法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-04-20
授权
授权
2016-04-20
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N33/00 申请日:20140326
实质审查的生效
2015-12-09
公开
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相关申请的交叉参考
本申请要求2013年12月11日提交的临时美国申请61/914,619号和 2013年3月27日提交的临时美国申请61/805,860号的优先权，二者在此 以其整体引入作为参考。
序列表
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技术领域
提供评估或监测效应、效力、对治疗的反应性和/或确定用于治疗胃肠 炎性病症(例如炎性肠病)的治疗剂如整联蛋白β7拮抗剂的剂量或给药 方案的方法。在某些方面，提供用整联蛋白β7拮抗剂在结肠淋巴细胞上 对含有整联蛋白β7亚基的受体的占据作为治疗的效应、效力或对治疗的 反应性的指示物(“生物标志物”)，和/或作为确定用于治疗胃肠炎性病症 的治疗剂如β7整联蛋白拮抗剂的剂量或给药方案的工具的方法。在某些 方面，提供通过测量一个或多个整联蛋白受体配体、淋巴细胞基因、细胞 因子基因的基因表达水平或肠隐窝上皮中αE阳性细胞的数目来评估β7 整联蛋白拮抗剂的效应、效力或对β7整联蛋白拮抗剂的反应性的方法。
背景技术
炎性肠病(IBD)是胃肠(GI)道的慢性炎性自身免疫病症，其在临 床上表现为溃疡性结肠炎(UC)或克隆病(CD)。CD是具有影响整个胃 肠道的任意部分的潜能的慢性透壁性炎性疾病，而UC是结肠的黏膜炎症。 两种病症在临床上都表征为频繁排便、营养不良和脱水，伴随日常生活活 动的破坏。CD常并发吸收不良、狭窄和瘘的发展，可以需要反复手术。 较少见的UC可以并发严重的血性腹泻和中毒性巨结肠，也需要手术。两 种IBD病症都与提高的胃肠道恶性肿瘤风险相关。IBD的病因复杂，发病 机制的许多方面仍不清楚。
中度至严重IBD的治疗向治疗医生提出了巨大的挑战，因为使用皮质 类固醇的常规疗法和免疫调节剂疗法(例如硫唑嘌呤、6巯基嘌呤和氨甲 喋呤)与副作用和不耐受相关，且未在维持疗法(类固醇)中显示经证明 的益处。靶向肿瘤坏死因子α(TNF-α)的单克隆抗体(如英利昔单抗 (Infliximab)(嵌合抗体)和阿达木单抗(adalimumab)(全人抗体))目 前用于CD的治疗。英利昔单抗还已显示效力，并被批准用于UC。但是， 约10％-20％的CD患者对抗TNF疗法是初级无响应者，另外～20％-30％ 的CD患者随时间推移而失去响应(Schnitzler等,Gut58:492-500(2009))。 与抗TNF相关的其他不良事件(AE)包括细菌感染(包括结核病)及更 罕见的淋巴瘤和脱髓鞘的比例提高(Chang等,NatClinPract GastroenterolHepatology3:220(2006)；Hoentjen等,WorldJ. Gastroenterol.15(17):2067(2009))。目前没有可用的疗法在超过20％-30％ 患有慢性疾病的IBD患者中达到持续缓解(Hanauer等,Lancet 359:1541-49(2002)；Sandborn等,NEnglJMed353:1912-25(2005))。此 外，大多数患者未达到持续的无类固醇缓解和黏膜愈合(与真实的疾病改 变相关的临床结果)。因此，存在发展针对慢性用途优化的靶向性更强的 IBD疗法的需要：改善的具有持续缓解(尤其是无类固醇缓解)的安全性 谱及在更大比例的患者(包括从未响应抗TNF治疗剂或随时间推移失去响 应的那些患者)中预防长期并发症。
整联蛋白是在包括白细胞黏附、信号发放、增殖和迁移的许多细胞过 程中，以及在基因调节中发挥作用的α/β异二聚体细胞表面糖蛋白受体 (Hynes,R.O.,Cell,1992,69:11-25；和Hemler,M.E.,Annu.Rev. Immunol.,1990,8:365-368)。它们由特异性结合内皮、上皮上的不同细胞 黏附分子(CAM)和胞外基质蛋白的两个异二聚体、非共价相互作用并跨 膜的亚基组成。在这种方式中，整联蛋白可以作为组织特异性细胞黏附受 体发挥作用，该受体辅助以高度调节的方式从血液招募白细胞进入几乎所 有组织部位，在白细胞返回正常组织和炎症部位中发挥作用(vonAndrian 等,NEnglJMed343:1020–34(2000))。在免疫系统中，整联蛋白在炎症过 程中涉及白细胞运输、黏附和浸润(Nakajima,H.等,J.Exp.Med.,1994, 179:1145-1154)。整联蛋白的差异表达调节细胞的黏附特性，不同整联蛋 白涉及不同的炎症反应。(Butcher,E.C.等,Science,1996,272:60-66)。含 有β7的整联蛋白(即α4β7和αEβ7)主要在单核细胞、淋巴细胞、嗜酸 性粒细胞、嗜碱性粒细胞和巨噬细胞上表达，而不在嗜中性粒细胞上表达 (Elices,M.J.等,Cell,1990,60:577-584)。
α4β7整联蛋白是在细胞向肠黏膜及相关淋巴组织(如小肠中的淋巴集 结、大肠中的淋巴小结和肠系膜淋巴结)迁移中重要的白细胞归巢受体。 在肠中，白细胞翻滚并紧紧黏附于黏膜内皮由来自趋化因子的信号起始， 并由黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM)-1相关唾液酰LewisX介导。 趋化因子信号发放诱导α4β7整联蛋白经历从低MAdCAM-1结合亲和力至 高MAdCAM-1结合亲和力的变化。然后白细胞停滞，并开始通过血管内 皮外渗至下层组织的过程。认为此外渗过程在正常免疫细胞再循环状态中 及在炎性病症中都发生(vonAndrian等,上文)。浸润物中α4β7+细胞的 数目及配体MAdCAM-1的表达在诸如UC或CD患者的肠道的慢性炎症 部位处更高(Briskin等,AmJPathol151:97–110(1997)；Souza等,Gut 45:856-63(1999))。α4β7优先结合表达MAdCAM-1和血管细胞黏附分子 (VCAM)-1的高内皮小静脉，以及胞外基质分子纤连蛋白片段CS-1 (Chan等,JBiolChem267:8366–70(1992)；Ruegg等,JCellBiol 17:179–89(1992)；Berlin等,Cell74:185–95(1993))。α4β7整联蛋白与肠 黏膜血管中组成性表达的MAdCAM-1一起在白细胞肠向性中发挥选择性 作用，但似乎不促成白细胞返回外周组织或CNS。相反，外周淋巴运输与 α4β1与VCAM-1的相互作用相关(Yednock等,Nature356:63-6(1992)； Rice等,Neurology64:1336–42(2005))。
仅在T淋巴细胞上表达且与黏膜组织相关的β7整联蛋白家族的另一 成员是αEβ7整联蛋白，或称为CD103。αEβ7整联蛋白选择性结合上皮 细胞上的E钙黏着蛋白，已提出其在黏膜组织中的T细胞在上皮内淋巴细 胞区室中的停留中发挥作用(Cepek等,JImmunol150:3459-70(1993)； Karecla等EurJImmunol25:852–6(1995))。已报道固有层中的αEβ7+细 胞对应激或感染的上皮细胞显示细胞毒性(Hadley等,JImmunol 159:3748–56(1997)；Buri等,JPathol206:178–85(2005))。CD中αEβ7 的表达提高(Elewaut等,ActaGastroenterolBelg61:288–94(1998)； Oshitani等,IntJMolMed12:715–9(2003))，已报道抗-αEβ7抗体治疗在 小鼠中减弱实验性结肠炎，暗示αEβ7+淋巴细胞在IBD的实验模型中的作 用(Ludviksson等,JImmunol162:4975–82(1999))。
据报道，施用抗αEβ7的单克隆抗体在IL-2-/-小鼠中预防和改善免疫 诱发的结肠炎，表明炎性肠病的发病和保持依赖于表达αEβ7的固有层 CD4+淋巴细胞的结肠定位(Ludviksson等,JImmunol.1999, 162(8):4975-82)。据报道，抗-α4抗体(natalizumab)在CD患者的治疗 中具有效力(Sandborn等,NEnglJMed2005；353:1912-25)，据报道，抗 -α4β7抗体(MLN-02，MLN0002，vedolizumab)在UC患者中有效(Feagan 等,NEnglJMed2005；352:2499-507)。这些发现将α4β7确认为治疗靶点， 并支持α4β7和MAdCAM-1之间的相互作用介导IBD的发病机制的观点。 因此，β7整联蛋白的拮抗剂具有在治疗IBD中作为治疗剂的巨大潜能。
之前已描述了靶向β7整联蛋白亚基的人源化单克隆抗体。见例如国 际专利公开号WO2006/026759。一个这种抗体rhuMAbβ7(etrolizumab) 衍生自大鼠抗-小鼠/人单克隆抗体FIB504(Andrew等1994)。将它改造 为包含人IgG1重链和κ1轻链的构架。国际专利公开号WO2006/026759。
RhuMAbβ7结合在肠黏膜中分别调节淋巴细胞亚群的运输和停留的 α4β7(Holzmann等,Cell56:37-46(1989)；Hu等,ProcNatlAcadSciUSA 89:8254-8(1992))和αEβ7(Cepek等,JImmunol150:3459-70(1993))。 临床研究已证明抗α4抗体(natalizumab)对CD的治疗的效力(Sandborn 等,NEnglJMed353:1912-25(2005))，在UC的治疗中已针对抗α4β7抗 体(LDP02/MLN02/MLN0002/vedolizumab)报道了振奋人心的结果 (Feagan等,NEnglJMed352:2499-507(2005))。这些发现有助于将α4β7 确认为潜在的治疗靶点，并支持α4β7和黏膜地址素细胞黏附分子1 (MAdCAM1)之间的相互作用促成炎性肠病(IBD)的发病机制的假说。
与结合α4并因此结合α4β1和α4β7二者的natalizumab不同，rhuMAb β7特异性结合α4β7和αEβ7的β7亚基，而不结合α4或β1整联蛋白单个 亚基。这通过该抗体在高达100nM的浓度下也不能抑制α4β1+α4β7– Ramos细胞与血管细胞黏附分子1(VCAM1)的黏附得到了证明。重要 的是，rhuMAbβ7的此特征表明选择性：表达α4β1但不表达β7的T细 胞亚群应不直接受rhuMAbβ7影响。
rhuMAbβ7对淋巴细胞归巢的肠特异性作用的支持来自几项体内非 临床研究。在用CD45RB高CD4+T细胞重建的严重联合免疫缺陷(SCID) 小鼠(结肠炎的动物模型)中，rhuMAbβ7阻断放射性标记的淋巴细胞向 发炎的结肠归巢，但不阻断向外周淋巴器官脾归巢。见例如国际专利公开 号WO2006/026759。此外，大鼠-小鼠嵌合抗-鼠β7(抗β7，muFIB504) 不能在患有实验性自身免疫性脑炎(EAE)的髓鞘碱性蛋白T细胞受体 (MBP-TCR)转基因小鼠(多发性硬化的动物模型)中降低中枢神经系 统(CNS)炎症的组织学程度或改善疾病存活。Id.此外，在食蟹猕猴 (cynomolgusmonkey)中的两项安全性研究中，rhuMAbβ7诱导外周血 淋巴细胞数目的中度提高，其主要由CD45RAˉβ7高外周血T细胞(在表 型上类似于人类中的肠归巢记忆/效应T细胞的亚群)的显著(约3至6 倍)提高引起。见例如国际专利公开号WO2009/140684；Stefanich等,Br. J.Pharmacol.,162:1855-1870(2011).。相反，rhuMAbβ7对CD45RA+β7 中间外周血T细胞(在表型上类似于人类中的幼稚T细胞的亚群)的数目具 有最小的影响或无影响，且对CD45RAˉβ7低外周血T细胞(在表型上类 似于人类中的外周归巢记忆/效应T细胞的亚群)的数目无影响，确认了 rhuMAbβ7对肠归巢淋巴细胞亚群的特异性。国际专利公开号 WO2009/140684；Stefanich等,Br.J.Pharmacol.,.162:1855-1870(2011)。
为了设计具有想要的效应和/或效力的疗法，很重要的是评估患者对用 治疗剂，例如β7整联蛋白拮抗剂的治疗的反应。还重要的是确定将提供 或可能提供效力的β7整联蛋白拮抗剂的最佳剂量和给药方案。因此，需 要开发可以用于精确跟踪或监测患者对治疗剂的治疗的反应的生物标志 物。此类生物标志物对于在临床实验研究中为人患者或为疾病治疗设计有 效的治疗和给药方案是特别有用的。
本文所述的发明满足上述需要的某种，并提供其他益处。
本文引用的所有参考文献(包括专利申请和公开)为了所有目的以其 整体引入作为参考。
发明概述
本发明方法至少部分地基于这样的发现，即自整联蛋白β7拮抗剂(例 如抗-β7抗体)-治疗的患者的结肠组织获得的淋巴细胞上包含整联蛋白β 7-亚基的受体(包括αEβ7)的受体占据和细胞表面表达能够被流式细胞 术方法评估。此外，令人惊讶地，抗-β7抗体血清浓度(能够在治疗的患 者的外周中饱和淋巴细胞β7受体)基本与能够在疾病位点(结肠中)饱 和淋巴细胞β7受体的抗-β7抗体血清浓度相同。因此，外周血中β7受 体占据是结肠组织中β7受体占据的替代指示物。此外，本发明的方法至 少部分地基于下述发现，即在肠隐窝上皮中整联蛋白受体配体、淋巴细胞 基因和细胞因子基因的基因表达水平以及αE-阳性细胞的数量在用整联蛋 白β7拮抗剂治疗后改变。
在一方面，提供了测定或监测整联蛋白β7拮抗剂在治疗患者中的胃 肠炎性病症中的效力或辅助测定或监测整联蛋白β7拮抗剂在治疗患者中 的胃肠炎性病症中的效力的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将在 用所述拮抗剂治疗之后或期间从所述患者获得的样品中生物标志物的量与 在治疗之前从所述患者获得的样品中生物标志物的量相比较，其中与治疗 之前相比，生物标志物的量在治疗之后或期间的变化是所述拮抗剂在治疗 所述患者中的胃肠病症中的效力的指示，且其中生物标志物是所述拮抗剂 在结肠淋巴细胞上对含有整联蛋白β7亚基的受体的占据。在某些实施方 案中，生物标志物选自一个或多个整联蛋白受体配体的基因表达水平、一 个或多个淋巴细胞基因的基因表达水平、一个或多个细胞因子的基因表达 水平、和肠隐窝上皮中αE阳性细胞的数目。在某些实施方案中，评估了 上述生物标志物的组合。在某些实施方案中，前述使用一个或多个生物标 志物(选自拮抗剂在结肠淋巴细胞上对含有整联蛋白β7亚基的受体的占 据、一个或多个整联蛋白受体配体的基因表达水平、一个或多个淋巴细胞 基因的基因表达水平、一个或多个细胞因子的基因表达水平、和肠隐窝上 皮中αE阳性细胞的数目)的方法与一种或多种额外的效力生物标志物组 合。在某些实施方案中，一个或多个额外的效力生物标志物是一个或多个 临床生物标志物，选自第6周的临床缓解、第10周临床缓解、第6周临床 反应、第10周临床反应、第6周内窥镜检查得分和直肠出血得分为0、第 10周内窥镜检查和直肠出血得分为0以及在实现反应或缓解后的至UC潮 红的时间。在某些实施方案中，包含整联蛋白β7亚基的受体是αEβ7受 体或α4β7受体。在一个实施方案中，在结肠淋巴细胞上包含整联蛋白β 7亚基的受体占据通过测量在外周血淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的 受体占据来测定，其中预先确定外周血淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基 的受体占据与结肠淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据基本相 同。在某些实施方案中，通过方法测定包含整联蛋白β7亚基的受体占据， 所述方法包括温育淋巴细胞与标记的抗-β7抗体(其中标记的抗-β7抗体 与整联蛋白β7拮抗剂结合相同的表位)、洗涤淋巴细胞和通过流式细胞术 测量标记的淋巴细胞的百分数。在某些实施方案中，标记选自异硫氰酸荧 光素(FITC)、罗丹明、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻素叶 绿素蛋白质(PerCP)、PE-Cy7,APC-Cy7和APC-H7。在一个实施方案中， 整联蛋白β7拮抗剂是etrolizumab并且标记的抗-β7抗体是etrolizumab 或FIB504。在一些实施方案中，测量了整联蛋白受体配体MadCAM-1的 基因表达水平。在一些实施方案中，测量了整联蛋白受体配体E-钙黏着蛋 白的水平。在一些实施方案中，测量了选自CD19、CD8和CD3ε的一个 或多个淋巴细胞基因的基因表达的水平。在一些实施方案中，测量了选自 IL-1β,IL-6,IL-12-p40,IL-17A,IL-17-F,IL-23A,IFNγ和TNFα的一个 或多个细胞因子的基因表达水平。在某些实施方案中，在结肠活组织检查 组织中测量基因表达的水平。在某些实施方案中，通过qPCR测量基因表 达水平。在某些实施方案中，生物标志物的改变是增加或减少。在某些实 施方案中，在接受拮抗剂第一次给药后100天内测量生物标志物。在某些 实施方案中，在接受拮抗剂第一次给药后第43天和第71天测量生物标志 物或者在接受拮抗剂第一次给药后的第6周和第10周测量生物标志物。在 一个实施方案中，胃肠炎性病症是炎性肠病。示例性的炎性肠病包括溃疡 性结肠炎和克隆病。在某些实施方案中，患者是人。
在另一方面，提供了测定或监测患有胃肠炎性病症的患者对用整联蛋 白β7拮抗剂治疗的反应或辅助测定或监测患有胃肠炎性病症的患者对用 整联蛋白β7拮抗剂治疗的反应的方法。在某些实施方案中，所述方法包 括将在用所述拮抗剂治疗之后或期间从所述患者获得的样品中生物标志物 的量与在治疗之前从所述患者获得的样品中生物标志物的量相比较，其中 与治疗之前相比，生物标志物的量在治疗之后或期间的变化是患者对用拮 抗剂治疗的反应的指示，且其中生物标志物是所述拮抗剂在结肠淋巴细胞 上对含有整联蛋白β7亚基的受体的占据。在某些实施方案中，生物标志 物选自一个或多个整联蛋白受体配体的基因表达水平、一个或多个淋巴细 胞基因的基因表达水平、一个或多个细胞因子的基因表达水平、和肠隐窝 上皮中αE阳性细胞的数目。在某些实施方案中，评估了上述生物标志物 的组合。在某些实施方案中，前述使用一个或多个生物标志物(选自拮抗 剂在结肠淋巴细胞上对含有整联蛋白β7亚基的受体的占据、一个或多个 整联蛋白受体配体的基因表达水平、一个或多个淋巴细胞基因的基因表达 水平、一个或多个细胞因子的基因表达水平、和肠隐窝上皮中αE阳性细 胞的数目)的方法与一种或多种额外的效力生物标志物组合。在某些实施 方案中，一个或多个额外的效力生物标志物是一个或多个临床生物标志物， 选自第6周的临床缓解、第10周临床缓解、第6周临床反应、第10周临 床反应、第6周内窥镜检查得分和直肠出血得分为0、第10周内窥镜检查 和直肠出血得分为0以及在实现反应或缓解后的至UC潮红的时间。在某 些实施方案中，包含整联蛋白β7亚基的受体是αEβ7受体或α4β7受 体。在一个实施方案中，在结肠淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体 占据通过测量在外周血淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据来测 定，其中预先确定外周血淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据与 结肠淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据基本相同。在某些实施 方案中，通过方法测定包含整联蛋白β7亚基的受体占据，所述方法包括 温育淋巴细胞与标记的抗-β7抗体(其中标记的抗-β7抗体与整联蛋白β 7拮抗剂结合相同的表位)、洗涤淋巴细胞和通过流式细胞术测量标记的淋 巴细胞的百分数。在某些实施方案中，标记选自异硫氰酸荧光素(FITC)、 罗丹明、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻素叶绿素蛋白质 (PerCP)、PE-Cy7,APC-Cy7和APC-H7。在一个实施方案中，整联蛋白 β7拮抗剂是etrolizumab并且标记的抗-β7抗体是etrolizumab或 FIB504。在一些实施方案中，测量了整联蛋白受体配体MadCAM-1的基 因表达水平。在一些实施方案中，测量了整联蛋白受体配体E-钙黏着蛋白 的水平。在一些实施方案中，测量了选自CD19、CD8和CD3ε的一个或 多个淋巴细胞基因的基因表达的水平。在一些实施方案中，测量了选自 IL-1β,IL-6,IL-12-p40,IL-17A,IL-17-F,IL-23A,IFNγ和TNFα的一个 或多个细胞因子的基因表达水平。在某些实施方案中，在结肠活组织检查 组织中测量基因表达的水平。在某些实施方案中，通过qPCR测量基因表 达水平。在某些实施方案中，生物标志物的改变是增加或减少。在某些实 施方案中，在接受拮抗剂第一次给药后100天内测量生物标志物。在某些 实施方案中，在接受拮抗剂第一次给药后第43天和第71天测量生物标志 物或者在接受拮抗剂第一次给药后的第6周和第10周测量生物标志物。在 一个实施方案中，胃肠炎性病症是炎性肠病。示例性的炎性肠病包括溃疡 性结肠炎和克隆病。在某些实施方案中，患者是人。
在还另一方面，提供了在安慰剂对照的临床实验中测定或监测整联蛋 白β7拮抗剂在治疗拮抗剂治疗的患者中的胃肠炎性病症中的效力的方法。 在某些实施方案中，所述方法包括将在用所述拮抗剂治疗之后或期间从所 述患者获得的样品中生物标志物的量与从安慰剂治疗的患者获得的样品中 生物标志物的量相比较，其中与安慰剂治疗的患者中的生物标志物的量相 比，在拮抗剂治疗的患者中生物标志物的量在治疗之后或期间的变化是所 述拮抗剂在治疗拮抗剂治疗的患者中的胃肠病症中的效力的指示，且其中 生物标志物是所述拮抗剂在结肠淋巴细胞上对含有整联蛋白β7亚基的受 体的占据。在某些实施方案中，生物标志物选自一个或多个整联蛋白受体 配体的基因表达水平、一个或多个淋巴细胞基因的基因表达水平、一个或 多个细胞因子的基因表达水平、和肠隐窝上皮中αE阳性细胞的数目。在 某些实施方案中，包含整联蛋白β7亚基的受体是αEβ7受体或α4β7 受体。在一个实施方案中，在结肠淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受 体占据通过测量在外周血淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据来 测定，其中预先确定外周血淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据 与结肠淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据基本相同。在某些实 施方案中，通过方法测定包含整联蛋白β7亚基的受体占据，所述方法包 括温育淋巴细胞与标记的抗-β7抗体(其中标记的抗-β7抗体与整联蛋白 β7拮抗剂结合相同的表位)、洗涤淋巴细胞和通过流式细胞术测量标记的 淋巴细胞的百分数。在某些实施方案中，标记选自异硫氰酸荧光素(FITC)、 罗丹明、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻素叶绿素蛋白质 (PerCP)、PE-Cy7,APC-Cy7和APC-H7。在一个实施方案中，整联蛋白 β7拮抗剂是etrolizumab并且标记的抗-β7抗体是etrolizumab或 FIB504。在一些实施方案中，测量了整联蛋白受体配体MadCAM-1的基 因表达水平。在一些实施方案中，测量了整联蛋白受体配体E-钙黏着蛋白 的水平。在一些实施方案中，测量了选自CD19、CD8和CD3ε的一个或 多个淋巴细胞基因的基因表达的水平。在一些实施方案中，测量了选自 IL-1β,IL-6,IL-12-p40,IL-17A,IL-17-F,IL-23A,IFNγ和TNFα的一个 或多个细胞因子的基因表达水平。在某些实施方案中，在结肠活组织检查 组织中测量基因表达的水平。在某些实施方案中，通过qPCR测量基因表 达水平。在某些实施方案中，生物标志物的改变是增加或减少。在某些实 施方案中，在接受拮抗剂第一次给药后100天内测量生物标志物。在某些 实施方案中，在接受拮抗剂第一次给药后第43天和第71天测量生物标志 物或者在接受拮抗剂第一次给药后的第6周和第10周测量生物标志物。在 某些实施方案中，评估了上述生物标志物的组合。在某些实施方案中，所 述方法还包括评估一个或多个临床效力生物标志物，所述生物标志物选自 第6周的临床缓解、第10周临床缓解、第6周临床反应、第10周临床反 应、第6周内窥镜检查得分和直肠出血得分为0、第10周内窥镜检查和直 肠出血得分为0以及在实现反应或缓解后的至UC潮红的时间。在一个实 施方案中，胃肠炎性病症是炎性肠病。示例性的炎性肠病包括溃疡性结肠 炎和克隆病。在某些实施方案中，患者是人。
