一种嗜酸乳酸杆菌连续多批次转化红花籽油合成共轭亚油酸的方法

摘要

本发明提供了一种嗜酸乳酸杆菌连续多批次转化红花籽油合成共轭亚油酸(CLA)的方法。它包括如下步骤：(1)吸附载体的制备；(2)嗜酸乳酸杆菌细胞的吸附固定：(3)红花籽油介质液的制备；(4)连续批次转化红花籽油介质液生成共轭亚油酸。本发明方法连续转化9批次，每次转化率都在70％以上，达到了高密度、多批次转化的目的。本发明制备工艺简单，反应条件温和，得到的共轭亚油酸异构体单一，为CLA的工业生产提供了一种新的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及用嗜酸乳酸杆菌连续多批次转化红花籽油合成共轭亚油酸的方法，属于食品加工技术领域。

背景技术

共轭亚油酸是亚油酸具有共轭双键的所有位置和几何异构体的统称，是近年来新发现的一种功能性油脂。医学研究表明，CLA除了具有很强的抗癌功能，还具有降脂减肥、调节人体代谢、降胆固醇、抗动脉粥样硬化，调节血糖、防治糖尿病、提高免疫力、抗氧化、调高骨骼密度和改善睡眠等功能，因此引起国际医学界、营养学界的广泛关注。大多数食物中含有CLA，但是CLA的含量一般都很低，专家建议，每人每天补充共轭亚油酸的量为1～3克较为适宜，这即使在以乳制品和动物性食品为主食的西方国家也难以达到。因此从天然来源中大量分离得到用于保健等用途的CLA难以满足人们的需求，进行人工合成CLA是很好的解决办法。

目前生产CLA主要采用化学法，特别是LA的碱法异构化，在工业上被广泛采用。但是化学法得到的产物为一系列具有位置和几何异构体的CLA的混合物，还有环化等副产物存在，分离获得单一异构体非常困难。而微生物法反应条件温和、生成的CLA异构体单一，与天然食物中CLA异构体组成相似，有利于产品的开发应用，逐渐得到人们的重视。

近几年来利用微生物静息细胞转化生成CLA为众多研究者所关注，这是由于微生物细胞转化技术操作简单，在反应体系中干扰物质少，不易染菌，更有利于下游的纯化和检测等优点。红花籽油来源广泛，价格比亚油酸低廉，而且是植物油中其亚油酸含量是最高的，约72-85％，这些亚油酸在乳酸菌亚油酸异构酶的作用下可转化生成附加值极高的CLA。

李鹏等研究了用游离态的嗜酸乳酸杆菌转化红花籽油，发酵60h，CLA的合成量为94.7μg/ml。对嗜酸乳酸杆菌进行紫外诱变，并进行响应面法优化后，反应36h，，CLA的合成量为311.79μg/ml(李鹏，产共轭酸菌株的筛选与发酵条件的优化.大连工业大学硕士学位论文，2010年)。可见，游离态的嗜酸乳酸杆菌转化合成CLA的效率并不高，经过诱导得到的菌株，合成CLA的效率增加了2倍多。本领域技术人员公知，紫外诱变是随机事件，不一定能保证得到符合目标的高产菌株。

菌株固定化可进行高密度、多批次的转化，在工业生产中得到越来越多的重视。李垚等进行了嗜酸乳酸杆菌静息细胞转化菜籽油生成共轭亚油酸的实验研究，通过将嗜酸杆菌进行固定化处理，然后加入生物素将嗜酸乳酸杆菌静息细胞透性化处理，可增加细胞通透性。在该研究中，第一批次CLA产量达255.01μg/ml，然而第二、三次产量均有大幅下降，第四次不到150μg/ml，第9次仅为120μg/ml左右(图5.3)，这表明该嗜乳酸杆菌活性下降太快，仍存在改进的空间(李垚，嗜酸乳杆菌静息细胞转化菜籽油生成共轭亚油酸的研究.南昌大学硕士研究生论文，2013年.)。

本领域技术人员公知，微生物的状态，培养基、反应底物的组成，反应条件(温度、pH、含氧量等)等各种因素都会影响微生物的发酵效率、甚至是发酵产物的种类。将嗜酸乳酸杆菌活化后制备种子液、洗涤收集、吸附固定、透性化处理同时转化各类油脂，这中间的每一步都有可能影响最终的转化效率。

