诱发的鸢尾科植物细胞在治疗敏感性皮肤中的应用

摘要

本发明涉及德氏乳酸杆菌Lactobacillus？delbrueckii诱发鸢尾科Iridaceae的植物细胞的应用以及这些诱发的细胞在治疗敏感性皮肤中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及敏感性皮肤和与降钙素来源的肽(被称为降钙素基因相关肽或 CGRP)的过度合成和/或释放相关的病症的美容治疗或药物治疗。

背景技术

CGRP是由神经末梢产生并释放的一种多肽化学物质。由于CGRP的定位 对于敏感神经纤维(C纤维)是特异性的，所以多个器官或组织，诸如唾液腺、 胃、胰腺、肠、心血管系统、甲状腺或皮肤，接收传入神经元，从而接收CGRP。

由于CGRP的普遍分布，所以，许多病症与CGRP的过度合成和/或释放相 关。具体地，呼吸和炎性疾病、过敏性疾病和皮肤病(诸如包括湿疹，痒疹或 红斑痤疮的皮肤病症)就是这样的情况。

CGRP拮抗剂的用途是有效地治疗在上文提及的所有疾病。

此外，申请人已经证实，敏感性皮肤的本质特征之一与CGRP的释放有关 联。因此，CGRP拮抗剂的用途也可被用于得到敏感性皮肤的预防性和/或治疗 性治疗。

在本文中，“CGRP拮抗剂”是指能够部分抑制或甚至完全抑制CGRP的生 物学作用的任何化合物。

可提及的已知的CGRP拮抗剂例如为CGRP8-37(CGRP的N-端部分的8 至37位的氨基酸序列)或抗-CGRP抗体。

此外，申请人已经证实，在申请FR2738486中，至少一种鸢尾科的提取物 能够降低由辣椒素和/或逆向电刺激(施加到传入神经元)诱导的血管舒张，和 /或致使抑制由敏感神经纤维引起的CGRP释放，和/或致使抑制由CGRP诱导 的输精管平滑肌收缩，并且因此可以用作CGRP拮抗剂，尤其用于治疗敏感性 皮肤和上述提及的疾病。

然而，该提取物并不能够抑制CGRP，而是达到约70％的部分抑制。

因此，仍然存在对具有更显著CGRP拮抗剂活性的组合物的显著需求。

此外，在申请FR2738486中描述的提取物可能含有对于CGRP的拮抗剂活 性有害的化合物，并且培养基中未分泌出产生该拮抗剂活性的分子，从而降低 了培养物的产率。

因此，仍然存在对能够以高产率得到的、具有CGRP拮抗剂活性的组合物 的显著需求。

发明内容

本发明的结果来自于发明人的意外发现：德氏乳酸杆菌属乳酸菌 Lactobacillusdelbrueckiispplactis的提取物对鸢尾属(Iris)植物细胞起到诱发因 子的作用。事实上，当德氏乳酸杆菌属乳酸菌被加入至鸢尾属去分化细胞的培 养物中时，该提取物使得CGRP拮抗剂活性在鸢尾属细胞的细胞内和细胞外过 度表达，诱导对CGRP的最大抑制(约100％)。此外，在外部环境中，产生该 拮抗剂活性的分子的分泌使得能够显著提高培养物的产率。