在还另一方面，提供了测定或监测患有胃肠炎性病症的患者对用整联 蛋白β7拮抗剂的治疗的反应的方法，其中患者在安慰剂对照的临床实验 中。在某些实施方案中，所述方法包括将在用所述拮抗剂治疗之后或期间 从所述患者获得的样品中生物标志物的量与从安慰剂治疗的患者获得的样 品中生物标志物的量相比较，其中与安慰剂治疗的患者中的生物标志物的 量相比，在拮抗剂治疗的患者中生物标志物的量在治疗之后或期间的变化 是患者对用拮抗剂治疗的反应的指示，且其中生物标志物是所述拮抗剂在 结肠淋巴细胞上对含有整联蛋白β7亚基的受体的占据。在某些实施方案 中，生物标志物选自一个或多个整联蛋白受体配体的基因表达水平、一个 或多个淋巴细胞基因的基因表达水平、一个或多个细胞因子的基因表达水 平、和肠隐窝上皮中αE阳性细胞的数目。在某些实施方案中，包含整联 蛋白β7亚基的受体是αEβ7受体或α4β7受体。在一个实施方案中，在 结肠淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据通过测量在外周血淋巴 细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据来测定，其中预先确定外周血淋 巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据与结肠淋巴细胞上包含整联蛋 白β7亚基的受体占据基本相同。在某些实施方案中，通过方法测定包含 整联蛋白β7亚基的受体占据，所述方法包括温育淋巴细胞与标记的抗-β 7抗体(其中标记的抗-β7抗体与整联蛋白β7拮抗剂结合相同的表位)、 洗涤淋巴细胞和通过流式细胞术测量标记的淋巴细胞的百分数。在某些实 施方案中，标记选自异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、藻红蛋白(PE)、 别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻素叶绿素蛋白质(PerCP)、PE-Cy7,APC-Cy7 和APC-H7。在一个实施方案中，整联蛋白β7拮抗剂是etrolizumab并且 标记的抗-β7抗体是etrolizumab或FIB504。在一些实施方案中，测量了 整联蛋白受体配体MadCAM-1的基因表达水平。在一些实施方案中，测 量了整联蛋白受体配体E-钙黏着蛋白的水平。在一些实施方案中，测量了 选自CD19、CD8和CD3ε的一个或多个淋巴细胞基因的基因表达的水平。 在一些实施方案中，测量了选自IL-1β,IL-6,IL-12-p40,IL-17A,IL-17-F, IL-23A,IFNγ和TNFα的一个或多个细胞因子的基因表达水平。在某些 实施方案中，在结肠活组织检查组织中测量基因表达的水平。在某些实施 方案中，通过qPCR测量基因表达水平。在某些实施方案中，生物标志物 的改变是增加或减少。在某些实施方案中，在接受拮抗剂第一次给药后100 天内测量生物标志物。在某些实施方案中，在接受拮抗剂第一次给药后第 43天和第71天测量生物标志物或者在接受拮抗剂第一次给药后的第6周 和第10周测量生物标志物。在某些实施方案中，评估了上述生物标志物的 组合。在某些实施方案中，所述方法还包括评估一个或多个临床效力生物 标志物，所述生物标志物选自第6周的临床缓解、第10周临床缓解、第6 周临床反应、第10周临床反应、第6周内窥镜检查得分和直肠出血得分为 0、第10周内窥镜检查和直肠出血得分为0以及在实现反应或缓解后的至 UC潮红的时间。在一个实施方案中，胃肠炎性病症是炎性肠病。示例性 的炎性肠病包括溃疡性结肠炎和克隆病。在某些实施方案中，患者是人。
在还另一方面，提供了测定整联蛋白β7拮抗剂在治疗患者中的胃肠 炎性病症中的给药的方法。在某些实施方案中，所述方法包括基于在用所 述拮抗剂的剂量或给药方案治疗之后或期间从所述患者获得的样品中生物 标志物的量与在治疗之前从所述患者获得的样品中生物标志物的量的比 较，调节拮抗剂的给药，其中与治疗之前相比，生物标志物的量在治疗之 后或期间的变化是在治疗所述患者中的胃肠病症中的所述拮抗剂的效力或 对所述拮抗剂的剂量或给药方案的反应的指示，且其中生物标志物是所述 拮抗剂在结肠淋巴细胞上对含有整联蛋白β7亚基的受体的占据。在某些 实施方案中，包含整联蛋白β7亚基的受体是αEβ7受体或α4β7受体。 在一个实施方案中，在结肠淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据 通过测量在外周血淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据来测定， 其中预先确定外周血淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据与结肠 淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据基本相同。在某些实施方案 中，通过方法测定包含整联蛋白β7亚基的受体占据，所述方法包括温育 淋巴细胞与标记的抗-β7抗体(其中标记的抗-β7抗体与整联蛋白β7拮 抗剂结合相同的表位)、洗涤淋巴细胞和通过流式细胞术测量标记的淋巴细 胞的百分数。在某些实施方案中，标记选自异硫氰酸荧光素(FITC)、罗 丹明、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻素叶绿素蛋白质(PerCP)、 PE-Cy7,APC-Cy7和APC-H7。在一个实施方案中，整联蛋白β7拮抗剂 是etrolizumab并且标记的抗-β7抗体是etrolizumab或FIB504。在一个 实施方案中，占据的改变是增加或减少。在一个实施方案中，在接受拮抗 剂第一次给药后100天内测量占据。在一个实施方案中，在第43天和第 71天测量占据。在一个实施方案中，胃肠炎性病症是炎性肠病。示例性的 炎性肠病包括溃疡性结肠炎和克隆病。在某些实施方案中，患者是人。在 一个实施方案中，拮抗剂是抗-β7抗体并且根据剂量或给药方案的效力或 对剂量或给药方案的反应的指示确定的给药或给药方案包括皮下施用第一 次负载剂量420mg抗-β7抗体，之后在2周后皮下施用第一次维持剂量 315mg抗-β7抗体(或标称剂量300mg)，之后皮下施用一个或多个随后 的维持剂量315mg抗-β7抗体(或标称剂量300mg)，其中每个随后的维 持剂量在前一次维持剂量后4周施用。在一个实施方案中，根据剂量或给 药方案的效力或对剂量或给药方案的反应的指示所确定的给药或给药方案 包括每4周皮下施用105mg抗-β7抗体(或标称剂量100mg)或每2周 50mg抗-β7抗体(标称剂量)。在一个实施方案中，抗-β7抗体是 etrolizumab。
在还另一方面，提供了测定整联蛋白β7拮抗剂在治疗患者中的胃肠 炎性病症中的给药方案的方法。在某些实施方案中，所述方法包括基于在 用所述拮抗剂的剂量或给药方案治疗之后或期间从所述患者获得的样品中 生物标志物的量与在治疗之前从所述患者获得的样品中生物标志物的量的 比较，调节拮抗剂的给药方案，其中与治疗之前相比，生物标志物的量在 治疗之后或期间的变化是在治疗所述患者中的胃肠病症中的所述拮抗剂的 效力或对所述拮抗剂给药方案的反应的指示，且其中生物标志物是所述拮 抗剂在结肠淋巴细胞上对含有整联蛋白β7亚基的受体的占据。在某些实 施方案中，包含整联蛋白β7亚基的受体是αEβ7受体或α4β7受体。在 一个实施方案中，在结肠淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据通 过测量在外周血淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据来测定，其 中预先确定外周血淋巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据与结肠淋 巴细胞上包含整联蛋白β7亚基的受体占据基本相同。在某些实施方案中， 通过方法测定包含整联蛋白β7亚基的受体占据，所述方法包括温育淋巴 细胞与标记的抗-β7抗体(其中标记的抗-β7抗体与整联蛋白β7拮抗剂 结合相同的表位)、洗涤淋巴细胞和通过流式细胞术测量标记的淋巴细胞的 百分数。在某些实施方案中，标记选自异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、 藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻素叶绿素蛋白质(PerCP)、 PE-Cy7,APC-Cy7和APC-H7。在一个实施方案中，整联蛋白β7拮抗剂 是etrolizumab并且标记的抗-β7抗体是etrolizumab或FIB504。在一个 实施方案中，占据的改变是增加或减少。在一个实施方案中，在接受拮抗 剂第一次给药后100天内测量占据。在一个实施方案中，在第43天和第 71天测量占据。在一个实施方案中，胃肠炎性病症是炎性肠病。示例性的 炎性肠病包括溃疡性结肠炎和克隆病。在某些实施方案中，患者是人。在 一个实施方案中，拮抗剂是抗-β7抗体并且根据剂量或给药方案的效力或 对剂量或给药方案的反应的指示确定的给药或给药方案包括皮下施用第一 次负载剂量420mg抗-β7抗体，之后在2周后皮下施用第一次维持剂量 315mg抗-β7抗体(或标称剂量300mg)，之后皮下施用一个或多个随后 的维持剂量315mg抗-β7抗体(或标称剂量300mg)，其中每个随后的维 持剂量在前一次维持剂量后4周施用。在一个实施方案中，根据剂量或给 药方案的效力或对剂量或给药方案的反应的指示所确定的给药或给药方案 包括每4周皮下施用105mg抗-β7抗体(或标称剂量100mg)或每2周 50mg抗-β7抗体(标称剂量)。在一个实施方案中，抗-β7抗体是 etrolizumab。
在上述方法的某些方面中，该整联蛋白β7拮抗剂是单克隆抗-β7抗体。 在某些这类实施方案中，该抗-β7抗体选自嵌合抗体、人抗体和人源化抗 体。在某些实施方案中，该抗-β7抗体是抗体片段。在某些实施方案中， 该抗-β7抗体包含6个高变区(HVR)，其中：
(i)HVR-L1包含氨基酸序列A1-A11，其中A1-A11是 RASESVDTYLH(SEQIDNO:1)；RASESVDSLLH(SEQIDNO:7)； RASESVDTLLH(SEQIDNO:8)；或RASESVDDLLH(SEQIDNO:9)； 或SEQIDNO:1、7、8或9的变体(SEQIDNO:26)，其中氨基酸A2选 自A、G、S、T和V，和/或氨基酸A3选自S、G、I、K、N、P、Q、R 和T，和/或A4选自E、V、Q、A、D、G、H、I、K、L、N和R，和/ 或氨基酸A5选自S、Y、A、D、G、H、I、K、N、P、R、T和V，和/ 或氨基酸A6选自V、R、I、A、G、K、L、M和Q，和/或氨基酸A7选 自D、V、S、A、E、G、H、I、K、L、N、P、S和T，和/或氨基酸A8 选自D、G、N、E、T、P和S，和/或氨基酸A9选自L、Y、I和M，和/ 或氨基酸A10选自L、A、I、M和V，和/或氨基酸A11选自H、Y、F 和S；
(ii)HVR-L2包含氨基酸序列B1-B8，其中B1-B8是KYASQSIS(SEQ IDNO:2)；RYASQSIS(SEQIDNO:20)；或XaaYASQSIS(SEQIDNO:21， 其中Xaa代表任意氨基酸)；或SEQIDNO:2、20或21的变体(SEQID NO:27)，其中氨基酸B1选自K、R、N、V、A、F、Q、H、P、I、L、Y 和Xaa(其中Xaa代表任意氨基酸)，和/或氨基酸B4选自S和D，和/或 氨基酸B5选自Q和S，和/或氨基酸B6选自S、D、L和R，和/或氨基酸 B7选自I、V、E和K；
(iii)HVR-L3包含氨基酸序列C1-C9，其中C1-C9是QQGNSLPNT (SEQIDNO:3)；或SEQIDNO:3的变体(SEQIDNO:28)，其中氨基 酸C8选自N、V、W、Y、R、S、T、A、F、H、IL和M；
(iv)HVR-H1包含氨基酸序列D1-D10，其中D1-D10是 GFFITNNYWG(SEQIDNO:4)；
(v)HVR-H2包含氨基酸序列E1-E17，其中E1-E17是 GYISYSGSTSYNPSLKS(SEQIDNO:5)；或SEQIDNO:5的变体(SEQ IDNO:29)，其中氨基酸E2选自Y、F、V和D，和/或氨基酸E6选自S 和G，和/或氨基酸E10选自S和Y，和/或氨基酸E12选自N、T、A和D， 和/或氨基酸13选自P、H、D和A，和/或氨基酸E15选自L和V，和/ 或氨基酸E17选自S和G；和
(vi)HVR-H3包含氨基酸序列F2-F11，其中F2-F11是 MTGSSGYFDF(SEQIDNO:6)或RTGSSGYFDF(SEQIDNO:19)； 或包含氨基酸序列F1-F11，其中F1-F11是AMTGSSGYFDF(SEQID NO:16)；ARTGSSGYFDF(SEQIDNO:17)；或AQTGSSGYFDF(SEQ IDNO:18)；或SEQIDNO:6、16、17、18或19的变体(SEQIDNO:30)， 其中氨基酸F2是R、M、A、E、G、Q、S，和/或氨基酸F11选自F和Y。
在某些实施方案中，该抗-β7抗体包含三个重链可变区(HVR-H1-H3) 序列和三个轻链可变区(HVR-L1-L3)序列，其中：
(i)HVR-L1包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:9；
(ii)HVR-L2包含SEQIDNO:2；
(iii)HVR-L3包含SEQIDNO:3；
(iv)HVR-H1包含SEQIDNO:4；
(v)HVR-H2包含SEQIDNO:5；和
(vi)HVR-H3包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17 或SEQIDNO:19。在某些实施方案中，抗-β7抗体包含含有SEQID NO:31的氨基酸序列的可变轻链，以及含有SEQIDNO:32的氨基酸序列 的可变重链。
在某些实施方案中，抗-β7抗体是etrolizumab，也称为rhuMAbβ7。
附图简述
图1A和1B针对以下共有序列和抗β7亚基抗体序列显示可变轻链和 重链的序列比对：轻链人亚组κI共有序列(图1A，SEQIDNO:12)；重链 人亚组III共有序列(图1B，SEQIDNO:13)；大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504) 可变轻链(图1A，SEQIDNO:10)；大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504)可变重链(图 1B，SEQIDNO:11)；及人源化抗体变体：人源化hu504K移植可变轻链(图 1A，SEQIDNO:14)，人源化hu504K移植可变重链(图1B，SEQIDNO:15)， 变体hu504-5、hu504-16和hu504-32(对于变体hu504-5、hu504-16和 hu504-32，离人源化hu504K移植物的氨基酸变异显示在图1A(轻链)(按出 现的顺序分别为SEQIDNOS:22-24)和图1B(重链)(SEQIDNO:25)中)。
图2A显示实施例1中所述的占据测定的示意图。
图2B显示实施例1中所述的表达测定(也称为MOA测定)的示意图。
图3A显示实施例1中所述的外周血T细胞的表型细分。
图3B显示实施例1中所述的外周血B细胞的表型细分。
图4A显示按实施例1中所述的两种不同给药方案施用安慰剂(pbo)或 etrolizumab后，患者样品中的外周血T细胞(CD3+、CD4+、CD45RA-、 β7高)上的整联蛋白β7占据。显示表示为基线的百分比(％BL)的组平均绝 对计数，误差线代表偏离平均值的标准偏差。具有开放圆的实线(pbo)、具 有点画圆的点虚线(100mgetrolizumab)、具有封闭圆的虚线(300mg+LD etrolizumab)。实箭头表示治疗臂的etrolizumab或pbo施用；虚箭头表示 所有臂中的安慰剂施用。
图4B显示按实施例1中所述的两种不同给药方案施用安慰剂(pbo)或 etrolizumab后，患者样品中的外周血T细胞(CD3+、CD4-、CD45RA-、β7 高)上的整联蛋白β7占据。显示表示为基线的百分比(％BL)的组平均绝对 计数，误差线代表偏离平均值的标准偏差。具有开放圆的实线(pbo)、具有 点画圆的点虚线(100mgetrolizumab)、具有封闭圆的虚线(300mg+LD etrolizumab)。实箭头表示治疗臂的etrolizumab或pbo施用；虚箭头表示 所有臂中的安慰剂施用。
图4C显示按实施例1中所述的两种不同给药方案施用安慰剂(pbo)或 etrolizumab后，患者样品中的外周血B细胞(CD19+、IgD-、β7高)上的整 联蛋白β7占据。显示表示为基线的百分比(％BL)的组平均绝对计数，误 差线代表偏离平均值的标准偏差。具有开放圆的实线(pbo)、具有点画圆的 点虚线(100mgetrolizumab)、具有封闭圆的虚线(300mg+LD etrolizumab)。实箭头表示治疗臂的etrolizumab或pbo施用；虚箭头表示 所有臂中的安慰剂施用。
图5显示按实施例1中所述的两种不同给药方案施用安慰剂(pbo)或 etrolizumab后，患者样品中的外周血黏膜(肠)归巢T和B细胞上的整联蛋 白β7表达。显示表示为偏离基线的变化的组平均绝对计数，误差线代表 偏离中位数的绝对偏差。(A)黏膜(肠)归巢CD3+CD4+T细胞；(B)黏膜(肠) 归巢CD3+CD4-T细胞；(C)黏膜(肠)归巢CD19+B细胞。具有开放圆的 实线(pbo)、具有点画圆的点虚线(100mgetrolizumab)、具有封闭圆的虚线 (300mg+LDetrolizumab)。实箭头表示治疗臂的etrolizumab或pbo施用； 虚箭头表示所有臂中的安慰剂施用。
图6显示从来自实施例1中所述的etrolizumab治疗之前的患者的结 肠活组织检查样品获得的CD45+、CD3+、CD4-T淋巴细胞上的细胞表面 αEβ7表达的代表性FACS点图。来自用etrolizumab给药之前的患者的淋 巴细胞的FACS图：αE水平显示在垂直轴上，用标记的FIB504抗体(竞争 抗体)测定的β7水平显示在水平轴上，带框的右上象限显示来自αE+和β7+ 细胞的信号。
图7显示从来自实施例1中所述的100mg单剂量etrolizumab或安慰 剂治疗之前和之后的患者的结肠活组织检查样品获得的CD45+、CD3+、 CD4-T淋巴细胞上的细胞表面αEβ7占据的代表性FACS点图。αE水平 显示在垂直轴上，用标记的FIB504抗体(竞争抗体)测定的β7水平显示在 水平轴上，右上象限显示来自αE+和β7+细胞的信号；显示两种标记都为 染色阳性的细胞的百分比。左侧的图显示用etrolizumab给药的患者的 FACS点图；右侧的图显示用安慰剂给药的患者的FACS点图。上图显示 给药之前；中图显示第43天；下图显示第71天。从用etrolizumab或安 慰剂给药的其他患者获得了与此处所示相似的结果。
图8A-E显示从来自实施例1中所述的etrolizumab或安慰剂治疗之 前、期间和/或之后的患者获得的结肠活组织检查样品获得的CD45+、 CD3+、CD4-T淋巴细胞上的β7受体占据。可检测到的T淋巴细胞的丢 失指示占据。(A)在所示“100mg”剂量臂、“300mg+LD”剂量臂或安慰 剂中治疗的患者可检测到的αEβ7+、CD45+、CD3+、CD4-T淋巴细胞的 群组中位数百分比，具有开放圆的实线(pbo)、具有点画圆的点虚线(100mg etrolizumab)、具有封闭圆的虚线(300mg+LDetrolizumab)；(B)在所示 “100mg”剂量臂、“300mg+LD”剂量臂或安慰剂中治疗的患者可检测 到的α4β7+、CD45+、CD3+、CD4-T淋巴细胞的群组中位数百分比，具 有开放圆的实线(pbo)、具有点画圆的点虚线(100mgetrolizumab)、具有封 闭圆的虚线(300mg+LDetrolizumab)；(C)“100mg”剂量etrolizumab臂 中7名患者中的每一名患者可检测到的αEβ7+、CD45+、CD3+、CD4-T 淋巴细胞的百分比；虚线表示仅接受单剂量(SD)的两名患者，其中一名具 有抗-治疗抗体(ATA)反应；(D)“300mg+LD”臂中7名患者中的每一名 患者可检测到的αEβ7+、CD45+、CD3+、CD4-T淋巴细胞的百分比；和 (E)安慰剂臂中9名患者中的每一名患者可检测到的αEβ7+、CD45+、 CD3+、CD4-T淋巴细胞的百分比。在(C)-(E)的每一项中，TNF-IR患者 以(*)表示。
图9显示在实施例1中所述的etrolizumab或安慰剂治疗之前和之后， 与无临床缓解的患者相比，具有临床缓解的患者中的结肠活检组织中的整 联蛋白表达。(A)在筛查(Scr)时、第6周和第10周通过qPCR测定的整联 蛋白-β7表达；(B)在筛查(Scr)时、第6周和第10周通过qPCR测定的整 联蛋白-β1表达；(C)在筛查(Scr)时、第6周和第10周通过qPCR测定的 整联蛋白-α4表达；(D)在筛查(Scr)时、第6周和第10周通过qPCR测定 的整联蛋白-αE表达。数据作为偏离基线的倍数变化(2–ΔΔCt)表示为组中位 数±中位数绝对偏差。具有实线圆的虚线，安慰剂非缓解者；具有开放圆 的实线，etrolizumab治疗的缓解者；具有点画圆的点虚线，etrolizumab 治疗的非缓解者。
图10显示etrolizumab对实施例1中所述的肠隐窝上皮中的αE+细胞 的影响。(A)etrolizumab(条纹框)或安慰剂(点画框)治疗之前和之后肠隐窝 上皮中的中位数αE+细胞；(B)肠隐窝上皮中的αE+细胞的代表性IHC染 色。
图11显示etrolizumab对实施例1中所述的肠固有层中的αE+细胞的 影响。(A)etrolizumab(条纹框)或安慰剂(点画框)治疗之前和之后所有患者 中的肠固有层中的平均αE+细胞；(B)与未达到临床缓解的患者相比，在具 有临床缓解的患者中，etrolizumab或安慰剂治疗之前和之后肠固有层中的 平均αE+细胞。平均值、四分位距(IQR)和范围显示在盒型图上：点画框， 安慰剂非缓解者；条纹框，etrolizumab治疗的缓解者；开放框，etrolizumab 治疗的非缓解者。
图12A显示与etrolizumab或安慰剂治疗的非缓解者相比，缓解者中 的肠隐窝上皮中αE+细胞的免疫组织化学定量。平均值、四分位距(IQR) 和范围显示在盒型图上：点画框，etrolizumab治疗的缓解者；条纹框， etrolizumab治疗的非缓解者；开放框，安慰剂非缓解者；图12B显示实 施例1中所述的etrolizumab或安慰剂治疗达到临床缓解状态之前和之后 结肠组织中的E-钙黏着蛋白水平；具有实线圆的虚线，安慰剂非缓解者； 具有开放圆的实线，etrolizumab治疗的缓解者；具有点画圆的点虚线， etrolizumab治疗的非缓解者。
图13显示实施例1中所述的etrolizumab或安慰剂治疗之前和之后， 与无临床缓解的患者相比，具有临床缓解的患者中的结肠活组织检查中 MAdCAM-1、细胞因子和淋巴细胞亚型标记的表达。通过qPCR定量表 达，数据表示为倍数变化(2–ΔΔCt)组中位数±中位数绝对偏差(MAD)。(A) IL-17F；(B)IL-1β；(C)IL-12p40；(D)IL-6；(E)TNFα；(F)CD19；(G)CD4； (H)CD8；(I)CD3ε；(J)MAdCAM-1；(K)IL-17A；(L)IL-23A；(M)IFNγ。 具有实线圆的虚线，安慰剂非缓解者；具有开放圆的实线，etrolizumab治 疗的缓解者；具有点画圆的点虚线，etrolizumab治疗的非缓解者。
图14显示实施例1中所述的100mgetrolizumabq4w或300mg etrolizumabq4w加负荷剂量治疗的患者在第43和71天的血清 etrolizumab浓度，与结肠淋巴细胞β7受体占据相比。TNF-IR患者表示 为仅接受单剂量的两名患者。箭头标示仅接受两个剂量的一名患者。
图15显示etrolizumab的可变轻链区(A)(SEQIDNO:31)和可变重链 区(B)(SEQIDNO:32)。
发明详述
除非另有说明，本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的 普通技术人员的通常理解相同的含义。Singleton等,Dictionaryof MicrobiologyandMolecularBiology第2版,J.Wiley&Sons(NewYork, N.Y.1994)和March,AdvancedOrganicChemistryReactions,Mechanisms andStructure第4版,JohnWiley&Sons(NewYork,N.Y.1992)为本领域 技术人员提供了本申请中所用的许多术语的一般指导。
I.某些定义
除非文中清楚地另有说明，本说明书和所附权利要求中所用的单数形 式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此，例如提到“一个蛋白 质”包括多个蛋白质；提到“一个细胞”包括细胞的混合物等。
本说明书和所附权利要求中提供的范围包括两个重点及终点之间的所 有点。因此，例如，2.0至3.0的范围包括2.0、3.0及2.0和3.0之间的所 有点。
“治疗”指改变所治疗的个体或细胞的天然过程的尝试中的临床干预， 且可以为了预防而进行或在临床病理的过程中进行。希望得到的疗效包括 预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任意直接或间接的病理结 果、降低疾病进展的速率、改善或缓和疾病状态及缓解或改善预后。
“治疗方案”指剂量、施用的频率、或治疗的持续时间、加入或不加 入第二药物的组合。
“有效治疗方案”指将向接受该治疗的患者提供有益反应的治疗方案。
“改变治疗”指改变治疗方案，包括改变剂量、施用的频率、或治疗 的持续时间、和/或加入第二药物。