目前还没有用固定化嗜酸乳酸杆菌静息细胞研究转化红花籽油合成CLA的报道，是否可以得到一个比较满意的转化效率也不得而知。

发明内容

本发明提供了一种用乳酸菌静息细胞连续多批次转化红花籽油亚油酸合成共轭亚油酸的方法，解决目前生产共轭亚油酸原料紧缺和生产复杂，效率低，得到的CLA结构不单一以及不能满足社会需求等问题。本发明使用的原料红花籽油来源广泛，亚油酸含量丰富，制备工艺温和，操作简单。

本发明提供了一种嗜酸乳酸杆菌连续多批次转化红花籽油合成共轭亚油酸的方法，它包括如下操作步骤：

(1)吸附载体的制备；

(2)嗜酸乳酸杆菌细胞的吸附固定：

(3)红花籽油介质液的制备；

(4)连续批次转化红花籽油介质液生成共轭亚油酸：用步骤(2)吸附固定的嗜酸乳酸杆菌细胞转化步骤(3)制备的红花籽油介质液。

其中，步骤(1)中，吸附载体的制备方法如下：

直径2～4mm的多孔陶粒，先用0.8～1.2mol/L盐酸溶液浸泡12h，再用0.8～1.2mol/L氢氧化钠溶液浸泡10-15h，水洗至中性，烘干备用。

多孔陶粒参考鲍腾等的研究方法制备(鲍腾；陈冬；陈天虎等.铁氧化物生物多孔陶粒的制备工艺及性能，复合材料学报，2014年第2期.)。

优选地，盐酸溶液的浓度为lmol/L，氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L，氢氧化钠溶液的浸泡时间为12h。

其中，步骤(2)中，嗜酸乳酸杆菌细胞的吸附固定方法如下：

嗜酸乳酸杆菌种子液按5％接种量接种至亚油酸含量为0.2mg/mLMRS液体培养基中进行增殖诱导培养，37℃下静置培养20～24h；培养液冷冻离心，离心条件为4000～5000rpm、20～30min、4℃；去上清液，沉淀嗜酸乳酸杆菌细胞用无菌生理盐水洗涤2～3次，离心收集嗜酸乳酸杆菌细胞。

将装有多孔陶粒的反应容器灭菌后，加入离心收集到的嗜酸乳酸杆菌细胞，嗜酸乳酸杆菌细胞的湿重与多孔陶粒干重的比值为(1～1.5)∶(10～15)；然后加入多孔陶粒重量1～1.5倍的生理盐水浸没载体和嗜酸乳酸杆菌细胞；反应容器置于4℃，静置吸附2.5小时，4℃、4000～5000rpm、离心5～10min，弃上清液，沉淀物即为吸附固化的嗜酸乳酸杆菌细胞。

优选地，嗜酸乳酸杆菌的种子液由以下方法制备：从新鲜斜面挑取活化的嗜酸乳酸杆菌接到MRS液体培养基中，37℃，静置培养24～30h，得种子液。

优选地，每升MRS液体培养基中，各组分的用量为：酪蛋白胨10.0～15.0g、牛肉浸膏8.0～12.0g、酵母提取物3.0-6.0g、葡萄糖10.0～15.0g、乙酸钠4.0～6.0g、柠檬酸二胺1.0～3.0g、吐温-800.8～1.2g、磷酸氢二钾1.0～3.0g、硫酸镁0.1～0.3g、硫酸锰0.03～0.06g，余量为水。称取前述各组分，置于2000ml烧杯内，加双蒸水至1000ml，加热，搅拌，直至各组分完全溶解，磷酸钠缓冲溶液调节pH6.3～6.8，121℃高压湿热灭菌20-30min，即得MRS液体培养基。

优选地，种子液接种量为5％，种子液接种至亚油酸含量为0.12mg/mLMRS液体培养基中进行增殖诱导培养；培养液冷冻离心的转速是4000rpm，离心时间是24min。

优选地，嗜酸乳酸杆菌细胞的湿重与多孔陶粒干重的比值为12∶125；生理盐水用量为多孔陶粒等重量；吸附后的离心转速为4000rpm，离心时间为7min。

进一步优选地，种子液制备过程中，静置培养时间为27h。

进一步优选地，每升MRS液体培养基中，各组分的用量为：酪蛋白胨12.0g、牛肉浸膏10.0g、酵母提取物4.5g、葡萄糖12.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-801.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g，余量为水。称取前述各组分，置于2000ml烧杯内，加双蒸水至1000ml，加热，搅拌至各组分完全溶解，磷酸钠缓冲溶液调节pH6.5，121℃高压湿热灭菌25min，即得MRS液体培养基。

