖凝胶电泳结果显示，在500bp左右的位置与野生样有同样大小的特异性条带，表明通过组织培养得到的再生植株是金龙胆草。
　　8.组培苗GGPPS基因表达量分析及苦蒿素含量测定。提取不同生长时期组培金龙胆草叶片总RNA，利用荧光定量PCR对GGPPS基因相对表达量进行分析，结果表明，GGPPS基因相对表达量大小依次为，移栽3个月＞5个月＞7个月＞1个月＞炼苗14d＞未炼苗。同时，提取不同生长时期组培金龙胆草叶片苦蒿素，利用高效液相色谱仪对其含量进行检测分析，结果表明，苦蒿素含量大小依次为，移栽3个月＞5个月＞7个月＞1个月＞炼苗14d＞未炼苗。说明金龙胆草苦蒿素含量最高的时期是移栽种植3～5个月之间。

目录

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摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1．2 生物学特性

1．1．3 化学组成

1．1．4 药理作用

1．1．5 分子生物学研究

1．2 植物组织培养研究现状

1．2．1 植物组织培养的概念

1．2．2 植物组织培养的发展

1．2．3 植物组织培养的应用

1．2．4 植物组织培养的前景展望

1．3 GGPPS基因研究进展

1．3．1 植物中的GGPPS基因

1．3．2 金龙胆草中的GGPPS基因

1．4 研究的目的与意义

第二章 金龙胆草组培快繁体系的建立

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 灭菌条件的选择

2．2．2 外植体的选择

2．2．3 培养温度的选择

2．2．4 抗褐化剂浓度的选择

2．2．5 激素的选择及愈伤组织的诱导和继代

2．2．6 激素的选择及愈伤组织的分化和继代

2．2．7 激素的选择及分化苗的生根

2．2．8 组培苗的炼苗

2．2．9 组培苗的移栽

2．2．10 数据处理

2．3 结果与分析

2．3．1 灭菌条件的选择

2．3．2 外植体的选择

2．3．3 培养温度的选择

2．3．4 抗褐化剂的选择

2．3．5 激素的选择及愈伤组织的诱导和继代

2．3．6 激素的选择及愈伤组织的分化和继代

2．3．7 激素的选择及分化苗的生根

2．3．8 组培苗的炼苗与移栽

2．4 讨论

2．4．1 外植体的选择与灭菌

2．4．2 植物生长调节剂的作用

2．4．3 抗褐化剂的作用

2．4．4 组培苗的炼苗与移栽

第三章 GGPPS基因表达量分析及苦蒿素含量测定

3．1 材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 实验试剂

3．1．3 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 SCAR引物及其方法鉴定金龙胆草组培苗

3．2．2 不同生长时期组培苗GGPPS基因表达量测定方法

3．2．3 不同生长时期组培苗苦蒿素含量测定方法

3．3 结果与分析

3．3．1 SCAR引物及其方法鉴定金龙胆草组培苗

3．3．2 不同生长时期组培苗GGPPS基因表达量分析

3．3．3 不同生长时期组培苗苦蒿素含量测定

3．3．4 GGPPS基因表达量与苦蒿素含量相关性分析

3．4 讨论

结论、创新点与展望

参考文献

致谢

作者简历