可以用显示对患者的益处的任意终点来评估“患者反应”或“患者反 应性”，其非限制性地包括：(1)以某种程度抑制疾病进展，包括减慢和完 全阻断；(2)疾病发作和/或症状的数目的减少；(3)损伤大小的减小；(4) 抑制(即减少、减慢或完全阻止)疾病细胞浸润入邻近的外周器官和/或组 织；(5)抑制(即减少、减慢或完全阻止)疾病传播；(6)自身免疫反应、 免疫反应或炎症反应的减少，其可以但并非必须导致疾病损伤的消退或消 融；(7)以某种程度减轻与该障碍相关的一种或多种症状；(8)治疗后无 疾病呈现的长度增加；和/或(9)治疗后给点时间点的死亡率降低。术语 “反应性”指可测量的反应，包括完全反应(CR)和部分反应(PR)。
“完全反应”或“CR”意指炎症的所有病征响应治疗而消失或缓解。 这并非总是意指该疾病已治愈。
“部分反应”或“PR”指炎症的严重度响应治疗而降低至少50％。
患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗的“有益反应”和类似的用词指来自 诸如抗-整联蛋白β7抗体的拮抗剂治疗或由于诸如抗-整联蛋白β7抗体的 拮抗剂治疗而赋予处于胃肠炎性障碍或患有胃肠炎性障碍的患者的临床或 治疗益处。这种益处包括来自或由于拮抗剂治疗的患者的细胞或生物学反 应、完全反应、部分反应、稳定疾病(无进展或复发)或具有较晚的复发 的反应。
治疗过程中患者的反应性不随时间降低时，“患者保持对治疗的反应 性”。
本文所用的“无反应”或“缺乏反应”或类似用语指对整联蛋白β7 拮抗剂治疗缺乏完全反应、部分反应或有益反应。
术语“监测整联蛋白β7拮抗剂治疗的效力”用来指在整联蛋白β7拮 抗剂治疗之前、期间和/或之后至少一次(包括系列地)从患者获得样品，在 这类样品中测量选自拮抗剂在结肠淋巴细胞上对含有整联蛋白β7亚基的 受体的占据、一个或多个整联蛋白受体配体的基因表达水平、一个或多个 淋巴细胞基因的基因表达水平、一个或多个细胞因子的基因表达水平及肠 隐窝上皮中αE阳性细胞的数目的生物标志物，并比较治疗之前、治疗期 间和/或治疗之后的结果，以获得治疗是否有效的指示。在治疗效力的监测 中，测量选自拮抗剂在结肠淋巴细胞上对含有整联蛋白β7亚基的受体的 占据、一个或多个整联蛋白受体配体的基因表达水平、一个或多个淋巴细 胞基因的基因表达水平、一个或多个细胞因子的基因表达水平及肠隐窝上 皮中αE阳性细胞的数目的生物标志物的水平，并在一个实施方案中与同 一生物标志物的参考值相比较，或在另一实施方案中，将它与在患者处于 治疗中或开始治疗之前的较早时间点从同一患者获得的样品中同一生物标 志物的水平相比较。在一个实施方案中，与在患者已处于治疗中或开始治 疗之前的较早时间点从同一患者获得的样品中同一生物标志物的水平相 比，选自拮抗剂在结肠淋巴细胞上对含有整联蛋白β7亚基的受体的占据、 一个或多个整联蛋白受体配体的基因表达水平、一个或多个淋巴细胞基因 的基因表达水平、一个或多个细胞因子的基因表达水平及肠隐窝上皮中αE 阳性细胞的数目的一个或多个生物标志物的水平降低或水平提高(生物标 志物取决于按本文进一步描述评估的具体生物标志物而水平降低或水平提 高)指示患者对治疗有反应。
本文用术语“诊断”来指分子或病理状态、疾病或病症的鉴定或分类。 例如，“诊断”可以指通过所涉及的组织/器官(例如炎性肠病)或通过其他特 征(例如表征为对治疗如对整联蛋白β7拮抗剂治疗的反应性的患者亚群) 鉴定胃肠炎性病症的具体类型，更具体而言，分类胃肠炎性病症的具体亚 型。
本文用术语“预后”来指胃肠炎性病症的疾病症状(包括例如复发、发 作和药物抗性)的可能性的预测。
本文所用的术语“样品”或“测试样品”指获自或衍生自目的个体的 组合物，该目的个体包含有待例如基于物理、生物化学、化学和/或生理学 特征表征和/或鉴定的细胞实体和/或其他分子实体。例如，短语“疾病样 品”及其变化形式指获自预期或已知包含待表征的细胞和/或分子实体的目 的个体的任意样品。样品可以获自目的个体的组织或获自该个体的外周血。
本文所用的“参考样品”指用于比较目的的任意样品、标准或水平。 在一个实施方案中，参考样品获自同一个体或患者的身体的健康和/或未患 病部分(例如组织或细胞)。在另一实施方案中，参考样品获自同一个体或 患者的身体的未经处理的组织和/或细胞。还在另一实施方案中，参考样品 获自不是该个体或患者的个体的身体的健康和/或未患病部分(例如组织或 细胞)。还在另一实施方案中，参考样品获自不是该个体或患者的个体的身 体的未经处理的组织和/或细胞。
“β7整联蛋白拮抗剂”或“β7拮抗剂”指抑制β7整联蛋白的一种或 多种生物学活性或阻断β7整联蛋白与它的一种或多种结合分子的结合的 任意分子。本发明的拮抗剂可以用来调节β7结合作用的一个或多个方面， 包括但不限于与α4整联蛋白亚基的结合，与αE整联蛋白亚基的结合，α4β7 整联蛋白与MAdCAM、VCAM-1或纤连蛋白的结合，及αEβ7整联蛋白 与E-钙黏着蛋白的结合。这些作用可以通过任意生物学上相关的机制来调 节，包括破坏配体与β7亚基或与α4β7或αEβ7二聚体整联蛋白的结合， 和/或通过破坏α和β整联蛋白亚基之间的结合，使得二聚体整联蛋白的形 成被抑制。在本发明的一个实施方案中，该β7拮抗剂是抗-β7整联蛋白抗 体(或抗-β7抗体)。在一个实施方案中，该抗-β7整联蛋白抗体是人源化 抗-β7整联蛋白抗体，更具体而言，重组人源化单克隆抗-β7抗体(或 rhuMAbβ7，还称为etrolizumab)。在一些实施方案中，本发明的抗-β7 抗体是抗-整联蛋白β7拮抗抗体，其抑制或阻断β7亚基与α4整联蛋白亚 基的结合，与αE整联蛋白亚基的结合，α4β7整联蛋白与MAdCAM、 VCAM-1或纤连蛋白的结合，及αEβ7整联蛋白与E-钙黏着蛋白的结合。
“beta7亚基”或“β7亚基”意指人β7整联蛋白亚基(Erle等,(1991) J.Biol.Chem.266:11009-11016)。β7亚基与α4整联蛋白亚基(如人α4亚 基)结合(Kilger和Holzmann(1995)J.Mol.Biol.73:347-354)。据报道， α4β7整联蛋白在大多数成熟淋巴细胞以及一小群胸腺细胞、骨髓细胞和肥 大细胞上表达(Kilshaw和Murant(1991)Eur.J.Immunol.21:2591-2597； Gurish等,(1992)149:1964-1972；及Shaw,S.K.和Brenner,M.B.(1995) Semin.Immunol.7:335)。β7亚基还与αE亚基(如人αE整联蛋白亚基) 结合(Cepek,K.L等(1993)J.Immunol.150:3459)。αEβ7整联蛋白在肠 内上皮淋巴细胞(iIEL)上表达(Cepek,K.L.(1993)上文)。
“alphaE亚基”或“alphaE整联蛋白亚基”或“αE亚基”或“αE 整联蛋白亚基”或“CD103”意指与上皮内淋巴细胞上的β7整联蛋白结合 的整联蛋白亚基，该αEβ7整联蛋白介导iEL与表达E-钙黏着蛋白的肠上 皮的结合(Cepek,K.L.等(1993)J.Immunol.150:3459；Shaw,S.K.和 Brenner,M.B.(1995)Semin.Immunol.7:335)。
“MAdCAM”或“MAdCAM-1”在本发明的背景中可互换使用，指 蛋白质黏膜地址素细胞黏附分子-1，其是包含短的胞质尾、跨膜区和由三 个免疫球蛋白样结构域组成的胞外序列的单链多肽。已克隆了鼠、人和猕 猴(macaque)MAdCAM-1的cDNA(Briskin等,(1993)Nature, 363:461-464；Shyjan等,(1996)J.Immunol.156:2851-2857)。
“VCAM-1”或“血管细胞黏附分子-1”或“CD106”指表达在活化 的内皮上且在内皮-淋巴细胞相互作用(如炎症过程中淋巴细胞的结合和变 移)中重要的α4β7和α4β1的配体。
“CD45”指蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的蛋白质。已知PTP 是调节包括细胞生长、分化、有丝分裂周期和致癌性转化的多种细胞过程 的信号发放分子。此PTP包含胞外结构域、单跨膜区段和两个串联的胞质 内催化结构域，因此隶属于受体型PTP。此基因在造血细胞中专一性表达。 已显示此PTP是T细胞和B细胞抗原受体信号发放的必需调节物。它通 过与抗原受体复合物的成分的直接相互作用或通过活化抗原受体信号发放 所需的多种Src家族激酶来发挥作用。此PTP还抑制JAK激酶，因此作 为细胞因子受体信号发放的调节物发挥作用。已报道了此基因的编码不同 同种型的四种选择性剪接转录物变体(TchilianEZ,BeverleyPC(2002). "CD45inmemoryanddisease."Arch.Immunol.Ther.Exp.(Warsz.)50 (2):85-93；IshikawaH,TsuyamaN,AbrounS等(2004)."Interleukin-6, CD45andthesrc-kinasesinmyelomacellproliferation."Leuk. Lymphoma44(9):1477-81)。
存在多种同种型的CD45：CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RAB、 CD45RAC、CD45RBC、CD45RO、CD45R(ABC)。CD45还高度糖基 化。CD45R是最长的蛋白质，在从T细胞分离时按200kDa迁移。B细胞 也表达具有更重的糖基化的CD45R，使分子量达到220kDa，因此称为 B220；220kDa的B细胞同种型。B220表达不限于B细胞，还可以表达 在活化的T细胞、一个亚群的树突细胞及其他抗原呈递细胞上。StantonT, BoxallS,BennettA等(2004)."CD45variantalleles:possiblyincreased frequencyofanovelexon4CD45polymorphisminHIVseropositive Ugandans."Immunogenetics56(2):107-10。
“肠归巢淋巴细胞”指具有选择性地向肠淋巴结和组织归巢但不向外 周淋巴结和组织归巢的特征的淋巴细胞亚群。此亚群的淋巴细胞表征为多 种细胞表面分子的组合的独特表达模式，该组合包括但不限于CD4、 CD45RA和β7的组合。通常，可以根据标记CD45RA和β7进一步划分 至少两个亚群的外周血CD4+淋巴细胞，CD45RA-β7高和CD45RA-CD4+细胞。CD45RA-CD4+细胞优先向肠淋巴结和组织归巢，而 CD45RA-β7低CD4+细胞优先向外周淋巴结和组织归巢(Rott等1996； Rott等1997；Williams等1998；Rosé等1998；Williams和Butcher1997； Butcher等1999)。因此，肠归巢淋巴细胞是在流式细胞术测定中鉴定为 CD45RA-β7高CD4+的不同亚群的淋巴细胞。鉴定此组淋巴细胞的方法为 本领域已知，还在本申请的实施例部分中详细公开。
本文关于细胞表面标记所用的符号“+”表示细胞表面标记的阳性表 达。例如，CD4+淋巴细胞是在其细胞表面表达CD4的一组淋巴细胞。
本文关于细胞表面标记所用的符号“-”表示细胞表面标记的阴性表达。 例如，CD45RA-淋巴细胞是未在其细胞表面表达CD45RA的一组淋巴细 胞。
本文关于细胞表面标记的表达所用的符号“低”表示淋巴细胞上的细 胞表面标记的相对低水平的表达，而“高”表示淋巴细胞上的细胞表面标 记的相对高水平的表达。在流式细胞术中，的强度比β7低的强度高至 少约10或100倍。因此，如本文在示例性实施方案中所提供，CD45RA-β7低CD4+和CD45RA-CD4+细胞定位在流式细胞术分析的点阵图或 直方图的不同部分，其中X轴是CD45AR的表达强度，Y轴是β7的表达 强度。
“外周归巢淋巴细胞”指具有向外周淋巴结和组织归巢而不向肠淋巴 结和组织归巢的特征的淋巴细胞亚群。在示例性实施方案中，如上文所解 释，外周归巢淋巴细胞是在流式细胞术测定中鉴定为CD45RA-CD4+细胞的不同组的淋巴细胞。鉴定此组淋巴细胞的方法为本领域已知, 并且细节公开在本申请中。
生物标志物的“量”或“水平”可以用本领域已知和本文所公开的方 法(如流式细胞术分析)测定。
“生物标志物的量或水平的变化”是与该生物标志物的参考量/比较量 相比较。在某些实施方案中，作为参考量或比较量的值的函数，该变化大 于约10％、或大于约30％、或大于约50％、或大于约100％、或大于约 300％。例如，参考量或比较量可以是治疗前的生物标志物的量，更具体而 言，可以是基线或给药前的量。
本文所用的短语“与…基本相同”指不显著的变化程度，使得本领域 技术人员将不认为该变化具有统计显著性或是在通过该值测量的生物学特 征的背景内具有生物学意义的变化(例如饱和药物靶受体所需的药物血清 水平)。例如，认为饱和受体所需的相互差异小于约2倍、或相互差异小于 约3倍或相互差异小于约4倍的血清药物浓度基本相同。
“胃肠炎性病症”是引起黏膜中的炎症和/或溃疡的一组慢性病症。这 些病症包括例如炎性肠病(例如克隆病、溃疡性结肠炎、不确定性结肠炎 和感染性结肠炎)、黏膜炎(例如口腔黏膜炎、胃肠黏膜炎、鼻黏膜炎和直 肠炎)、坏死性小肠结肠炎和食管炎。在优选的实施方案中，胃肠炎症病症 是炎性肠病。
“炎性肠病”或“IBD”在本文中可互换使用，指引起炎症和/或溃疡 的肠病，且非限制性地包括克隆病和溃疡性结肠炎。
“克隆病(CD)”或“溃疡性结肠炎(UC)”是未知病因的慢性炎性 肠病。与溃疡性结肠炎不同，克隆病可以影响肠的任意部分。克隆病最突 出的特征是肠壁的颗粒状、红紫色水肿增厚。随着炎症的发展，这些肉芽 瘤常失去它们的限制边界，并与周围组织结为一体。腹泻和肠梗阻是主要 的临床特征。与溃疡性结肠炎一样，克隆病的过程可以连续的或复发的， 轻微的或严重的，但与溃疡性结肠炎不同，克隆病不可通过切除所累及的 肠区段治愈。大多数克隆病患者需要在某个点手术，但随后的复发很常见， 通常需要连续的医疗处理。
虽然克隆病可以累及从口至肛门的消化道的任意部分，但它通常出现 在回肠结肠、小肠或结肠-肛门直肠区域。在组织病理学上，该疾病表征为 不连续的granulomatomas、隐窝脓肿、龟裂和口疮性溃疡。炎症性浸润物 是混合的，由淋巴细胞(T和B细胞二者)、浆细胞、巨噬细胞和嗜中性 粒细胞组成。分泌IgM和IgG的浆细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞有不成 比例的增加。
抗炎药物柳氮磺吡啶和5-氨基水杨酸(5-ASA)用于治疗轻度活性的 结肠克隆病，并常在维持疾病的缓解中使用。Metroidazole和环丙沙星的 功效与柳氮磺吡啶相似，且看起来尤其用于治疗肛周疾病。在更严重的病 例中，用皮质类固醇有效治疗活性恶化，且甚至可以维持缓解。硫唑嘌呤 和6-巯基嘌呤也显示在需要长期施用皮质类固醇的患者中成功。还可能的 是这些药物可以在长期预防中发挥作用。不幸的是，在一些患者中发挥作 用前，存在非常长的延迟(长达6个月)。抗腹泻药物也可以在一些患者中 提供症状减轻。营养疗法或要素膳食可以改善患者的营养状态，并诱导急 性疾病的症状改善，但是它不诱导持续的临床缓解。抗生素用于治疗继发 性小肠细菌过度生长及治疗化脓性并发症。
“溃疡性结肠炎(UC)”伤害大肠。该疾病的过程可以是持续的或复 发的，轻微的或严重的。最早的损伤是炎性浸润，在肠腺基部形成脓肿。 这些膨胀和破裂的隐窝的合并倾向于将覆盖的黏膜与其血液供应分开，导 致溃疡形成。该疾病的症状包括腹部绞痛、下腹痛、直肠出血及频繁的稀 排泄物，其主要由具有极少的粪便颗粒的血液、脓和黏液组成。急性、严 重或慢性的持续性溃疡性结肠炎可以需要全结肠切除术。
UC的临床特征高度可变，且发病可以是潜伏的或突然的，且可以包 括腹泻、里急后重和复发性直肠出血。可能发生整个结肠的爆发性累及、 中毒性巨结肠、危及生命的紧急状况。肠外表现包括关节炎、脓皮病 gangrenoum、葡萄膜炎和结节性红斑。
UC的治疗包括用于轻微病例的柳氮磺吡啶和相关的含水杨酸的药 物，用于严重病例的皮质类固醇药物。水杨酸类或者皮质类固醇的局部施 用有时是有效的，尤其至在疾病局限于末端肠时，且与全身性使用相比与 降低的副作用相关。有时指出需要支持性措施，如施用铁和抗腹泻剂。硫 唑嘌呤、6-巯基嘌呤和氨甲喋呤有时也被建议用于顽固性皮质类固醇依赖 性病例。
“有效剂量”指对在必要的剂量和时间内达到希望的治疗或预防结果 的有效的量。
本文所用的术语“患者”指希望得到治疗的任意单个动物，更优选地 哺乳动物(包括非人动物，例如狗、猫、马、兔子、动物园动物、牛、猪、 羊和非人灵长类)。更优选地，本文中的患者是人。
术语“非人个体”是指任何单个的非人动物，更优选地哺乳动物(包 括非人动物，例如狗、猫、马、兔子、动物园动物、牛、猪、羊和非人灵 长类)。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广泛的含义可互换地使用，且包 括单克隆抗体(例如，全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、 多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们显示希望的生物学活性)， 且也可以包括某些抗体片段(如本文更详细地描述)。抗体可以是人、人源 化和/或亲和力成熟的抗体。
“抗体片段”仅包含完整抗体的部分，其中该部分优选保留与该部分 存在于完整抗体中时通常相关的功能的至少一种，优选为多数或全部。在 一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合部位，从而保持结合 抗原的能力。在另一实施方案中，抗体片段(例如包含Fc区的抗体片段) 保留通常与该Fc区存在于完整抗体中时相关的生物学功能的至少一种， 如FcRn结合、抗体半寿期调节、ADCC功能和补体结合。在一个实施方 案中，抗体片段是单价抗体，其具有基本上类似于完整抗体的体内半衰期。 例如，这种抗体片段可以包含与能够赋予该片段体内稳定性的Fc序列连 接的抗原结合臂。
本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体获得的抗 体，即除了可以少量存在的可能的天然存在的突变外，包含该单种抗体的 群体是相同的。单克隆抗体高度特异，针对单一抗原。此外，与通常包括 针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆 抗体针对抗原上的单个决定簇。
本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体以及这类抗体的片段，其中 重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或隶属于特定抗体种类或亚类 的抗体中对应的序列相同或同源，一条或多条链的其余部分与衍生自另一 物种或隶属于另一抗体种类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，只要 它们显示希望的生物学活性(美国专利号4,816,567；及Morrison等,Proc. Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有来自非人免疫球蛋白的 最小序列的嵌合抗体。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其 中用来自非人物种(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的具有希望的特异 性、亲和力和能力的高变区(供体抗体)的残基取代来自受体的高变区的 残基。在一些情况下，用对应的非人残基取代人免疫球蛋白的构架区(FR) 残基。此外，人源化抗体可以包含不见于受体抗体或供体抗体中的残基。 进行这些修饰来进一步改良抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个、 通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部高变环对应于 非人免疫球蛋白的那些，且全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的 那些。人源化抗体还将可选地包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通 常是人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节见Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature332:323-329(1988)；及Presta, Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还见以下综述文章及其中引用的 参考文献：Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1: 105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995)； Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。
“人抗体”是包含对应于人产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列和/ 或用本文公开的制备人抗体的技术中的任意种制备的抗体。这类技术包括 筛选人衍生的组合文库，如噬菌体展示文库(见例如Marks等,J.Mol.Biol., 222:581-597(1991)及Hoogenboom等,Nucl.AcidsRes.,19:4133-4137 (1991))；用人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系来产生人单克隆抗体(见例 如KozborJ.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,MonoclonalAntibody ProductionTechniquesandApplications,55-93页(MarcelDekker,Inc., NewYork,1987；及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))；及在能够在 缺乏内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的所有组成成分的转基因动 物(例如小鼠)中产生单克隆抗体(见例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad. SciUSA,90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature,362:255(1993)； Bruggermann等,YearinImmunol.,7:33(1993))。人抗体的此定义特别排 除包含来自非人动物的抗原结合残基的人源化抗体。
“分离的”抗体是已鉴定并从其天然环境的成分分离和/或回收的抗 体。它的天然环境的污染成分是将干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质， 且可以包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的 实施方案中，将该抗体纯化至：(1)通过Lowry法测定抗体大于95wt％， 且最优选地超过99wt％；(2)足以通过使用旋杯式测序仪获得N端或内 部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)考马斯蓝染色或优选的银 染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE显示同质。分离的抗体包括重组细 胞内的原位抗体，因为将不存在该抗体的天然环境的至少一种成分。但是， 通常将通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。
在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”指抗体可变结 构域的区域，该区域在序列上高变和/或形成结构上确定的环。通常，抗体 包含六个高变区；三个在VH(H1、H2、H3)中，三个在VL(L1、L2、 L3)中。许多高变区的描述在使用，并为本文所涵盖。Kabat互补决定 区(CDR)基于序列变异性是最常用(Kaba等,SequencesofProteinsof ImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia涉及结构环的定位(Chothia 和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM高变区代表KabatCDR 和Chothia结构环之间的折衷，并为OxfordMolecular的AbM抗体建模 软件所使用。“接触”高变区基于可用的复杂晶体结构的分析。来自这些 HVR的每一个的残基在下文指出。
高变区可以包含如下的“延伸的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、 46-56或49-56或50-56或52-56(L2)和89-97(L3)及VH中的26-35 (H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这 些定义的每一个，按上文的Kabat等编号可变结构域残基。