其中，步骤(3)中，红花籽油介质液由如下步骤制备：

称取10～15重量份的吐温-80和5～10重量份的司盘-80，混匀，60-80℃水浴3-5min，再加入12～18重量份的红花籽油，加入去离子水，形成油包水型乳化液，至红花籽油终浓度为70-80mg/mL；超声乳化处理，处理条件为300～400W、5～7S、间歇3～5S，重复7～9次，形成稳定的乳浊液，121℃高压湿热灭菌20-30min，即得红花籽油乳化液，4℃保存备用。

取0.1mol/LpH6.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，加入红花籽油乳化液至红花籽油终浓度为7～8mg/mL，加入猪胰脂肪酶2～4mg/30mL，备用。

优选地，吐温-80∶司盘-80∶红花籽油的重量配比为12∶7∶12；红花籽油终浓度为7.5mg/mL；猪胰脂肪酶加入量为3mg/30mL。

其中，步骤(4)中，转化方法为：

反应容器中依次加入吸附固化的嗜酸乳酸杆菌细胞、红花籽油介质液，嗜酸乳酸杆菌细胞与红花籽油介质液的重量体积比为(1～1.5)∶(25～35)g/ml，加入生物素，生物素与红花籽油介质液的重量体积比为(3～6)∶(25～35)mg/ml，混匀，将反应容器置于36℃下，转速为100～150rpm，转化反应20～30h；转化结束后，4℃、4000～5000rpm、离心10～20min，上清液即转化液；转移出上清液进行CLA的提取，然后在该反应容器内加入新鲜的红花籽油介质液，混匀，继续进行下一批次的转化。实际小规模反应常用50ml离心管作为反应容器。

优选地，嗜酸乳酸杆菌细胞与红花籽油介质液的重量体积比为1.2g∶27ml；生物素与红花籽油介质液的重量体积比为4mg∶27ml。

在实际生产过程中，上述各步骤每种物质的用量可以根据需要按比例扩大或缩小。

共轭亚油酸的提取常用正己烷萃取，以5ml转化液的提取为例：取5ml转化液放入60ml梨形分液漏斗中，加入20ml正己烷，震荡混合5min，静置至完全分层后弃去下层水相液体，保留正己烷层和乳化层，加入5ml蒸馏水，混匀1min，洗掉水溶性物质，静置分层，弃掉下层水相，然后把剩下的有机相和乳化层使用装有无水硫酸钠的滤纸过滤、吸水干燥，定容于25ml容量瓶中，摇匀后待测。

共轭亚油酸在232-234nm的紫外区有特征吸收，而亚油酸没有，故常在233nm波长下检测共轭亚油酸的含量。该方法以正己烷为溶剂，配制一系列浓度的共轭亚油酸，以正己烷为参比溶液，在233nm处测其吸光度值，以共轭亚油酸的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线计算发酵液中CLA的含量。发酵前经气相色谱法测得红花籽油含LA为81％，根据下列公式计算LA的转化率：LA转化率＝(生成CLA的量/红花籽油中含有LA的量)*100％。

与现有的技术相比，本发明制备共轭亚油酸具有以下几个优点：

(1)本发明以来源广泛的红花籽油为原料，价格比亚油酸低廉，而且是各类植物油中亚油酸含量是最高的，约72-85％，这些亚油酸在乳酸菌亚油酸异构酶的作用下可转化生成附加值极高的CLA。

(2)选用生物素作为嗜酸乳酸杆菌静息细胞透性化处理，生物素不仅是一种良好的抗氧化剂，同时又可以增加细胞通透性，且简单容易操作；选用合适添加量的生物素，能明显提高转化效率。

(3)将透性化的嗜酸乳酸杆菌细胞采用离心吸附法固定在多空陶粒表面，以便该细胞态亚油酸异构酶能多批次地用于CLA的合成，离心吸附固定技术解决了包埋固定化方法存在物质交换的障碍和操作频繁的难题，同时克服了吸附固定化方法吸附量小，细胞容易脱落的特点，达到高密度、多批次转化的目的。

附图说明

图1共轭亚油酸的紫外标准曲线

图2嗜酸乳酸菌细胞连续多批次转化合成CLA的转化率

具体实施方式

实施例1：嗜酸乳酸菌细胞连续多批次转化合成CLA的效率研究

1.1试验方法：

(1)培养基的配制

MRS培养基主要包括液体MRS培养基和固体MRS培养基。

MRS液体培养基的制备：酪蛋白胨12.0g、牛肉浸膏10.0g、酵母提取物4.5g、葡萄糖12.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-801.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g，将上述药品称量好放在2000ml烧杯内，加双蒸水至1000ml，在电子万用炉上加热，用玻璃棒搅拌直至药品全部溶解，液体呈透明的棕黄色时停止，用磷酸钠缓冲溶液调节pH6.5，121℃高压湿热灭菌25min。