“构架”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基外的那些可变结构 域残基。
“人共有构架”是代表人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选择中最 常存在的氨基酸残基的构架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择 来自可变结构域序列的亚型。通常，该序列亚型是如Kabat等中的亚型。 在一个实施方案中，对于VL，该亚型是如Kabat等中的亚型κI。在一个 实施方案中，对于VH，该亚型是如Kabat等中的亚型III。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个CDR中具有一个或多个改 变的抗体，与不具有那些改变的亲本抗体相比，该改变导致抗体对抗原的 亲和力的改善。优选的，亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至 皮摩尔的亲和力。通过本领域已知的方法产生亲和力成熟的抗体。Marks 等Bio/Technology10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组 进行亲和力成熟。Barbas等ProcNat.Acad.Sci,USA91:3809-3813 (1994)；Schier等Gene169:147-155(1996)；Yelton等J.Immunol. 155:1994-2004(1995)；Jackson等,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；和 Hawkins等J.Mol.Biol.226:889-896(1992)描述了CDR和/或构架残基的 随机诱变。
“结合亲和力”一般指分子(例如抗体)的单个结合部位与其结合配 偶体(例如抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，本 文所用的“结合亲和力”指内在的结合亲和力，其反映结合对(例如抗体 和抗原)的成员之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般 可通过解离常数(Kd)来代表。亲和力可以通过本领域公知的方法来测量， 包括本文中描述的那些。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原并倾向于容易 解离，而高亲和力抗体一般更快地结合抗原并倾向于保持更长久的结合。 多种测量结合亲和力的方法为本领域已知，其中的任一种都可以用于本发 明的目的。
术语“可变的”指这样的事实，在抗体之间，可变结构域的某些部分 的序列差别很大，且用于每种具体抗体对其具体抗原的结合和特异性。但 是，可变性并非均勻分布在抗体的整个可变结构域中。它集中在轻链和重 链可变结构域中称为高变区的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部 分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR，四个 FR主要采用β-折叠构型，通过三个高变区连接，该高变区形成连接β-折 叠结构的环，且在一些情况下形成β-折叠结构的部分。各条链中的高变区 通过FR近距离保持在一起，并与来自其他链的高变区一起促成抗体的抗 原结合部位的形成(见Kabat等,SequencesofProteinsofImmunological Interest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth, Bethesda,MD.(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但显示多 种效应子功能，如抗体在抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)中的参与。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab” 片段，每个片段具有单个抗原结合部位和残留的“Fc”片段，其名称反映 了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原 结合部位且仍然能够交联抗原。
“Fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。此区 域由紧密非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚 体组成。各可变结构域的三个高变区正是在此构型中相互作用来定义 VH-VL二聚体表面上的抗原结合部位。六个高变区共同赋予抗体抗原结合 特异性。但是，甚至单个可变结构域(或Fv的一半，其仅包含三个对抗 原特异的高变区)也具有识别和结合抗原的能力，虽然亲和力低于整个结 合部位。
Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。 Fab’片段与Fab片段的不同在于，在重链CH1结构域的羧基端加入了几 个残基，其包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab’-SH是本文 对其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基具有至少一个自由巯基的 Fab’的命名。F(ab’)2抗体片段最初作为其间具有铰合部半胱氨酸的Fab’ 片段对产生。还已知抗体片段的其他化学偶联。
根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任意脊椎动物物种的抗 体的“轻链”分配至称为κ和λ的两个明显不同的类型之一。
取决于其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体(免疫球蛋白) 分配至不同种类。存在五个主要种类的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG 和IgM，这些中的几个可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定结构 域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构 型众所周知，且通常描述于例如Abbas等CellularandMol.Immunology, 第4版(W.B.Saunders,Co.,2000)中。抗体可以是通过该抗体与一种或多 种其他蛋白质或多肽的共价或非共价结合形成的更大的融合分子的一部 分。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用， 指处于其基本上完整的形式的抗体，不是下文定义的抗体片段。这些术语 尤其指具有含Fc区的重链的抗体。
为了本文的目的，“裸抗体”是不与细胞毒性部分或放射性标记缀合的 抗体。
本文所的术语“Fc区”用来定义免疫球蛋白重链的C-端区域，包括 天然序列Fc区和变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可变， 但是人IgG重链Fc区通常定义为从Cys226位或从Pro230位的氨基酸残 基延伸至其羧基端。Fc区的C-端赖氨酸(EU编号系统的残基447)可以 例如在抗体的产生或纯化期间去除，或者通过重组改造编码抗体的重链的 核酸来去除。因此，完整抗体的组合物可以包含去除了所有K447残基的 抗体群体、没有去除K447残基的抗体群体及具有含和不含K447残基的 抗体的混合物的抗体群体。
除非另有说明，在本文中，免疫球蛋白重链中的残基的编号是Kabat 等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealth Service,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中的EU指数 的编号，其在此明确引入作为参考。“Kabat中的EU指数”指人IgGlEU 抗体的残基编号。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效 应子功能”包括C1q结合、依赖补体的细胞毒性、Fc受体结合、依赖抗 体的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体； BCR)的下调等。此类效应子功能一般需要Fc区与结合结构域(例如， 抗体可变结构域)组合，且可以例如用本文中公开的多种测定来评估。
“天然序列Fc区”包含与见于自然界中的Fc区的氨基酸序列相同的 氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同 种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；天然序列人 IgG4Fc区；及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰(优选地一个或多个氨 基酸取代)而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地， 与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区在天然序列Fc区 中或在亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸取代，例如从约一个至约 十个氨基酸取代，且优选地从约一个至约五个氨基酸取代。本文的变体Fc 区优选地将与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同 源性，并且最优选地与之具有至少约90％同源性，或更优选地与之具有至 少约95％同源性。
取决于其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将完整抗体分配至不同 “种类”。存在五个主要种类的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM， 这些中的几个可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、 IgG4、IgA和IgA2。对应于不同种类的抗体的重链恒定结构域分别称为α、 δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型众所周知。
“依赖抗体的细胞毒性”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达 Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、 中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞的裂 解。用于介导ADCC的主要细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细 胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch 和Kinet,Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)的464页上的表3中。为了 评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如描述于美国 专利号5,500,362或5,821,337中的体外ADCC测定。用于这类测定的效应 细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或 此外，可以在体内，例如在诸如公开于Clynes等PNAS(USA)95:652-656 (1998)中的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。 优选地，该细胞至少表达FcγRIII，并执行ADCC效应子功能。介导ADCC 的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、 单核细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞，其中PBMC和NK细胞是优 选的。可以从其天然来源，例如从本文所述的血液或PBMC分离效应细胞。
术语“Fc受体”或“FcR”用来描述与抗体的Fc区结合的受体。优 选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR (γ受体)，且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体 的等位基因变体和选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受 体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有相似的氨基酸序列，主要在其胞 质结构域中不同。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含基于免疫受体 酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基 于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(见Annu.Rev.Immunol. 15:203-234(1997)中的综述)。FcR综述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev. Immunol9:457-92(1991)；Capel等,Immunomethods4:25-34(1994)；及de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。本文的术语“FcR”涵盖 其他FcR，包括有待将来鉴定的那些。该术语还包括负责将母体IgG转移 至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol. 24:249(1994))并调节免疫球蛋白的稳态的新生儿受体FcRn。WO00/42072 (Presta,L.)和US2005/0014934A1(Hinton等)中描述了对新生儿Fc受 体(FcRn)具有改进的结合和延长的半衰期的抗体。这些抗体包含其中具 有一个或多个取代的Fc区，该取代改善了Fc区与FcRn的结合。例如， Fc区可以在位置238、250、256、265、272、286、303、305、307、311、 312、314、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、 428或434(残基的EU编号)的一个或多个上具有取代。优选的具有改善 的FcRn结合的包含Fc区的抗体变体在其Fc区的位置307、380和434(残 基的EU编号)的一个、两个或三个上包含氨基酸取代。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中 这些结构域存在于单条多肽链中。优选的，Fv多肽进一步在VH和VL结 构域之间包含多肽接头，该多肽接头使得scFv能够形成希望的结构用于抗 原结合。scFv的综述见PlückthuninThePharmacologyofMonoclonal Antibodies,113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,纽约, 269-315页(1994)。HER2抗体scFv片段公开于WO93/16185、美国专利 号5,571,894和美国专利号5,587,458中。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合部位的小的抗体片段，该片段包 含在同一条多肽链中与可变轻链结构域(VL)连接的可变重链结构域(VH) (VH-VL)。通过使用太短而不允许同一条链上的两个结构域之间配对的接 头，迫使结构域与另一条链上的互补结构域配对，并产生两个抗原结合部 位。双抗体更充分地描述于例如EP404,097；WO93/11161；和Hollinger 等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个高变区中具有一个或多个改 变的抗体，与不具有那些改变的亲本抗体相比，该改变导致抗体对抗原的 亲和力的改善。优选的亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮 摩尔的亲和力。通过本领域已知的方法产生亲和力成熟的抗体。Marks等 Bio/Technology10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组进 行亲和力成熟。Barbas等ProcNat.Acad.Sci,USA91:3809-3813(1994)； Schier等Gene169:147-155(1995)；Yelton等J.Immunol.155:1994-2004 (1995)；Jackson等,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；和Hawkins等,J.Mol. Biol.226:889-896(1992)描述了CDR和/或构架残基的随机诱变。
本文的“氨基酸序列变体”抗体是具有不同于主要种类抗体的氨基酸 序列的抗体。通常，氨基酸序列变体将与主要种类抗体具有至少约70％ 同源性，并且优选的它们将与主要种类抗体具有至少约80％，更优选的至 少约90％同源性。氨基酸序列变体在主要种类抗体的氨基酸序列内部或相 邻的某些位置上具有取代、缺失和/或添加。本文的氨基酸序列变体的实例 包括酸性变体(如脱酰胺化的抗体变体)、碱性变体、在其一条或两条轻链 上具有氨基端前导序列延伸(例如VHS-)的抗体、在其一条或两条重链 上具有C-端赖氨酸残基的抗体等，且包括重链和/或轻链的氨基酸序列的 变异的组合。本文的尤其重要的抗体变体是这样的抗体，相对于主要种类 抗体，其在其一条或两条轻链上包含氨基端前导序列延伸，任选地进一步 包含其他氨基酸序列和/或糖基化差异。
本文的“糖基化变体”抗体是具有附着于该抗体的一个或多个糖类部 分的抗体，该糖类部分不同于附着于主要种类抗体的一个或多个糖类部分。 本文的糖基化变体的实例包括具有附着于其Fc区的Gl或G2寡糖结构而 不是G0寡糖结构的抗体、具有附着于其一条或两条轻链的一个或两个糖 类部分的抗体、没有附着于该抗体的一条或两条重链的糖类的抗体等，以 及糖基化改变的组合。在抗体具有Fc区时，寡糖结构可以例如在残基299 (298，残基的EU编号)处附着于该抗体的一条或两条重链。
本文所用的术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞的功能和/或导致细胞 的破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、 Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂和毒素， 如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段 和/或变体。
术语“细胞因子”是由一个细胞群体释放的作为胞间介质作用于另一 细胞的蛋白质的通用术语。这类细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和 传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰人 生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原； 松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH) 和黄体生成素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘 促乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；缪勒氏管抑制物质；小鼠促性腺激素相关 肽；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素 (TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子 (TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成 素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)， 如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)和粒细胞 -CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子，如 TNF-α或TNF-β；及其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。本文所 用的术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天 然序列细胞因子的生物学活性等同物。
本文针对辅助疗法所用的术语“免疫抑制剂”指发挥作用来抑制或掩 蔽本文所治疗的受试者的免疫系统的物质。这将包括抑制细胞因子产生、 下调或抑制自身抗原表达或掩蔽MHC抗原的物质。这类物质的实例包括 2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(见美国专利号4,665,077)；非类固醇抗炎药 (NSAID)；更昔洛韦；他克莫司；糖皮质激素，如皮质醇或醛固酮；抗 炎剂，如环加氧酶抑制剂；5-脂加氧酶抑制剂；或白三烯受体拮抗剂；嘌 呤拮抗剂，如硫唑嘌呤或麦考酚酸酯(MMF)；烷化剂，如环磷酰胺；溴 隐亭；达那唑；氨苯砜；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美国专利号4,120,649 中所述)；MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素；6-巯基嘌 呤；类固醇，如皮质类固醇或糖皮质激素或糖皮质激素类似物，例如泼尼 松、甲泼尼龙，包括SOLU-MEDROL.RTM、琥珀酸钠甲基强的松龙和地 塞米松；二氢叶酸还原酶抑制剂，如氨甲喋呤(口服或皮下)；抗疟疾剂， 如氯喹和羟氯喹；柳氮磺吡啶；来氟米特；细胞因子或细胞因子受体抗体 或拮抗剂，包括抗干扰素-α、-β或-γ抗体，抗肿瘤坏死因子(TNF)-α抗 体(英利昔单抗(REMICADE.RTM.)或阿达木单抗)，抗-TNF-α免疫黏 附素(依那西普)、抗-TNF-β抗体、抗白介素-2(IL-2)抗体和抗-IL-2受 体抗体，及抗白介素-6(IL-6)受体抗体和拮抗剂；抗-LFA-1抗体，包括 抗-CDlla和抗-CD18抗体；抗-L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛-T 抗体，优选的抗-CD3或抗-CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合结构域的可 溶性肽(W090/08187，1990年7月26日公开)；链激酶；转化生长因子 -β(TGF-β)；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；苯丁 酸氮芥；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T-细胞受体(Cohen等，美国专利号 5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等,Science,251:430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway,Nature,341:482(1989)；和WO91/01133)；BAFF拮 抗剂，如BAFF或BR3抗体或免疫粘附素和zTNF4拮抗剂(综述见Mackay 和Mackay,TrendsImmunol.,23:113-5(2002)，也参见下文的定义)；干扰 T细胞辅助信号的生物活性剂，如抗-CD40受体或抗-CD40配体(CD154)， 包括CD40-CD40配体的封闭抗体(例如Durie等,Science,261:1328-30 (1993)；Mohan等,J.Immunol.,154:1470-80(1995))和CTLA4-Ig(Finck 等,Science,265:1225-7(1994))；及T-细胞受体抗体(EP340,109)，如 T10B9。
本文所用的术语“改善”指病症、疾病、病症或表型(包括异常或症 状)的减少、降低或消除。
疾病或病症(例如炎性肠病，例如溃疡性结肠炎或克隆病)的“症状” 是个体经历并指示疾病的任意病态现象或结构、功能或感觉偏离正常。
表述“治疗有效量”指对预防、改善或治疗疾病或病症(例如炎性肠 病，例如溃疡性结肠炎或克隆病)有效的量。例如，抗体的“治疗有效量” 指对预防、改善或治疗指定的疾病或病症有效的抗体的量。类似地，抗体 和第二化合物的组合的“治疗有效量”指组合起来对预防、改善或治疗指 定的疾病或病症有效的抗体的量和第二化合物的量。
应理解，术语两种化合物的“组合”不意味着该化合物必须在相互的 混合物中施用。因此，这种组合的治疗或用途涵盖化合物的混合物或化合 物的分开施用，且包括在同一天或不同天施用。因此，术语“组合”意指 将两种或多种化合物单独或在相互的混合物中用于治疗。在例如对个体组 合施用抗体和第二化合物时，无论该抗体和第二化合物是单独对个体施用 还是在混合物中对个体施用，在该第二化合物存在于该个体中时，该抗体 也存在于该个体中。在某些实施方案中，在该抗体之前施用抗体以外的化 合物。在某些实施方案中，在该抗体之后施用抗体以外的化合物。
为了本文的目的，“肿瘤坏死因子-α(TNF-α)”指包含Pennica等, Nature,312:721(1984)或Aggarwal等,JBC,260:2345(1985)中所述的氨基 酸序列的人TNF-α分子。
本文的“TNF-α抑制剂”是一般通过与TNF-α结合并中和其活性来 以某种程度抑制TNF-α的生物学功能的物质。本文特别考虑的TNF抑制 剂的实例是依那西普英利昔单抗阿达 木单抗戈利木单抗(SIMPONITM)和赛妥珠单抗
“皮质类固醇”指模拟或扩大天然存在的皮质类固醇的作用的具有类 固醇的一般化学结构的几种合成或天然存在的物质中的任意一种。合成的 皮质类固醇的实例包括强的松、强的松龙(包括甲基强的松龙)、地塞米松、 曲安西龙和倍他米松。
“拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、废止、降低或干扰具体的或指 定的蛋白质的活性(包括其在配体的情况下与一种或多种受体的结合，或 在受体的情况下与一种或多种配体的结合)的分子。拮抗剂包括抗体及其 抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、 生物有机分子、拟肽、药物制剂及其代谢物、转录和翻译控制序列等。拮 抗剂还包括蛋白质的小分子抑制剂、融合蛋白质、与蛋白质特异性结合从 而隔离其与它的靶标的结合的受体分子和衍生物、蛋白质的拮抗变体、针 对蛋白质的反义分子、RNA适体和抗蛋白质的核酶。
术语“检测”包括任何方式的检测，包括直接和间接检测。
本文定义或表征多种其他术语。
II.组合物和方法
A.β7整联蛋白拮抗剂
本发明涉及预测患者对β7整联蛋白拮抗剂治疗的反应的方法。潜在 的拮抗剂的实例包括结合免疫球蛋白与β7整联蛋白的融合物的寡核苷酸， 尤其是抗体，其非限制性地包括多克隆和单克隆抗体和抗体片段、单链抗 体、抗独特型抗体和这类抗体或片段的嵌合或人源化形式，以及人抗体和 抗体片段。备选地，潜在的拮抗剂可以是密切相关的蛋白质，例如，β7整 联蛋白的突变形式，其识别该配体但不赋予效应，从而竞争性抑制β7整 联蛋白的作用。
另一潜在的β7整联蛋白拮抗剂是用反义技术制备的反义RNA或DNA 构建体，其中例如反义RNA或DNA分子通过与所靶向的mRNA杂交而 发挥作用来直接阻断mRNA的翻译，并阻止蛋白质翻译。反义技术可以用 于通过三螺旋形成或反义DNA或RNA来控制基因表达，这两种方法都基 于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，编码本文的β7整联蛋白的多 核苷酸序列的5’编码部分用于设计长度为约10到40个碱基对的反义RNA 寡核苷酸。DNA寡核苷酸设计为与涉及转录的基因的区域互补(三螺旋— —见Lee等,Nucl.AcidsRes.,6:3073(1979)；Cooney等,Science,241:456 (1988)；Dervan等,Science,251:1360(1991))，从而阻止转录和β7整联蛋 白的产生。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交并阻断mRNA分子 翻译为β7整联蛋白蛋白质(反义——Okano,Neurochem.,56:560(1991)； OligodeoxynucleotidesasAntisenseInhibitorsofGeneExpression(CRC Press:BocaRaton,Fla.,1988))。上述寡核苷酸也可以递送至细胞，使得可 以在体内表达反义RNA或DNA来抑制PRO多肽的产生。在使用反义 DNA时，衍生自翻译起始位点，例如靶基因核苷酸序列的约-10和+10位 置之间的寡脱氧核糖核苷酸是优选的。
其他潜在的拮抗剂包括结合活性位点、配体或结合分子结合位点，从 而阻断β7整联蛋白的正常生物学活性的小分子。小分子的实例包括但不 限于小肽或肽样分子，优选为可溶性肽，及合成的非肽酰有机或无机化合 物。
核酶是能够催化RNA的特异性切割的酶促RNA分子。核酶通过与互 补靶RNA序列特异性杂交，接着进行内切核苷酸水解切割而发挥作用。 可以通过已知的技术来鉴定潜在的RNA靶标内特定的核酶切割位点。进 一步的细节见例如Rossi,CurrentBiology,4:469-471(1994)和PCT公开号 WO97/33551(1997年9月18日公开)。
用于抑制转录的三螺旋形成中的核酸分子应是单链，且由脱氧核苷酸 组成。这样设计这些寡核苷酸的碱基组成，使得它通过Hoogsteen碱基配 对规则促进三螺旋形成，其一般需要在双螺旋的一条链上相当大的嘌呤或 嘧啶序列。进一步的细节见例如PCT公开号WO97/33551。这些小分子 可以通过上文讨论的筛选测定中的任意一种或多种和/或通过本领域技术 人员公知的任意其他筛选技术来鉴定。
设计拮抗剂的筛选测定来鉴定与本文鉴定的基因编码的β7整联蛋白 结合或复合，或者干扰所编码的多肽与其他细胞蛋白质的相互作用的化合 物。这类筛选测定将包括能进行化学文库的高通量筛选，使得它们尤其适 合用于鉴定小分子药物候选物的测定。
测定可以以多种形式进行，包括本领域中充分表征的蛋白质-蛋白质结 合测定、生物化学筛选测定、免疫测定及基于细胞的测定。
B.抗-β7整联蛋白抗体
在一个实施方案中，该β7整联蛋白拮抗剂是抗-β7抗体。示例性抗体 包括下文所述的多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、双特异 性抗体和异缀合物抗体等。
1.多克隆抗体
优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来在动 物中产生多克隆抗体。用双功能剂或衍生剂(例如马来酰亚胺基苯甲酰基 磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过 赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或其中R和R1是不同烷基的 R1N＝C＝NR)将相关抗原与在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质(例 如匙孔槭血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂) 缀合可以是有用的。
通过将例如100μg或5μg的蛋白质或缀合物(分别对于兔或小鼠) 与3体积的弗氏完全佐剂组合，并在多个部位皮内注射该溶液来针对抗原、 免疫原性缀合物或衍生物免疫动物。一个月后，通过在多个部位皮下注射 来用弗氏完全佐剂中的初始量的1/5至1/10的肽或缀合物加强免疫动物。 7至14天后，对动物进行采血，并测定血清的抗体效价。加强免疫动物， 直至效价平台期。优选地，用同一抗原的缀合物加强免疫动物，但该抗原 与不同的蛋白质缀合和/或通过不同的交联剂缀合。缀合物还可以作为蛋白 质融合物在重组细胞培养物中制备。另外，适宜地用诸如明矾的聚集剂来 增强免疫反应。
2.单克隆抗体
单克隆抗体可以用最先由Kohler等,Nature,256(1975)495描述的杂 交瘤法制备，或者可以通过重组DNA法制备(美国专利号4,816,567)。
在杂交瘤法中，按上文所述免疫小鼠或其他适宜的宿主动物(如仓鼠) 来引出淋巴细胞，该淋巴细胞产生或能够产生将特异性结合用于免疫的蛋 白质的抗体。备选地，可以体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞， 然后用适宜的融合剂(如聚乙二醇)与骨髓瘤细胞系融合形成杂交瘤细胞 (Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,59-103页 (AcademicPress,1986))。
将这样制备的杂交瘤细胞接种和培养在适宜的培养基中，该培养基优 选包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称为融合配偶体)生 长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核 糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的选择性培养基通常将包含 次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止缺乏HGPRT 的细胞的生长。
优选的融合配偶体骨髓瘤细胞是高效融合、通过所选择的产抗体细胞 支持抗体的稳定高水平产生，且对针对未融合的亲本细胞选择的选择性培 养基敏感的那些。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，如可从Salk InstituteCellDistributionCenter,SanDiego,Calif.USA获得的衍生自 MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，及可从AmericanTypeCulture Collection,Manassas,Va.USA获得的SP-2和衍生物，如X63-Ag8-653细 胞。还针对人单克隆抗体的产生描述了人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤 (heteromyeloma)细胞系(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；和 Brodeur等,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications, 51-63页(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987))。
针对抗该抗原的单克隆抗体的产生测定杂交瘤细胞在其中生长的培养 基。优选地，通过免疫沉淀或通过诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫 吸附测定(ELISA)的体外结合测定来测定杂交瘤产生的单克隆抗体的结 合特异性。
可以例如通过描述于Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)中的 Scatchard分析来测定单克隆抗体的结合亲和力。一旦鉴定出产生具有希 望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，即可以通过有限稀释 法亚克隆该克隆，并通过标准方法培养(Goding,MonoclonalAntibodies: PrinciplesandPractice,59-103页(AcademicPress,1986))。适合用于此目 的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可以例如通 过将细胞腹膜内注射入小鼠，在动物中作为腹水肿瘤体内培养杂交瘤细胞。 通过常规抗体纯化方法(例如亲和层析(例如使用A蛋白或G蛋白 Sepharose)或离子交换层析、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析等)从培 养基、腹水或血清适宜地分离由亚克隆分泌的单克隆抗体。
编码该单克隆抗体的DNA易于用常规方法分离和测序(例如，通过 使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂 交瘤细胞可作为这种DNA的优选的来源。一旦分离，即可以将该DNA放 入表达载体中，然后将该表达载体转染入诸如大肠杆菌(E.coli)细胞、 猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不以其他方式产生免疫球 蛋白蛋白质的骨髓瘤细胞的宿主细胞中，以获得单克隆抗体在该重组宿主 细胞中的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述文章包 括Skerra等,Curr.OpinioninImmunol.,5:256-262(1993)和Pluckthun, Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一实施方案中，可以从用描述于McCafferty等,Nature, 348:552-554(1990)中的技术产生的抗体噬菌体文库分离单克隆抗体或抗 体片段。Clackson等,Nature,352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol., 222:581-597(1991)分别描述了用噬菌体文库分离鼠抗体和人抗体。随后的 公开描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等, Bio/Technology,10:779-783(1992))，以及作为构建非常大的噬菌体文库的 策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等,Nuc.Acids.Res.21:2265-2266 (1993))。因此，这些技术是除传统单克隆抗体杂交瘤技术之外用于分离单 克隆抗体的可行选择。
可以修饰编码抗体的DNA来产生嵌合或融合抗体多肽，例如，通过 用人重链和轻链恒定结构域(CH和CL)序列取代同源鼠序列(美国专利 号4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851(1984))， 或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的编码序 列的全部或部分融合。非免疫球蛋白多肽序列可以取代抗体的恒定结构域， 或者它们可以取代抗体的一个抗原结合部位的可变结构域以产生嵌合二价 抗体，该嵌合二价抗体包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合部位和 对不同抗原具有特异性的另一抗原结合部位。
示例性抗-β7抗体是Fib504、Fib21、22、27、30(Tidswell,M.JImmunol. 1997年8月1日；159(3):1497-505)或其人源化衍生物。Fib504的人源化 抗体详细公开于美国专利公开号20060093601(作为美国专利号7,528,236 授权)中，其内容以其整体引入作为参考(还见下文的讨论)。
3.人和人源化抗体
本发明的抗-β7整联蛋白抗体可以进一步包含人源化抗体或人抗体。 非人(例如鼠)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其 片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含 有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受 体抗体)，其中用来自非人物种(如小鼠、大鼠或兔)的具有希望的特异性、 亲和力和能力的CDR(供体抗体)的残基取代来自受体的互补决定区 (CDR)的残基。在一些情况下，用对应的非人残基取代人免疫球蛋白的 构架残基。人源化抗体还可以包含不见于受体抗体中或输入的CDR或构 架序列中的残基。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构 域的基本上全部，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白 的那些，且全部或基本上全部FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人 源化抗体还将可选地包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免 疫球蛋白的恒定区[Jones等,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等, Nature332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596 (1992)]。
用于人源化非人抗体的方法为本领域公知。通常，人源化抗体具有一 个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称为 “输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。基本上可以按照Winter 及其同事的方法[Jones等,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等, Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等,Science,239:1534-1536(1988)]， 通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代对应的人抗体序列来进行人源化。 因此，这类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中用 对应的来自非人物种的序列取代了基本上不再完整的人可变结构域。实际 上，人源化抗体通常是人抗体，其中用来自啮齿动物抗体中类似位点的残 基取代了一些CDR残基，且可能取代一些FR残基。在抗体预期用于人治 疗用途时，用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链二者)的选 择对降低抗原性和HAMA反应(人抗-小鼠抗体)非常重要。按照所谓的 “最佳适合”法，针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗 体的可变结构域的序列。然后鉴定出最接近于啮齿动物的V结构域序列的 人V结构域序列，并接受其内的人构架区(FR)用于人源化抗体(Sims 等,J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia等,J.Mol.Biol.,196:901 (1987))。另一种方法使用衍生自特定亚型的轻链或重链的所有人抗体的共 有序列的特定构架区。同一构架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter 等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等,J.Immunol. 151:2623(1993))。保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性来人源 化抗体也很重要。为了达到此目的，根据优选的方法，通过用亲本序列和 人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念性人源化产物的方法来制 备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常可得，并为本领域技术人员所熟 悉。说明和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计 算机程序也可得。这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的 功能发挥中可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的 残基。这样，可以从受体序列和输入序列选择和组合FR残基，使得达到 希望的抗体特征，如提高的对一种或多种靶抗原的亲和力。通常，高变区 残基直接且最实质性地涉及影响抗原结合。
考虑多种形式的人源化抗-β7整联蛋白抗体。例如，人源化抗体可以 是抗体片段，如Fab，其可选地与一种或多种细胞毒剂缀合，以便产生免 疫缀合物。备选地，人源化抗体可以是完整抗体，如完整的IgGl抗体。
示例性人源化抗β7抗体包括但不限于rhuMAbβ7，其是抗整联蛋白 亚基β7的人源化单克隆抗体，且衍生自大鼠抗-小鼠/人单克隆抗体FIB504 (Andrew等,1994JImmunol1994；153:3847-61)。已将它改造为包括人 免疫球蛋白IgG1重链和κ1轻链构架，并通过中国仓鼠卵巢细胞来产生。 此抗体结合两种整联蛋白α4β7(Holzmann等1989Cell,1989；56:37-46； Hu等,1992,ProcNatlAcadSciUSA1992；89:8254-8)和αEβ7(Cepek等, 1993JImmunol1993；150:3459-70)，这两种整联蛋白调节胃肠道中的淋巴 细胞亚群的运输和保留，且涉及炎性肠病(IBD)，如溃疡性结肠炎(UC) 和克隆病(CD)。rhuMAbβ7是α4β7和其配体(粘膜地址素细胞黏附分 子-l[MAdCAM]-l、血管细胞黏附分子[VCAM]-1和纤连蛋白)之间的细胞 相互作用以及αEβ7和其配体(E-钙黏着蛋白)之间的相互作用的有效体 外阻断剂。rhuMAbβ7以相似的高亲和力可逆地结合来自兔、食蟹猕猴和 人类的淋巴细胞上的β7。它还以高亲和力结合小鼠β7。rhuMAbβ7及其 变体的氨基酸序列及制备和使用详细公开于美国专利申请公开号 20060093601(作为美国专利号7,528,236授权)中，该申请的内容以其整 体引入。
图1A和1B针对以下显示可变轻链和重链的序列的比对：轻链人亚型 κI共有序列(图1A，SEQIDNO:12)；重链人亚型III共有序列(图1B， SEQIDNO:13)；大鼠抗-小鼠β7抗体(Fib504)可变轻链(图1A，SEQ IDNO:10)；大鼠抗-小鼠β7抗体(Fib504)可变重链(图1B，SEQID NO:11)；及人源化抗体变体：人源化hu504K移植可变轻链(图1A，SEQ IDNO:14)，人源化hu504K移植可变重链(图1B，SEQIDNO:15)，变 体hu504-5、hu504-16和hu504-32(对于变体hu504-5、hu504-16和 hu504-32，来自人源化hu504K移植的氨基酸变异显示在图1A(轻链)(按 出现的顺序分别为SEQIDNO:22-24)和图1B(重链)(SEQIDNO:25) 中)。
4.人抗体
作为人源化之外的选择，可以产生人抗体。例如，现在可能产生转基 因动物(例如小鼠)，其在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白产生的情况下 产生人抗体的所有组成成分。例如，已描述了嵌合和种系突变体小鼠中抗 体重链连接区(J.sub.H)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。 将人种系免疫球蛋白基因阵列转入这类种系突变体小鼠将导致在抗原攻击 时产生人抗体。见例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551 (1993)；Jakobovits等,Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等,Yearin Immuno.7:33(1993)；美国专利号5,545,806、5,569,825、5,591,669(全都 属于GenPharm)；美国专利号5,545,807；和WO97/17852。
备选地，可以用噬菌体展示技术(McCafferty等,Nature348:552-553 [1990])来在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库 产生人抗体和抗体片段。根据此技术，将抗体V结构域基因符合读框地克 隆入丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或次要外被蛋白质基因中，并作 为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。因为丝状颗粒包含噬菌体 基因组的单链DNA拷贝，基于抗体功能特性的选择还导致编码显示那些 特性的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模拟了B细胞的一些特性。噬菌 体展示可以以综述于例如Johnson,KevinS.和Chiswell,DavidJ.,Current OpinioninStructuralBiology3:564-571(1993)中的多种形式进行。可以将 V基因区段的几个来源用于噬菌体展示。Clackson等,Nature, 352:624-628(1991)从衍生自免疫小鼠的脾的V基因的小的随机组合文库分 离了一系列多样化的抗-恶唑酮抗体。可以构建来自未免疫的人供体的V 基因库，且可以基本上按照Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或 Griffith等,EMBOJ.12:725-734(1993)所述的技术分离抗一系列多样化抗 原(包括自身抗原)的抗体。还见美国专利号5,565,332和5,573,905。