固体MRS培养基的配制方法是在上述基础上，再加入12.0g琼脂。

(2)吸附载体的制备

多孔陶粒，直径2～4mm，先用1.0mol/L盐酸溶液浸泡12h，再用1.0mol/L氢氧化钠溶液浸泡12h，水洗至中性，烘干备用。

多孔陶粒参考鲍腾等的研究方法制备(鲍腾；陈冬；陈天虎等.铁氧化物生物多孔陶粒的制备工艺及性能，复合材料学报，2014年第2期.)。

(3)红花籽油的乳化液的制备

称取1.2g吐温-80和0.7g司盘-80，混匀，然后70℃水浴4min，再加入1.5g红花籽油，逐渐滴加去离子水，形成油包水型乳化液，至红花籽油终浓度为75mg/mL。超声乳化处理(300W，超声6S，间歇6S，重复8次)，形成稳定的乳浊液，121℃高压湿热灭菌24min，4℃保存备用。

(4)红花籽油介质液的制备

取0.1mol/LpH6.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，加入红花籽油乳化液至红花籽油终浓度为7.5mg/mL，加入猪胰脂肪酶3mg/30mL，备用。

(5)乳酸菌细胞的收集

从新鲜斜面挑取一环活化菌种接到250mLMRS培养基中，37℃下静置培养27h，即为种子液。按5％接种量接种至亚油酸含量为0.2mg/mLMRS培养基中进行增殖诱导培养，37℃下静置培养27h。培养液冷冻离心(4000rpm，离心时间24min，4℃)，去上清液，沉淀细胞用无菌生理盐水洗涤2次，离心收集细胞。

(6)乳酸菌细胞的离心吸附固定

将灭完菌装有12.5g多孔陶粒的50ml离心管放置离心管架上，每支管中加入湿重1.2g乳酸菌细胞，然后加入15ml生理盐水浸没载体和细胞，在4℃冰箱中静置吸附2.5小时，离心(4000rpm，离心时间7min，4℃)，吸出上清液，沉淀物即为吸附固化的乳酸菌细胞。

(7)固化乳酸菌细胞连续批次转化红花籽油生成共轭亚油酸

在有固定化乳酸菌的沉淀物离心管中加入27ml红花籽油介质液，加入4.5mg生物素透性化处理与转化同步进行，混匀，将离心管置于36℃下，转速为120rpm，转化反应24h。转化结束后，取出离心管放入离心机(4000rpm，离心时间15min，4℃)离心。上清液即转化液，倾出可进行CLA的提取，然后在该离心管内加入新鲜的红花籽油介质液，混匀，继续进行下一个批次的转化。

(8)共轭亚油酸的提取

取5ml转化液放入60ml梨形分液漏斗中，加入20ml正己烷，震荡混合5min，静置至完全分层后弃去下层水相液体，保留正己烷层和乳化层，加入5ml蒸馏水，混匀1min，洗掉水溶性物质，静置分层，弃掉下层水相，然后把剩下的有机相和乳化层使用装有无水硫酸钠的滤纸过滤、吸水干燥，定容于25ml容量瓶中，摇匀后待测。

(9)紫外检测法测定红花籽油的转化率

利用共轭亚油酸在232～234nm的紫外区有特征吸收，而亚油酸没有的特性，在233nm波长下检测共轭亚油酸的含量。以正己烷为溶剂，配制一系列浓度的共轭亚油酸，以正己烷为参比，在233nm处测其吸光度值，以共轭亚油酸的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

发酵前经气相色谱法测得红花籽油含LA为81％，根据下列公式计算LA的转化率：LA转化率＝(生成CLA的量/红花籽油中含有LA的量)*100％。

1.2实验结果

(1)标准曲线的绘制：

如图1所示，对曲线进行线性回归，得到共轭亚油酸的标准曲线：R²＝0.9995，y＝70.286x-0.0037。

(2)发酵液中CLA转化率的计算：

嗜酸乳酸菌细胞经吸附固定化及透性处理后，进行了多批次连续转化，结果见图2。由图2可知，前九次的转化率保持在70％以上。以第9次的转化数据来看，本发明合成的CLA含量为4.25mg/mL，远远高于现有文献中各种转化方法合成CLA的得率。

本发明中的各实验步骤和具体的实验条件参数协同配合，使得嗜酸乳酸杆菌可以重复、稳定、多批次转化红花籽油合成共轭亚油酸，效率高、成本低，为共轭亚油酸的高效人工合成提供了一种新的选择。