如上文所讨论，还可以通过体外活化B细胞来产生人抗体(见美国专 利号5,567,610和5,229,275)。
5.抗体片段
在某些情况下，使用抗体片段而不是完整抗体是有利的。片段的较小 尺寸允许快速清除，且可以导致更易接近实体瘤。
已发展了多种技术来产生抗体片段。通常，通过完整抗体的蛋白水解 消化来衍生这些片段(见例如Morimoto等,JournalofBiochemicaland BiophysicalMethods24:107-117(1992)和Brennan等,Science,229:81 (1985))。但是，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可 以从上文讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。备选地，可以从大肠杆菌 直接回收Fab’-SH片段，并化学偶联来形成F(ab’)2片段(Carter等, Bio/Technology10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细 胞培养物直接分离F(ab’)2片段。用于产生抗体片段的其他技术对熟练的从 业者而言显而易见。在其他实施方案中，所选择的抗体是单链Fv片段 (scFv)。见WO93/16185；美国专利号5,571,894；及美国专利号5,587,458。 抗体片段还可以是描述于例如美国专利号5,641,870中的“线性抗体”。这 类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
6.双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。示例性 双特异性抗体可以结合本文所述的β7整联蛋白的两个不同表位。其他这 类抗体可以将TAT结合部位与用于另一蛋白质的结合部位组合。备选地， 抗-β7整联蛋白臂可以与结合白细胞上的触发分子(如T细胞受体分子(例 如CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32) 和FcγRIII(CD16))的臂组合，以将细胞防御机制集中和定位在表达TAT 的细胞。双特异性抗体还可以用来将细胞毒剂定位至表达TAT的细胞。这 些抗体具有TAT结合臂和结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、 长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、氨甲喋呤或放射性同位素半抗原)的臂。 双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体) 制备。
用于制备双特异性抗体的方法为本领域已知。全长双特异性抗体的传 统产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的 特异性(Millstein等,Nature305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和 轻链的随机分配，这些杂交瘤(quadromas)产生10种不同抗体分子的可 能的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化(通 常通过亲和层析步骤进行)非常麻烦，且产物产率低。WO93/08829和 Traunecker等,EMBOJ.10:3655-3659(1991)中公开了类似的方法。
根据不同的方法，将具有希望的结合特异性(抗体-抗原结合部位)的 抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选地，该融合是与 包含至少部分铰链区、CH2区和CH3区的Ig重链恒定结构域融合。优选 地具有包含轻链结合所必需的部位的第一重链恒定区(CH1)，其存在于该 融合的至少一个中。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果希望)免疫球 蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染入适宜的宿主生物。在 用于构建的不等比例的三条多肽链提供希望的双特异性抗体的最佳产率 时，这为在实施方案中调整三个多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。 但是，在表达等比例的至少两种多肽链导致高产率时，或在该比例对希望 的链组合的产率无显著影响时，可能将两种或全部三种多肽链的编码序列 插入单个表达载体中。
在该方法的优选的实施方案中，该双特异性抗体由一条臂中具有第一 结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂中的杂合免疫球蛋白重链- 轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现此不对称结构便于从不想要的 免疫球蛋白链组合分离希望的双特异性化合物，因为免疫球蛋白轻链仅存 在于该双特异性分子的一半中提供了容易的分离方式。此方法公开于WO 94/04690中。产生双特异性抗体的进一步细节见例如Suresh等,Methodsin Enzymology121:210(1986)。
根据美国专利号5,731,168中所述的另一种方法，可以改造抗体分子对 间的界面来最大化从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比。在优选的 界面至少包含部分C.sub.H3结构域。在此方法中，用更大的侧链(例如酪 氨酸或色氨酸)取代来自第一抗体分子的界面的一个或多个小的氨基酸侧 链。通过用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大的氨基酸侧 链来在第二抗体分子的界面上产生与一个或多个大的侧链相同或相似大小 的补偿“空洞”。这提供了增加异二聚体的产率超过其他不想要的终产物(如 同二聚体)的机制。
双特异性抗体包括交联抗体或“异缀合物”抗体。例如，异缀合物中 的抗体之一可以与抗生物素蛋白偶联，另一种与生物素偶联。例如，已提 出这类抗体将免疫系统细胞靶向至不需要的细胞(美国专利号4,676,980)， 并用于治疗HIV感染(WO91/00360、WO92/200373和EP03089)。可以 用任意方便的交联方法产生异缀合物抗体。适宜的交联剂为本领域公知， 并连同许多交联技术一起公开于美国专利号4,676,980中。
还已在文献中描述了用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如， 可以用化学连接制备双特异性抗体。Brennan等,Science229:81(1985)描 述了蛋白酶解切割完整抗体来产生F(ab')2片段的方法。在二巯基络合剂亚 砷酸钠的存在下还原这些片段，以稳定邻位二巯基并防止分子间二硫化物 形成。然后将产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物： 然后通过用巯基乙胺还原来将Fab’-TNB衍生物之一再转化为Fab’-巯基， 并与等摩尔量的其他Fab’-TNB衍生物混合来形成双特异性抗体。可以将 产生的双特异性抗体用作用于选择性固定酶的物质。
最近的进展已便于从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段，该片段可以化 学偶联来形成双特异性抗体。Shalaby等,J.Exp.Med.175:217-225(1992) 描述了充分人源化的双特异性抗体F(ab')2分子的产生。每个Fab'片段分 别从大肠杆菌分泌，并在体外进行定向化学偶联来形成双特异性抗体。这 样形成的双特异性抗体能够结合过量表达ErbB2受体的细胞和正常的人T 细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶标的裂解活性。还已 描述了用于直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的多种技 术。例如，已用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体。Kostelny等,J.Immunol. 148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白质的亮氨酸 拉链肽与两种不同抗体的Fab’部分连接。在铰链区还原抗体同二聚体形成 单体，然后再氧化形成抗体异二聚体。还可以利用此方法来产生抗体同二 聚体。Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)所述的 “双抗体”技术提供了用于制备双特异性抗体片段的备选机制。片段包含 通过接头与VL连接的VH，该接头太短而不允许同一条链上的两个结构域 间配对。因此，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一片段的互补的VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合部位。还已报道了通过使用单 链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体片段的另一策略。见Gruber等,J. Immunol.152:5368(1994)。
考虑超过二价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等,J. Immunol.147:60(1991)。
7.异缀合物抗体
异缀合物抗体也在本发明的范围之内。异缀合物抗体由两个共价结合 的抗体组成。例如，已提出这类抗体将免疫系统细胞靶向至不需要的细胞 [美国专利号4,676,980]，并用于治疗HIV感染[WO91/00360；WO 92/200373；EP03089]。考虑用合成蛋白质化学中已知的方法(包括涉及 交联剂的那些)在体外制备该抗体。例如，可以使用二硫键交换反应或通 过形成硫醚键来构建免疫毒素。适合用于此目的的试剂的实例包括亚氨基 硫醇盐和甲基-4-巯基butyrimidate和例如美国专利号4,676,980中公开 的那些。
8.多价抗体
多价抗体可以比二价抗体更快地被表达该抗体所结合的抗原的细胞内 化(和/或分解代谢)。本发明的抗体可以是(除IgM种类外的)具有三个 或多个抗原结合部位的多价抗体(例如四价抗体)，其可以容易地通过重组 表达编码该抗体的多肽链的核酸来制备。该多价抗体可以包含二聚化结构 域和三个或多个抗原结合部位。优选的二聚化结构域包含Fc区或铰链区 (或由Fc区或铰链区组成)。在这种情况下，该抗体将包含Fc区及Fc区 氨基端的三个或多个抗原结合部位。优选的本文的多价抗体包含三个至约 八个，但优选四个抗原结合部位(或由三个至约八个，但优选四个抗原结 合部位组成)。该多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其 中该一条或多条多肽链包含两个或多个可变结构域。例如，该一条或多条 多肽链可以包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域， VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽连，X1和X2代表氨基酸 或多肽，n是0或1。例如，该一条或多条多肽链可以包含：VH-CH1-柔 性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗 体优选进一步包含至少两条(且优选四条)轻链可变结构域多肽。例如， 本文的多价抗体可以包含约两条至约八条轻链可变结构域多肽。此处考虑 的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，且可选地进一步包含CL结 构域。
9.效应子功能改造
可以希望就效应子功能修饰本发明的抗体，例如，以增强该抗体的依 赖抗原的细胞毒性(ADCC)和/或依赖补体的细胞毒性(CDC)。这可以 通过在该抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来达到。备选地或此 外，可以在Fc区中引入一个或多个半胱氨酸残基，从而允许在此区域中 形成链间二硫键。这样产生的同二聚体抗体可以具有改善的内化能力和/ 或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。见 Caron等,J.ExpMed.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.,Immunol. 148:2918-2922(1992)。还可以用Wolff等,CancerResearch53:2560-2565 (1993)中所述的异双功能交联剂来制备具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体 抗体。备选地，可以改造抗体，使其具有双Fc区，从而可以具有增强的 补体裂解和ADCC能力。见Stevenson等,Anti-CancerDrugDesign 3:219-230(1989)。为了增加抗体的血清半衰期，可以按例如美国专利号 5,739,277中所述在抗体(尤其是抗体片段)中掺入挽救受体结合表位。本 文所用的术语“挽救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位，其负责增加IgG分子的体内血清半衰期。
10.免疫缀合物
用于本文的方法的拮抗剂或抗体可选地缀合至另一物质，如细胞毒剂 或细胞因子。
缀合通常将通过共价连接实现，其确切的性质将由靶向分子和整联蛋 白β7拮抗剂或抗体多肽上的连接位点决定。通常，通过加入接头来修饰 非肽试剂，该接头允许通过抗-β7整联蛋白抗体的氨基酸侧链、碳水化合 物链或者通过化学修饰引入抗体上的反应基而缀合到该抗体。例如，药物 可以通过赖氨酸残基的ε氨基、通过自由α氨基、通过与半胱氨酸残基的 二硫键交换、或者通过用高碘酸氧化碳水化合物链中的1,2-二醇以允许通 过希夫碱连接附着含有多种亲核试剂的药物来进行附着。见例如美国专利 号4,256,833。蛋白质修饰剂包括胺反应性试剂(例如，反应性酯、异硫氰 酸酯、醛和磺酰卤)、硫醇反应性试剂(例如，卤代乙酰基衍生物和马来酰 亚胺)及羧酸和醛反应性试剂。整联蛋白β7拮抗剂或抗体多肽可以通过 使用双功能交联剂来共价连接到肽试剂。异双功能试剂更常用，且允许通 过使用两种不同的反应性部分(例如胺反应性加上硫醇、碘乙酰胺或马来 酰亚胺)来控制两种不同蛋白质的偶联。这类连接试剂的用途为本领域公 知。见例如Brinkley,上文和美国专利号4,671,958。也可以使用肽接头。 在备选方案中，抗β7整联蛋白抗体多肽可以通过融合多肽的制备连接到 肽部分。
其他双功能蛋白质偶联剂的实例包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二 硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(Ν-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1- 羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚胺酯的双功能衍生物(如二甲基己二酸HCL)、 活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二-叠氮基化合物(如 二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二-重氮衍生物(如二-(对-重氮基苯甲 酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合 物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
11.免疫脂质体
本文公开的抗β7整联蛋白抗体也可以配制为免疫脂质体。“脂质体” 是由多种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊，其用于将药物递 送至哺乳动物。脂质体的成分通常以双层形式排列，类似于生物膜的脂质 排列。通过本领域已知的方法来制备含有抗体的脂质体，如Epstein等,Proc. Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985)；Hwang等,Proc.NatlAcad.Sci.USA 77:4030(1980)；美国专利号4,485,045和4,544,545；及1997年10月23 日公开的WO97/38731中所述。美国专利号5,013,556中公开了具有增强 的循环时间的脂质体。
可以用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺 (PEG-PE)的脂质组合物，通过反相蒸发法来产生尤其有用的脂质体。 将脂质体通过确定孔径的滤器挤出以产生具有所希望直径的脂质体。
可以按Martin等,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所述通过二硫 键交换反应来将本发明抗体的Fab'片段缀合至脂质体。化疗剂可选地包含 在脂质体内。见Gabizon等,J.NationalCancerInst.81(19):1484(1989)。
12.用于抗体产生的载体、宿主细胞和重组方法
还提供分离的编码本文所述抗-β7抗体或多肽试剂的核酸、包含该核 酸的载体和宿主细胞及用于产生该抗体的重组技术。
为了重组产生抗体，可以分离编码它的核酸，并插入可复制载体用于 进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。在另一实施方案中，可以通过 例如美国专利号5,204,244(在此明确引入作为参考)中所述的同源重组来 产生抗体。编码单克隆抗体的DNA易于用常规方法分离和测序(例如， 通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。 许多载体可用。载体成分一般包括但不限于以下一种或多种：信号序列、 复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列， 例如，如1996年7月9日授权的美国专利号5,534,615中所述，其在此明 确引入作为参考。
适合用于克隆或表达本文的载体中的DNA的宿主细胞是上文所述的 原核生物、酵母或高级真核生物细胞。适合用于此目的的原核生物包括真 细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌，肠杆 菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)， 变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，例如，鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonellatyphimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)，例如Serratia marcescans，志贺氏菌属(Shigella)，以及芽抱杆菌属(Bacilli)，如枯草芽 孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.Iicheniformis)(例如，1989年4月12 日公开的DD266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属 (Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属 (Streptomyces)。一个优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，虽然诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC31,537)和大肠杆菌 W3110(ATCC27,325)的其他菌株也适宜。这些实例是说明性的而非限制 性的。
除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是适合用于编码 抗-β7整联蛋白抗体的载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母是低级真核宿主微生物中最常用的。但是，许 多其他属、种和菌株是通常可得到的，并在本文中使用，如粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例 如乳酸克鲁维酵母(K.Iactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、 保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、威克克鲁维酵母(K. wickeramii)(ATCC24,178)、瓦尔提克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC56,500)、 果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母(K. thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属 (yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP183,070)； 假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichodermareesia)(EP244,234)； 粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如许 旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，例如脉孢霉属 (Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲 霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
适合用于表达糖基化的抗-β7抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物。无 脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已鉴定了来自诸如草地夜 蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊子)、 白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster) (果蝇)和家蚕(Bombyxmori)的宿主的许多杆状病毒株和变体及对应 的受纳昆虫宿主细胞。多种用于转染的病毒株是公开可得的，例如苜蓿银 纹夜蛾(Autographacalifornica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5病 毒株，且可以将这类病毒用作本发明的病毒，尤其是用于转染草地夜蛾细 胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、西红柿和烟草的植物细胞培养 物也可以用作宿主。
但是，在脊椎动物细胞中的兴趣最大，且在培养物(组织培养物)中 繁殖脊椎动物细胞已成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是 SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCCCRL1651)；人胚肾细胞 系(293或为在悬浮培养物中生长而亚克隆的293细胞，Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10)；中国仓鼠卵 巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216 (1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))； 猴肾细胞(CVlATCCCCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL- 1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL3A，ATCCCRL1442)；人肺细胞 (W138，ATCCCCL75)；人肝细胞(HepG2，HB8065)；小鼠乳腺肿 瘤(MMT060562，ATCCCCL51)；TRI细胞(Mather等,AnnalsN.Y.Acad. Sci.383:44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(HepG2)。
用上述用于抗-β7整联蛋白抗体产生的表达或克隆载体转化宿主细 胞，并在根据诱导启动子、选择转化体或扩增编码希望的序列的基因的需 要改变的常规营养培养基中培养。
可以在多种培养基中培养用于产生本发明的抗-β7整联蛋白抗体的宿 主细胞。诸如Ham'sF10(Sigma)、MinimalEssentialMedium(MEM) (Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium (DMEM，Sigma)的市售培养基适合用于培养宿主细胞。此外，可以将 Ham等,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等,Anal.Biochem.102:255 (1980)；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或 5,122,469；WO90/03430；WO87/00195；或美国专利公开30,985中所述 的培养基中的任意种用作宿主细胞的培养基。可以根据需要向任意这些培 养基中补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因 子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如 腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCIN.TM.药物)、痕量元素(定义为 通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等同的能量 来源。还可以按本领域技术人员已知的适当浓度包含任意其他必需的补充 物。诸如温度、pH等的培养条件是之前用于所选择的表达宿主细胞的那 些，且对普通技术人员而言显而易见。
在使用重组技术时，抗体可以在胞内产生，产生在周质空间中，或者 直接分泌进入培养基。如果抗体在胞内产生，作为第一步骤，例如通过离 心或超滤去除颗粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了用于分离分泌至大肠杆菌的周质空间的抗体的方 法。简言之，在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存 在下融化细胞糊约30分钟。通过离心去除细胞碎片。在抗体分泌进入培养 基时，通常首先用市售蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或MilliporePellicon 超滤单元)浓缩来自这类表达系统的上清。可以在任意前述步骤中包含蛋 白酶抑制剂(如PMSF)来抑制蛋白水解，且可以包含抗生素来防止外来 污染物的生长。
可以用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析纯化从细胞 制备的抗体组合物，亲和层析是优选的纯化技术。A蛋白作为亲和配体的 适合性取决于抗体中存在的任意免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。 可以用A蛋白来纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等,J. Immunol.Meth.62:1-13(1983))。建议G蛋白用于所有小鼠同种型和人γ3 (Guss等,EMBOJ.5:15671575(1986))。亲和配体所附着的基质最常是琼 脂糖，但其他基质也可用。与用琼脂糖可以达到的流速和处理时间相比， 机械稳定的基质(如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)允许更快的流 速和更短的处理时间。在抗体包含CH3结构域时，用BakerbondABXTM树 脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)进行纯化。取决于待回收的抗体，用于 蛋白质纯化的其他技术(如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相 HPLC、二氧化硅上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳 离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫 酸铵沉淀)也可用。任意一个或多个初步纯化步骤后，可以对包含目的抗 体和污染物的混合物进行低pH疏水作用层析，该层析使用pH在约2.5-4.5 之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行。
C.药物制剂
通过将具有希望的纯度的抗体与可选的生理可用载体、赋形剂或稳定 剂(Remington'sPharmaceuticalSciences第16版，Osol，A.编辑(1980)) 混合，以水溶液、冻干或其他干燥制剂的形式制备包含本发明的治疗剂、 拮抗剂或抗体的治疗制剂用于保存。可用载体、赋形剂或稳定剂在所用的 剂量和浓度下对受体无毒性，且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨 酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八 烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁 醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚； 间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基) 多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙 烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸 或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂， 如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠； 金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如 TWEEN.TM.、PLURONICS.TM.或聚乙二醇(PEG)。
本文的制剂还可以包含所治疗的具体适应症必需的一种以上活性化合 物，优选是相互无不利影响的具有互补活性的那些。这类分子适宜地以对 预期目的有效的量组合存在。
活性成分还可以包载在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊 (例如，分别为羟甲基纤维素微囊或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊) 中、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳 米囊(nanocapsule))中或粗滴乳状液中。这类技术公开于Remington's PharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。
待用于体内施用的制剂必须无菌。这易于通过滤过无菌滤膜来实现。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的适宜的实例包括含有本发明的免疫球 蛋白的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成形物品的形式，例如膜 或微囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯) 或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L- 谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共 聚物如LUPRONDEPOT.TM.(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成 的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇 酸的聚合物使得能够释放分子超过100天，而某些水凝胶释放蛋白质较短 时期。包封的免疫球蛋白长时间存留在体内时，它们可由于在37℃暴露于 湿度而变性或聚集，导致生物学活性的丧失和可能的免疫原性改变。取决 于所涉及的机制，可以设计合理的策略来稳定。例如，如果发现聚集机制 是通过硫代二硫化物(thio-disulfide)交换形成分子间S-S键，那么可以 通过修饰硫氢残基、从酸性溶液冻干、控制含水量、使用适当的添加剂和 发展特异性聚合物基质组合物来达到稳定。
D.治疗方法
整联蛋白β7拮抗剂，例如本发明的抗-β7抗体(及附属治疗剂)通 过任何合适的方式施用，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内，并且 如果局部治疗需要，损害部内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉 内、腹膜内或皮下施用。此外，通过脉冲输注适当地施用抗体，特别是利 用下降剂量的抗体。给药可以是任何合适的途径，例如通过注射，例如静 脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是是简短的还是长期的。
本发明的治疗剂将以与良好的医学实践一致的方式配制和施用。在此 背景中考虑的因素包括待治疗的特定病症、待治疗的特定哺乳动物、个体 患者的临床病况、病症原因、活性剂递送位点、施用方法、施用日程和医 学实践者已知的其它因素。治疗剂不需要，而是任选地，与一种或多种通 常用于预防或治疗目标病症的活性剂配制。
活性中度至严重活性UC个体的治疗标准涉及用以下的标准剂量治 疗：氨基水杨酸、口服皮质类固醇、6-巯基嘌呤(6-MP)和/或硫唑嘌呤。 整联蛋白β7拮抗剂(如本文公开的抗-β7整联蛋白抗体)治疗将导致疾病 缓解的改善(疾病的快速控制和/或延长的缓解)，和/或优于用这类个体的 治疗标准达到的临床反应的临床反应。
在一个实施方案中，本发明的患有IBD的人个体中的炎性肠病(IBD) 治疗包括对该个体施用有效量的治疗剂，如抗-β7整联蛋白抗体，且进一 步包括对该个体施用有效量的第二药物，该药物是免疫抑制剂、疼痛控制 剂、抗腹泻剂、抗生素或其组合。
在示例性实施方案中，该第二药物选自氨基水杨酸、口服皮质类固醇、 6-巯基嘌呤(6-MP)和硫唑嘌呤。在另一示例性实施方案中，该第二药物 是另一整联蛋白β7拮抗剂，如另一抗-β7整联蛋白抗体或抗细胞因子的抗 体。
所有这些第二药物可以分别相互组合或它们自身与第一药物组合使 用，使得本文所用的表述“第二药物”并非意味着它是除第一药物外唯一 的药物。因此，第二药物无需是一种药物，但可以组成或包含一种以上这 种药物。
如本文所述的这些第二药物通常以相同的剂量并且按照本文之前所用 的施用途径使用，或者以在这之前使用的剂量的大约从1％至99％使用。 无论如何如果此类第二药物被使用，任选地，它们以比如果第一药物不存 在时更低的量被使用，尤其在后续给药迟于用第一药物初始给药时，从而 消除或减少了由此引起的副作用。例如，用本文的抗-β7整联蛋白抗体的 疗法允许渐渐减少或不持续的施用类固醇。
本文的组合施用包括用分开的制剂或单种药物制剂共同施用，及以任 一顺序连续施用，其中优选存在两种(或所有)活性剂同时发挥其生物学 活性的时期。
第二药物的组合施用包括用分开的制剂或单种药物制剂共同施用(同 时施用)，及以任一顺序连续施用，其中优选存在两种(或所有)活性剂(药 物)同时发挥其生物学活性的时期。
E.FACS分析
使用本领域可用的技术，例如流式细胞术分析(FACS)等，通过生物标 志物(例如但不限于CD4、CD45RA和β7)的组合的表达水平来鉴定多种淋 巴细胞群体。用本领域所用的标准技术如流式细胞术(FACS)鉴定具有这些 标记的不同表达模式的淋巴细胞的亚型群体。
荧光激活细胞分选(FACS)提供了用于根据每个细胞的特异性光散射 和荧光特征将生物细胞的异质性混合物每次一个细胞分选入两个或多个容 器的方法。它是有用的科学仪器，因为它提供了来自单个细胞的荧光信号 的快速、客观和定量的记录，以及具体目的细胞的物理分离。细胞悬液在 狭窄、快速流动的液流的中央输送。这样安排液流，使得细胞之间存在相 对于其直径的大分离。振动机制导致细胞流破裂为单个微滴。调节系统， 使得一个以上细胞处于微滴中的概率低。正好在细胞流破裂为微滴之前， 液流通过荧光测量站，在其中测量每个细胞的目的荧光特征。正好在细胞 流破裂为微滴的点放置充电环。根据之前瞬间的荧光强度测量结果在环上 加电，微滴在它从细胞流破裂时包封相对电荷。然后带电荷的微滴下落通 过静电偏转系统，静电偏转系统将微滴根据其电荷转入容器。在一些系统 中，直接对细胞流施加电荷，微滴破裂保持与细胞流相同符号的电荷。然 后细胞流在微滴破裂后回至中性。
通过流式细胞仪产生的数据可以在单个维度中作图来产生直方图，或 在两个维度中作图来产生点图，或甚至在三个维度中作图。通过产生一系 列亚集抽取(称为“门控”)，可以根据荧光强度顺次分开这些图上的区域。 存在用于诊断和临床目的的具体门控流程。常在对数标尺上作图。由于不 同荧光染料的发射光谱重叠，检测器处的信号必须经过电子补偿以及计算 补偿。通常，可以在开放机器给其他人使用的情况下在别处重新分析用流 式细胞仪累积的数据(LokenMR."ImmunofluorescenceTechniquesin FlowCytometryandSorting":341–53.Wiley.(1990))。
可以以本领域的多种方式定量多种淋巴细胞的量。对于从患者采集的 样品中每个时间点的淋巴细胞亚型，可以计算作为给药前基线水平的百分 比的绝对计数。也可以计算每种亚型的淋巴细胞的绝对计数，其等于绝对 淋巴细胞计数(从血液学测量获得的表示为每微升外周血的淋巴细胞的值) 乘以每种亚型的门控淋巴细胞的百分比(获自流式细胞术分析)。
F.设计治疗方案
药物开发是复杂并且昂贵的过程。估计新药上市的费用在10亿美元或 更多。I期临床试验中不到10％的药物进入批准期。药物在晚期失败的两 个关键原因是缺乏对剂量-浓度反应和非预期的安全性事件之间的关系的 理解。考虑到此情况，关键是有工具帮助预测药物在体内表现如何及协助 临床治疗候选者的成功(LakshmiKamath,DrugDiscoveryand Development；ModelingSuccessinPK/PDTestingDrugDiscovery& Development(2006))。
药物动力学(PK)表征药物的吸收、分布、代谢和清除特性。药效学 (PD)定义对所施用的药物的生理学和生物学反应。PK/PD建模建立了 这两种方法之间的数学和理论联系，并帮助更好地预测药物作用。通过模 拟进行的集成PK/PD建模和计算机辅助试验设计正被整合到许多药物开 发项目中，并具有不断增长的影响(LakshmiKamath,DrugDiscoveryand Development；ModelingSuccessinPK/PDTestingDrugDiscovery& Development(2006))。
PK/PD测试通常在药物开发过程的每个阶段进行。因为开发正变得越 来越复杂、费时和昂贵，许多公司正寻求更好地利用PK/PD数据，以在开 始时消除有缺陷的候选物，并鉴定临床成功机会最高的那些候选物 (LakshmiKamath，上文)。
PK/PD建模方法在确定生物标记反应、药物水平和给药方案之间的关 系中被证明是有用的。药物候选者的PK/PD谱和预测患者对它的反应的能 力对于临床试验的成功是很关键。分子生物学技术中的最近进展和多种疾 病靶标的更好理解已将生物标记验证为药物治疗功效的良好临床指标。生 物标记测定法帮助鉴定对药物候选者的生物反应。一旦在临床上验证了生 物标记，就可以对试验模拟有效建模。生物标记具有达到替代品状态的潜 力，其可以在某天代替药物开发中的临床结果(LakshmiKamath，上文)。
通过以下非限制性实施例来阐明本发明的其他细节。
实施例
实施例1
在中度至严重溃疡性结肠炎患者中评价rhuMabβ7(etrolizumab)的效 力和安全性的II期、随机化、双盲、安慰剂对照研究
临床研究描述
rhuMAbβ7(etrolizumab)的描述
rhuMAbβ7(etrolizumab)是人源化单克隆抗体，其基于人IgG1亚 型IIIVH、κ亚型-IVL共有序列，且特异性抗整联蛋白异二聚体的β7亚基。 参见图1A和B。已显示它以高亲和力结合α4β7(约116pM的Kd)和αEβ7 (约1800pM的Kd)。
此重组抗体具有通过IgG1抗体典型的链间和链内二硫键共价连接的 两条重链(446个残基)和两条轻链(214个残基)。对于本文所述的研究， 它是在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生的。完整的非糖基化rhuMAbβ7 分子的分子量约为144kDa。rhuMAbβ7的每条重链在Asn297处具有一 个保守的N连接糖基化位点。存在于此位点上的寡糖是在CHO细胞中表 达的重组抗体中观察到的那些典型寡糖，主要的糖型是无唾液酸的双分枝 G0和G1聚糖。包含两个G0聚糖且无C端赖氨酸残基的最普遍的rhuMAb β7形式的质量约为147kDa。
rhuMAbβ7药物产品和安慰剂由Genentech制备。它们是澄清至微乳 光、无色至微黄的水溶液。两种溶液都是预期用于IV和SC施用的无菌和 无防腐剂的液体。
研究设计
研究描述
此II期研究是与安慰剂相比较在中度至严重UC患者中评价两个 rhuMAbβ7剂量水平的效力和安全性的随机化、双盲、安慰剂对照、多中 心研究。在第10周(最终研究药物给药后2周)评价主要效力终点，在第6 周评价次要效力终点。
患者按1:1:1的比例在第0、4和8周rhuMAbβ7100mgSC(平剂量 (flatdose))(100mg剂量)，第0周420mgSC(平负荷剂量(flatloadingdose)) 后第2、4和8周300mgSC(本文称为“300mg+LD”，LD＝负荷剂量)或匹 配的安慰剂SC的剂量范围上随机化。图2中显示研究方案。研究划分为 0-35天的筛查期、10周的双盲治疗期、18周的安全性随访期和17个月的 进行性多灶性脑白质病(PML)随访期(随机化后2年)。
前一段中提供的剂量值为标称剂量。II期剂量施用使用小瓶和注射器， 小瓶浓度为150mg/ml。为了能够进行一致的准确剂量施用，选择0.7ml 作为每次皮下(SC)注射的体积。因此，标称100mg剂量臂的实际药物量 为105mg(1x0.7mlSC注射)，标称300mg剂量的实际药物量为315mg(3 x0.7mlSC注射)。420mg的实际负荷剂量为420mg(4x0.7mlSC注射)。 所有SC注射都施用入腹部。因此，“100mg”的剂量和“105mg”的剂量 在本文中可互换使用。此外，“300mg”的剂量和“315mg”的剂量在本 文中可互换使用。
为了符合条件，患者必须具有最少12周按照美国胃肠病学会(ACG) 实践指南诊断为UC的持续时间；即，由组织病理学报告证实的临床证据 和内窥镜检查证据，在某些情况下由MCS≥5或在某些情况下由MCS≥6 证实的中度至严重疾病的证据，包括内窥镜检查子评分≥2，直肠出血子评 分≥1(参见表1)，及距肛外缘最少25cm的疾病活动的内窥镜检查证据。 用于此研究的其他纳入和排除标准在国际专利公开号WO/2012/135589中 提供。
表1.用于评估溃疡性结肠炎活性的Mayo临床评分系统
a每名患者作为他或她自己的对照来建立大便频率的异常程度。
b每日出血评分代表该天最严重的出血。
c医生的总体评估承认三个其他标准，患者每天的腹部不适的记忆和健 康的一般感觉，及其他观察结果，如体检发现和患者的体力状态。
在随机化之前，患者必须已经处于伴行的UC药物的稳定剂量。在第 1天的随机化之前，口服5-氨基水杨酸(5-ASA)和免疫抑制剂(硫唑嘌 呤[AZA]、6-巯基嘌呤[6-MP]或氨甲喋呤)剂量必须已经保持稳定至少4 周。在第1天的随机化之前，接受局部5-ASA或皮质类固醇的患者必须已 经停药2周。在第1天的随机化之前，口服皮质类固醇剂量必须已经保持 稳定2周。在第1天的随机化之前，接受高剂量类固醇的患者必须已经将 剂量降低至≤20mg/天2周。对于在研究治疗期内接受口服皮质类固醇的 患者，必须已经在第10周按每周5-mg强的松或强的松等同物的速率开始 减少类固醇2周，然后按每周2.5mg强的松或强的松等同物的速率减少， 直至停药。对于接受口服免疫抑制剂(口服皮质类固醇以外)的患者，免 疫抑制剂的减量必须已经在第8周开始，且患者必须已经在第10周后完全 停用免疫抑制剂。之前接受抗-TNF疗法的患者必须已经在第1天随机化 来接受研究药物之前最少8周中断该疗法。如果患者在此研究期间的任意 时间经历持久或增加的疾病活性，可以根据研究人员的临床判断来增加或 起始提高类固醇和/或免疫抑制剂剂量的形式的挽救疗法。允许需要挽救疗 法的患者保留在研究中，但中断研究治疗，且在数据分析期间被分类为经 历了治疗失败。
评估患者来确定它们是否未响应常规疗法(包括至少一种抗-TNF剂)。 本文所用的对抗-TNF剂和免疫抑制剂的反应丧失和/或不耐受意指以下。 就抗-TNF剂而言，反应丧失和/或不耐受意指尽管之前用以下的一种或多 种治疗，但活性疾病的症状持续：(a)英利昔单抗：5mg/kgIV，6周内3 个剂量，在第8周评估；(b)阿达木单抗：第0周一个160mgSC剂量， 然后第2周一个80mg剂量，然后在第4和6周40mg，在第8周评估； 或之前的反应后规律安排的维持给药期间复发的活性症状(已反应且未丧 失反应的患者选择性中断治疗不合格)；或对至少一种抗-TNF抗体不耐受 的病史(包括但不排除或限于输注相关反应或注射部位反应、感染、充血 性心力衰竭、脱髓鞘)。就免疫抑制剂而言，反应丧失和/或不耐受意指尽 管之前每周用硫唑嘌呤(≥1.5mg/kg)或等同剂量的6-巯基嘌呤mg/kg(≥ 0.75mg/kg)或氨甲喋呤25mgSC/肌内(或如所示)治疗至少8周，但活 性疾病的症状持续；或不耐受至少一种免疫抑制剂的病史(包括但不排除 胰腺炎、药物热、皮疹、恶心/呕吐、肝功能测试标高、硫代嘌呤S-甲基转 移酶遗传突变、感染)。
向研究治疗的随机化按与皮质类固醇并行治疗(是/否)、与免疫抑制 剂并行治疗(是/否)、之前的抗-TNF暴露(是/否)(除在美国随机化的患 者外)和研究地点分层。
在筛查时(且这将视为基线MCS)、第6周(第4周给药后2周)和 第10周(最后一剂研究药物后2周)用MCS评估UC疾病活性。在这些 相同时间点进行的可屈性乙状结肠镜检查过程中获得结肠的活组织检查。 还在整个研究中收集部分MCS。还用简短的炎性肠病问卷(SIBDQ)和 MCS来评估患者报告的结果(PRO)，其由患者在第1天及第6和10周 完成。此外，在患者日记中收集疾病活性、每日症状和UC的影响，该日 记将由患者从筛查(第1天之前约7天至第1天)及第6和10周的研究就 诊之前至少7天至第6和10周的研究就诊每天完成。还获得血清和粪便样 品进行生物标记分析。在筛查时及第6、10和28周获得粪便进行生物标记 的测量。考虑用于测量的示例性生物标记包括但不限于脂质运载蛋白、钙 防卫蛋白和乳铁蛋白。在筛查时、第1天及第4、6、10、16和28周获得 血清和血浆进行探究性生物标记的测量。
此研究的主要效力终点是第10周时达到临床缓解的患者的比例，临床 缓解定义为MCS绝对降低至≤2，没有单个小分超过1分。附加的次要终 点在研究结果测量中列出，如下文所述。
结果测量
主要效力结果测量
主要效力结果测量是第10周的临床缓解。临床缓解定义为MCS≤2， 没有单个小分超过1分(见表1)。
次要效力结果测量
此研究的次要效力结果测量是(1)第6周和第10周的临床反应，其 中临床反应定义为MCS减少至少3分，且从基线降低30％，直肠出血小 分减少≥1分或绝对直肠出血得分为0或1；(2)第6周的临床缓解(上文 定义)；和(3)第6周和第10周的内窥镜评分和直肠出血评分的指示物。
探究性结果测量
此研究的探究性结果测量是达到反应或缓解的患者中UC发作的时 间。对于此结果测量，发作定义为部分MCS增加2分，伴随3天的连续 直肠出血及可屈性乙状结肠镜检查上的内窥镜评分为2。
安全性结果测量
用以下测量来评估rhumabβ7的安全性和耐受性：(1)按National CancerInstituteCommonTerminologyCriteriaforAdverseEvents(NCI CTCAE)4.0版分级的不良事件和严重不良事件的发生率；(2)生命体征 和安全性实验室测量的临床上显著的变化；(3)由于一个或多个不良事件 而停药；(4)注射部位反应和过敏反应的发生率和性质；(5)感染并发症 的发生率；及(6)通过ATA的发生率测量的免疫原性。
药物动力学测定
从所有患者获得血清样品进行rhuMAbβ7的PK的测定和表征。用经 过验证的桥接ELISA分析血清PK样品，最小可定量浓度为12.5ng/mL。 测定方法之前已描述过(参见例如国际专利公开号WO2012/135589)。简言 之，验证具有比色检测系统的夹心法ELISA来定量人血清中的rhuMAb β7(PRO145223)。按1.0μg/mL用抗rhuMAbβ7抗体包被微量滴定板来捕 获rhuMAbβ7。将稀释好的样品、标准品和对照加至平板并孵育。随后， 加入生物素化抗rhuMAbβ7和缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的链霉抗生 物素进行检测，并孵育。加入过氧化物酶底物(四甲基联苯胺)来显色，并 通过加入1M磷酸来终止反应。在用于检测吸光度的450nm和用于参考 吸光度的620或630nm读板。
药效学测定
为了评价etrolizumab药效学(PD)作用，利用了各使用抗β7抗体的两 种不同测定。除用不同的竞争性抗β7抗体FIB504(其结合与rhuMAbβ7 相同的表位)替代rhuMabβ7外，第一种测定(本文中称为“占据测定”，并 在图2A中示意性显示)基本按之前所述(参见例如国际专利公开号WO 2012/135589)进行。简言之，在整个研究期间的某些时间点收集来自每名 患者的外周血样品。将样品收集在肝素钠真空采血管中，并室温连夜运送 至合同测试机构进行评估。将样品分装、裂解、洗涤，并用荧光标记的抗 β7抗体FIB504(BDBiosciences,SanJose,CA)染色，该抗体在etrolizumab 的存在下不结合β7整联蛋白。还加入抗CD3、CD4、CD45RA、CD19、 CD38和IgD的抗体来鉴定T和B淋巴细胞的具体亚型。然后通过BD FACSCanto来获取样本，并通过对淋巴细胞亚型的门控来分析。以下表2 中进一步描述亚型。
表2.淋巴细胞亚型
在某些实验中将以上表2中所述的T淋巴细胞进一步分析为CD4+或 CD4-。
整个研究期间在2个分开的给药前时间点(筛查时和给药前第1天)及 在某些给药后时间点评价荧光标记的FIB504的结合。在每个研究时间点 评估具有未被占据的β7整联蛋白的T和B细胞亚型的绝对数目，并表示 为各自的给药前基线的百分比(％BL)或表示为偏离基线的变化。基线定义 为给药前(筛查时和给药期第1天)值的平均值。对于每个群组，计算用 etrolizumab或安慰剂治疗的患者的平均绝对计数。
设计第二种测定(在图2B中示意性显示，并在本文中称为“细胞表面 β7整联蛋白检测测定”或“表达测定”)来评估etrolizumab或安慰剂治疗 之前、期间和/或之后存在于淋巴细胞表面上的整联蛋白β7的水平。表达 测定也是用于评估etrolizumab作用机制(MOA)的方法。这是因为在外周 中，etrolizumab与整联蛋白α4β7的结合阻断了与配体MAdCAM-1的相 互作用，并因此假定阻断了肠归巢淋巴细胞运输至肠，导致外周中肠归巢 淋巴细胞的伴随上升。实际上，这已被观察到，且之前在临床前和临床研 究中都已描述过。参见例如国际专利公开号2009/140684和Stefanich等,Br. J.Pharmacol.162:1855-1870(2011)。因此，该测定也称为“MOA测定”。 此外，etrolizumab与整联蛋白αEβ7的结合阻断了与配体E-钙黏着蛋白的 相互作用，且假定在肠中抑制了淋巴细胞在肠中的停留。假定etrolizumab 介导的促炎症白细胞在淋巴组织内的归巢和停留的破坏导致胃肠道中炎症 减少，从而下调IBD的特征性疾病症状，包括与UC和CD相关的那些。
之前已描述过β7表达测定(MOA测定)。参见例如国际专利公开号 WO2009/140684。简言之，通过流式细胞术评价表达β7的T细胞的数目。 除用称为9D8的荧光缀合抗β7抗体(非竞争性抗β7抗体(即能够在 etrolizumab存在下结合β7整联蛋白))替代荧光标记的FIB504外，与上述 占据测定类似地进行该测定。在每个研究时间点评估细胞表面具有β7整 联蛋白表达的T和B细胞亚型的绝对数目，并表示为该细胞亚型的给药前 基线的百分比(％BL)或偏离基线的变化。
为了评价T和B淋巴细胞亚型表面的β7整联蛋白表达水平，通过流 式细胞术评估细胞表面β7表达的中位数荧光强度(MFI)，并对已知荧光团 浓度的荧光标记微球标准品归一化。在给药前及随后的给药后时间点评价 T和B细胞亚型细胞表面上的荧光9D8的等量可溶性荧光染料分子 (MESF)。在每个研究时间点评价表达在T和B细胞亚型细胞表面上的β7 整联蛋白的MESF，并表示为该亚型的给药前基线的百分比(％BL)或偏离 基线的变化。
结肠组织分析
etrolizumab结合异二聚体整联蛋白α4β7和αEβ7的β7亚基。α4β7 在血液和黏膜组织二者中的白细胞亚型上表达，而αEβ7主要限于上皮内 淋巴细胞和黏膜组织中的树突细胞。因此，为了评价作用部位以及循环中 的etrolizumab的药理学和作用机制，除外周血外还评估了结肠组织。在 给药前(筛查)和在某些给药后时间点(第43天和第71天)用标准手术操作从 23名知情同意的研究招募患者收集结肠活检组织。原地处理所收集的样品 组织：在无菌HBSS中洗涤整个活检组织，用HBSS+5mMDTT还原，然 后在培养基中洗涤，并用胶原酶VIII(1.5mg/ml)消化。然后将样品滤过40 μm尼龙滤膜以去除组织碎片。用培养基洗涤细胞悬液，然后用荧光标记 抗体(下文所指出)染色来通过流式细胞术评价。
类似于对外周血细胞进行的流式细胞术测定，通过用荧光标记(PE标 记)的FIB504染色来评估结肠组织T淋巴细胞亚型上的β7整联蛋白受体 的占据，而用荧光标记的9D8(PE标记)评价β7整联蛋白受体的表达。还 加入抗CD3(APC标记)、CD4(PerCP标记)、CD45RA(FITC标记)、αE 整联蛋白(CD103)和α4整联蛋白(CD49d)的抗体来鉴定结肠组织T淋巴细 胞的具体亚型。然后在BDFACSCantollTM或BDFACSCaliburTM(BD Biosciences,SanJose,CAUSA)上获取样本，并通过对表达αEβ7和表达 α4β7的CD3+CD45+、表达αEβ7和表达α4β7的CD3+CD4+CD45+及表 达αEβ7和表达α4β7的CD3+CD4-CD45+T细胞亚型的亚型的门控来分 析。在每个样品收集时间评估通过FIB504(检测未被占据的β7)或9D8(检 测总细胞表面β7)测定的αEβ7+和α4β7+T细胞亚型的百分比，并表示为 该细胞亚型的给药前基线的百分比(％BL)或表示为偏离基线的变化。
还类似于血液(上文所指出)地评价了T淋巴细胞亚型表面上的αE和 β7整联蛋白表达水平的变化。简言之，通过流式细胞术评估细胞表面αE 和β7表达的中位数荧光强度(MFI)，并对已知荧光团浓度的荧光标记微球 标准品归一化。在给药前及随后的给药后时间点评价T细胞亚型细胞表面 上的荧光9D8和抗αE的等量荧光分子(MOEF)。在每个研究时间点评价 表达在T细胞亚型表面上的β7整联蛋白的MOEF，并表示为各细胞亚型 的给药前基线的百分比(％BL)。
定量聚合酶链反应基因表达分析
将活检组织融化和均质化，并按厂家说明书用MiniKit(Qiagen,Hilden,德国)分离核糖核酸(RNA)。用AgilentRNA6000 PicoKit(AgilentTechnologies,Inc.,SantaClara,CA,USA)用Agilent2100 Bioanalyzer评估RNA完整性。将低RNA质量(RNA完整性数目≤5)样品 从分析排除(n＝9)。用High-CapacitycDNAReverseTranscriptionKit(Life TechnologiesCorporation,Carlsbad,CA,USA)将RNA反转录为互补脱氧 核糖核酸。通过实时聚合酶链反应(也称为定量聚合酶链反应)评估基因表 达水平。按照厂家说明书使用人整联蛋白αE(ITGAE)、整联蛋白α4 (ITGA4)、整联蛋白β1(ITGB1)、β7整联蛋白(ITGB7)、白介素(IL)17A、 IL23A、干扰素γ(IFNG)、IL17F、IL1B、IL12B、IL6、肿瘤坏死因子α (TNFA)、黏膜地址素细胞黏附分子-1(MADCAM1)、E-钙黏着蛋白(CDH1) 和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物集(全都来自LifeTechnologies Corporation,Carlsbad,CA,USA)，用TaqManPreAmpMasterMix(Life TechnologiesCorporation,Carlsbad,CA,USA)和试剂(Fluidigm)在 BioMarkTMHDSystem(FluidigmCorporation,SouthSanFrancisco,CA, USA)上运行实时聚合酶链反应。用ΔCt法将ITGAE、ITGA4、ITGB1、 ITGB7、IL17A、IL23A、IFNG、IL17F、IL1B、IL12B、IL6、TNFA、 MADCAM1和CDH1表达归一化至GAPDH表达。
免疫组织化学和图像定量
将福尔马林固定的组织样品包埋在石蜡块中，并切为4μM切片进行 染色。用抗整联蛋白αE抗体(EPR4166；Abcamplc,Cambridge,MA,USA) 在BenchmarkXT(VentanaMedicalSystems,Inc.,Tucson,AZ,USA)自动 染色仪上进行染色，用3,3”-二氨基联苯胺显色，并用苏木精复染。
通过OlympusNanozoomer自动载玻片扫描平台(Hamamatsu PhotonicsK.K.,Bridgewater,NJ,USA)按200x最终放大率获取全载玻片图 像。经扫描的载玻片作为24位RGB图像在软件包(version R2012a；TheMathWorks,Inc.,Natick,MA,USA)中分析。计数总细胞、αE+细胞和与隐窝上皮相关的αE+细胞。用支持向量机和遗传编程的组合来鉴 定隐窝上皮区域，其中单个细胞核节段化，然后如果其总面积的≥25％与 3,3”-二氨基联苯胺共定位时评估为免疫组织化学阳性。
外周血中PD生物标志物评估的结果
为了进行PD生物标志物评估，我们首先确定了细分表2中及上文其 他地方所述的淋巴细胞群体的参数。图3A显示基于CD45RA和β7的表 面表达的外周血CD3+CD4+T细胞的表型细分。根据其归巢特性在表型上 将CD3+CD4+T细胞细分为CD3+CD4+CD45RA-β7高T细胞(黏膜归巢)、 CD4+CD45RA-β7低T细胞(外周归巢)和CD4+CD45RA+T细胞(良好地运 输至肠和外周淋巴结和组织二者的幼稚T细胞)的亚型。还在总CD3+和 CD3+CD4-T细胞上评价了相似的表型细分(未显示)。这些表型细分与之 前在科学文献中报道的那些一致。参见例如Rott等,J.Immunol 156:3727-3736(1996)；Rott等,J.ClinInvest100:1204-1208(1997)； Williams等,J.Immunol.161:4227-4235(1998)；Rosé等,J.Virol. 72:726-730(1998)；Williams等,J.Immunol159:1746-1752(1997)；及 Butcher等,Adv.Immunol.72:209-253(1999)。我们还细分了图3B中所示 的B淋巴细胞的群体。在此，外周血CD19+B细胞的表型细分基于IgD 和β7的表面表达。根据其归巢特性在表型上将CD19+B细胞细分为 CD19+IgD-β7高B细胞(黏膜归巢)、CD19+IgD-β7低B细胞(外周归巢)和 CD19+IgD+B细胞(良好地运输至肠和外周淋巴结和组织二者的幼稚B细 胞)的亚型。在确定用于细分淋巴细胞群体的参数后，我们然后转入对来自 上述etrolizumabII期研究的患者样品进行PD生物标志物评估。
使用占据测定，我们检查了按照上述临床研究设计用etrolizumab或 安慰剂给药前和给药后β7整联蛋白在外周血T和B淋巴细胞上的占据。 图4A显示皮下(SC)施用100mg或300mg+负荷剂量(LD)etrolizumab或安 慰剂后，β7整联蛋白在CD3+CD4+CD45RA-β7高T淋巴细胞上的群组平 均(±SD)占据(表示为基线的百分比)。图4B显示SC施用100mg或300mg+ LDetrolizumab或安慰剂后，β7整联蛋白在CD3+CD4-CD45RA-β7高T淋 巴细胞上的群组平均(±SD)占据(表示为基线的百分比)。图4C显示SC施 用100mg或300mg+LDetrolizumab或安慰剂后，β7整联蛋白在CD19+IgD-β7高B淋巴细胞上的群组平均(±SD)占据(表示为基线的百分比)。概括 起来，这些数据显示，每4周一次(Q4W)施用100mg或300mg+LD etrolizumab后，黏膜归巢表型T细胞(CD3+CD4+CD45RA-β7高和CD3+ CD4-CD45RA-和黏膜归巢表型B细胞(CD19+IgD-β7高)亚型的平均 绝对数目在所有研究群组中都减少，表明etrolizumab在靶细胞上的占据。 安慰剂治疗的患者中不存在明显的β7占据。此外，按较低的100mgQ4W 剂量提供etrolizumab足以在整个给药期期间维持β7受体的最大/近最大占 据。
然后，使用表达测定，我们评价了在外周血中循环的表达β7的T和B 淋巴细胞的数目。结果显示在图5A(肠归巢CD3+CD4+T细胞)、5B(肠归 巢CD3+CD4-T细胞)和5C(肠归巢CD19+B细胞)中。如可见，施用100mg Q4W或300mg+LDetrolizumab后，外周血T细胞(CD3+CD4+CD45RA-β7 高和CD3+CD4-CD45RA-β7高“黏膜”归巢表型)和B细胞(CD19+IgD-β7 高“黏膜”归巢表型)的亚型的中位数绝对数目在所有研究群组中都增加， 表明etrolizumab结合靶细胞。安慰剂治疗的患者中不存在实质性增加。 在评估％基线时，etrolizumab和安慰剂之间就黏膜归巢CD4+和CD19+ 细胞亚型而言的差异在第29、43和71天在统计上显著(p<0.05,Kruskal WallisANOVA)。此外，我们观察到，与300mg+LD群组相比，在100mg Q4W中，外周血中黏膜归巢T和B细胞亚型的评价相似；除CD19+黏膜 归巢B细胞外，300mg+LD和100mg剂量组之间就CD4+、CD4-和CD19+ 亚型而言不存在统计学差异(第5天p<0.03,KruskalWallisANOVA)。我 们还在TNF-IR和患者中观察到了上述亚型的相似评价(数据未 显示)，这是在将数据作为绝对计数％BL而不是偏离基线的绝对计数变化 作图时(数据未显示)。概括起来，这些数据表明，可以在较低的100mgQ4W 剂量下已达到最大增加。
结肠组织中的PD生物标志物评估的结果
我们首先确定了用于评估从结肠活检组织样品获得的T淋巴细胞上的 α4β7表达的参数。代表性结果显示在图6中。图6显示给药前样品中的结 肠组织CD45+CD3+CD4-T淋巴细胞基于αE和β7的细胞表面表达的表型 细分(右上象限，图的带框部分)。还对结肠组织CD45+CD3+和 CD45+CD3+CD4+T淋巴细胞群体进行了相似的表型细分并观察到相似 的结果(未显示)，表明我们可以在所有淋巴细胞亚型中观察到αEβ7表达。
然后我们评估了从取自用etrolizumab(单剂量etrolizumab，100mg) 治疗的代表性患者或取自用安慰剂治疗的代表性患者的结肠活检组织获得 的CD45+CD3+CD4-T淋巴细胞上的αEβ7受体的占据。对于每个治疗臂， 在给药前、在第43天及在第71天获得样品。结果显示在图7中。与给药 前水平相比，etrolizumab治疗后第43和71天的αEβ7+细胞百分比存在 可观察到的降低(图的左侧组)，确认了最大受体占据，且与上述结果一致。 在来自安慰剂治疗患者的细胞中未观察到这种降低(图的右侧组)，且与上 述结果一致。这些数据证明，etrolizumab在肠中存在于患病部位，在患病 部位保持与β7受体结合持续本研究的持续时间(71天)。我们认为这是结肠 组织中T细胞上的αEβ7受体占据的首次证明。
除上述单患者分析外，我们还评估了从来自临床研究的23名患者中的 每一名的结肠活检组织获得CD45+CD3+CD4-T淋巴细胞中的αEβ7占据 和α4β7占据二者。按照上述施用安排，7名患者接受100mgetrolizumab， 7名患者接受300mg+LDetrolizumab，9名患者接受安慰剂。筛查时(给 药前)、第43天和第71天的群组中位数的FACS图显示在图8A(αEβ7占 据)和8B(α4β7占据)中。在图8A和8B的每一图中，施用100mgetrolizumab q4w或300mgq4w+LD后，所有患者中受体阳性T细胞的百分比都降低， 但安慰剂治疗患者中不存在这种降低。此外，在两种剂量水平下及在 etrolizumab施用后所检查的两个时间点，αEβ7和α4β7的每一个都被最大 占据，或几乎被最大占据。与患者相比，我们未观察到TNF-IR 占据的明显差异(数据未显示)。因此，确认了etrolizumab在结肠组织中结 合的靶标(targetengagement)。
其他PD生物标志物评估
如上文所讨论，etrolizumab在100mg和300mg+LD两种剂量下都 最大地占据CD4+β7+T淋巴细胞上的β7受体，外周血中的CD4+β7+T淋 巴细胞相应地特异性增加。就CD19+β7+B淋巴细胞观察到了相似的结果。 在结肠黏膜中，也在两种剂量下观察到了β7受体的最大占据。但是，与 安慰剂相比，在etrolizumab治疗患者中观察到的表达β7的CD4–T细胞 的总体相对频率无差异。
我们还通过qPCR评估了结肠黏膜中整联蛋白β7(图9A)、β1(图9B)、 α4(图9C)和αE(图9D)的表达。如图9A中所示，未通过qPCR观察到 etrolizumab治疗患者和安慰剂之间存在β7基因表达的明显变化，也未观 察到达到临床缓解的那些etrolizumab治疗患者和未达到临床缓解的那些 etrolizumab治疗患者之间存在表达变化。图9B-9D显示缓解者中施用 etrolizumab后的结肠活检组织中β1-、α4-和αE整联蛋白表达存在极小的 变化或无变化。
在进一步评估肠淋巴细胞区室时，与安慰剂相比，在etrolizumab治 疗患者中观察到肠隐窝上皮中αE+细胞的百分比降低(图10A-B)，固有层中 的αE+细胞未明显减少(图11A-B)。此外，与未达到临床缓解的那些患者相 比，来自达到临床缓解的etrolizumab治疗患者的活检组织中上皮细胞相 关αE+细胞的数目减少(图12A)，E-钙黏着蛋白的表达增加(图12B)。 MAdCAM-1表达、淋巴细胞基因表达和炎症细胞因子基因表达的分析揭 示，与未达到临床缓解的那些患者相比，图13中所示基因在来自达到临床 缓解的etrolizumab治疗患者的活检组织中的表达减少(图13A-M)。
我们将其他PD生物标志物评估的结果解释如下。与β7受体在介导淋 巴细胞运输至肠中的作用一致，外周血中而不是结肠黏膜中表达β7的淋 巴细胞的频率相应地提高。虽然在所有etrolizumab治疗患者中观察到最 大β7占据最少10周，但未在所有患者中观察到临床益处，表明尽管阻断 了β7受体，但炎症过程在一些患者中仍持续。这可以解释为免疫细胞的 促炎症活性已经已经驻留在肠中或白细胞运输至肠黏膜的独立于β7的机 制。支持这一点的是，与达到临床缓解的etrolizumab治疗患者不同，在 未达到临床缓解的患者中未观察到淋巴细胞基因表达的减少。对备选炎症 机制的进一步理解将需要在进行长期etrolizumab治疗的患者中探究。
虽然黏膜促炎症细胞因子表达在达到临床缓解的etrolizumab治疗患 者中减少，但E-钙黏着蛋白的表达增加。已显示与健康对照相比，E-钙黏 着蛋白在炎性肠病患者中以较低的水平表达(Arijs等,AmJGastroenterol 106:748-61(2011))，表明所观察到的E-钙黏着蛋白的增加与这些患者中的 黏膜愈合相关。此观察结果为接受etrolizumab的患者中组织学疾病活动 评分的改善所支持。
剂量和剂量方案原理
II期研究中试验的给药方案的原理在I期研究之后确定，且基于I期 患者样品的PK分析和之前所述的群体PK建模。参见例如国际专利公开 号WO2012/135589。在此，我们希望基于获自II期研究中患者的数据改 善该分析，尤其是关于结肠组织中的β7占据。
研究中的两名患者仅接受单剂etrolizumab，且已在给药前及在下文进 一步描述的某些给药后时间点提供结肠活检组织样品。这些患者显示在图 8C中(点虚线)。在我们按上文所述分析结肠组织中的受体占据时，我们发 现两名患者之一在第43天显示占据但该占据在第71天消失。在该患者中， 血清药物水平在第43天为4.7μg/ml，在第71天为0.5μg/ml。在第二名患 者中，我们因为样品不可得而未能分析第43天的占据，但与第一名患者一 样，受体在第71天未被占据。该患者中的血清药物水平在第71天低于检 测极限。
此结果引导我们将已从其获得结肠活检组织的23名患者的每一名中 etrolizumab的血清浓度与在第43天及在第71天从那些结肠活检组织获得 的T细胞上的β7占据水平相比较。那些结果显示在图14中。在血清 etrolizumab浓度为1.7μg/ml或更高的所有患者中都观察到了结肠组织淋 巴细胞上的β7受体的占据。仅接受单剂etrolizumab且其受体在第71天 未被占据的两名患者具有低于1μg/ml的血清浓度。对于显示结肠组织中 的占据的每名患者，血液中存在相应的占据。因此，我们将血清药物水平 和结肠组织中淋巴细胞上的受体占据之间的关系与I期试验中在外周血中 观察到的PK/PD关系相比较。在I期试验中，按之前所述测定受体占据的 预测IC90为1.3μg/ml。此预测IC90与此处所述结肠组织中的占据所需的 血清浓度一致且基本相同。使用这些及来自II期研究的其他数据，我们用 群体PK建模(参见例如国际专利公开号WO2012/135589)确定，预测每4 周100mg剂量或每2周50mg剂量在所试验的患者群体的大多数患者中 维持1.7μg/ml的最小药物血清浓度，该浓度足以维持结肠组织β7占据。
来自上述结果的惊人和意外的结果是，起始etrolizumab治疗(每4周 100mg)后特定时间点外周血中淋巴细胞上的β7受体占据的水平与结肠组 织中淋巴细胞上的β7受体占据的水平基本相同。这是惊人和意外的，因 为单克隆抗体(mAb)的巨大分子量限制其分布容积。通常，由于其大尺寸 和亲水性，mAb的分布限于血管和胞间隙。因此，mAb的中央区室分布 容积(Vc)通常等于或略大于血浆容量(Mascelli等,J.ClinPharmacol47； 553-565(2007)；Lobo等,J.ofPharmaceuticalSci.Bol93,2645-2668 (2004))。因此，通常认为血清中的mAb浓度不代表组织中作用部位处的 mAb浓度。
通过评估组织中的mAb浓度更直接地研究了抗体分布，其中通过活 组织检查或尸体剖检获得组织样品。还用放射性标记抗体研究了mAb的 分布。对于文献中报道的大多数抗体，发现组织/血浆浓度比在0.1-0.5的 范围内(Lin等,TheJ.ofPharmacolandExperiThera288卷,371-378 (1999)；Lobo等,J.ofPharmaceuticalSci.Bol93,2645-2668(2004))。这意 味着，在大多数情况下，组织(除脑组织外)中的mAb浓度约为血液中浓度 的10-50％，而由于血脑屏障的保护，脑中mAb浓度低得多，范围为血液 中浓度的0.05％-0.2％。由于通常认为血清中的mAb浓度不代表作用部位 的mAb浓度，可需要至多高10倍的血清浓度提供足够的暴露来饱和组织 内侧的受体。但是，我们在此发现，在UC患者中，饱和血液中β7受体所 需的血清浓度(1-3μg/mL)与饱和肠组织中β7受体所需的血清浓度(1.7-4 μg/mL)非常相似(基于来自N＝23名患者的数据)。我们认为，这是首次观 察到和描述血液和组织区室之间的这种近乎1:1的关系。这种关系有几种 可能的解释。可能是，血液中可用β7受体的总量(例如表达β7抗原的细胞 的数目)可以比组织中可用β7受体的总量多得多。备选地，可以是，UC 患者中的肠组织比正常组织“更有漏洞”，导致在相同的血清浓度下有更多 的mAb分布入组织。
总之，基于本文所述的研究，外周血(易接近的部位)中的β7受体占据 可以作为结肠组织(较不易接近的部位)中β7受体占据的替代指示物。这可 以应用于etrolizumab及其他整联蛋白β7拮抗剂的剂量选择和给药方案设 计。通过评估血清药物浓度和血液中的β7受体占据来建立PK/PD关系以 鉴定足以饱和血液中受体的血清药物靶浓度，可以，然后可以以相同或几 乎相同的关系将应用于结肠中的患病部位的知识用所述浓度来选择剂量或 设计给药方案，从而在剂量/给药方案选择中提供更大的信心。
虽然已为了理解的清晰性的目的以说明和实例的方式较为详细地描述 了前述发明，但该描述和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的 所有专利和科学文献的公开内容明确以其整体引入作为参考。
机译： 使用生物标志物评估β7整联蛋白拮抗剂的治疗胃肠炎症障碍
机译： 该化合物，药物组合物和制备药物组合物的方法，该药物组合物在哺乳动物中引发整联蛋白受体拮抗剂的作用，用于治疗或预防由哺乳动物整联蛋白受体整联蛋白的拮抗作用介导的病症，以抑制骨骼吸收在哺乳动物中，并用于治疗肿瘤的发展。
机译： 评估整联蛋白β7拮抗剂治疗胃肠炎性疾病疗效的方法