因此，本发明涉及德氏乳酸杆菌诱发鸢尾科的植物细胞的应用。

本发明还涉及德氏乳酸杆菌通过鸢尾科的植物细胞诱导产生CGRP的拮抗 剂的应用。

本发明还涉及诱发鸢尾科的植物细胞的方法，所述方法包括：在适用于诱 导CGRP拮抗剂活性表达的条件下，使鸢尾科的植物细胞与德氏乳酸杆菌接 触。

本发明还涉及一种具有CGRP拮抗剂活性的组合物的制备方法，所述方法 包括以下步骤：

a)在适用于诱导CGRP拮抗剂活性表达的条件下，在培养基中，使鸢尾科 的植物细胞与德氏乳酸杆菌接触；

b)可选地，从培养基中分离在步骤a)中培养的植物细胞)；以及

c)回收具有CGRP拮抗剂活性的组合物。

本发明还涉及一种具有CGRP拮抗剂活性的组合物，该组合物能够通过该 制备方法来得到。

本发明的一个目的为一种化妆品组合物，该化妆品组合物包括可通过该制 备方法得到的具有CGRP拮抗剂活性的组合物，以及化妆品上可接受的载体。

本发明的另一个目的涉及该化妆品组合物在治疗敏感性皮肤或去头屑治疗 中的应用。

本发明进一步涉及通过上文所述的制备方法得到的具有CGRP拮抗剂活性 的组合物在治疗与CGRP的过度合成和/或释放相关的病症中的应用。

具体实施方式

CGRP拮抗剂活性

在本发明的上下文中，术语“降钙素肽衍生物”、“降钙素基因相关肽”或 “CGRP”是指在中枢神经元和外周神经元中产生的降钙素家族的肽成员，并且在 人类中以两种形式(α-CGRP和β-CGRP)存在。CGRP经由异聚受体和蛋白质 发挥作用，其中，该异聚受体包括连接至G蛋白的受体，被称为“降钙素受体 样受体”或CALCRL，该蛋白质改变受体或RAMP的活性。

在本文中，“CGRP拮抗剂”是指能够部分或甚至完全抑制CGRP的生物学 作用的任何化合物。优选地，根据本发明的CGRP的拮抗剂或具有CGRP拮抗 剂活性的化合物能够产生对CGRP的受体结合的抑制，或通过神经感觉纤维对 抑制CGRP的合成和/或释放产生影响。特别优选地，根据本发明的CGRP的拮 抗剂或具有CGRP拮抗剂活性的化合物能够产生对CGRP的受体结合的抑制。 甚至更优选地，根据本发明的CGRP的拮抗剂或具有CGRP拮抗剂活性的化合 物对CGRP受体具有亲和力。

德氏乳酸杆菌的提取物

在本文中，“德氏乳酸杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)”是指乳酸杆菌属 (Lactobacillus)的非移动的、能够在厌氧条件下使碳水化合物底物发酵成为乳 酸的革兰氏阳性菌。本领域技术人员所熟知的是，德氏乳酸杆菌包括4个亚种： 德氏乳酸杆菌保加利亚菌(Lactobacillusdelbrueckiisppbulgaricus)，德氏乳酸 杆菌乳酸菌(Lactobacillusdelbrueckiispplactis)，德氏乳酸杆菌德氏菌 (Lactobacillusdelbrueckiidelbrueckii)和Lactobacillusdelbrueckiiindicus。

优选地，用作本发明一部分的德氏乳酸杆菌的亚种为德氏乳酸杆菌属乳酸 菌(Lactobacillusdelbrueckiilactis)。德氏乳酸杆菌乳酸亚种尤其包括菌株ATCC 4797、DSM20076、NCDO299、NCIB7854、DSM7290和NCC88。优选地， 在本发明的上下文中使用的德氏乳酸杆菌乳酸菌亚种的菌株为菌株ATCC 4797。

在本发明的框架中所使用的细菌德氏乳酸杆菌可以活的、半活性的、灭活 的或死亡的形式使用。优选地，细菌德氏乳酸杆菌以灭活的或死亡的形式使用。

从本发明的意义上说，“灭活的”微生物是在培养基中暂时或永久地不再能 够形成菌落的微生物。

从本发明的意义上说，“死亡的”微生物是在培养基中永久地不再能够形成 菌落的微生物。死亡的或灭活的微生物可具有完整的或破裂的细胞膜。因此， 术语“灭活的”也表示如下详述的微生物提取物和裂解物。死亡的或灭活的微生 物可通过本领域技术人员已知的任何方法来得到。

根据有利的实施方式，根据本发明所采用的细菌德氏乳酸杆菌为至少部分 灭活的或死亡的。

至少部分灭活的“德氏乳酸杆菌”是指根据本发明的德氏乳酸杆菌细菌的制 剂，包括：相对于在经受灭活方法之前，在初始制剂中含有的活的、未灭活的 所有细菌德氏乳酸杆菌，至少80％、特别是至少85％、更特别是至少90％或至 少95％、或至少99％的灭活的细菌德氏乳酸杆菌(以菌落形成单元(cfu)表示)。 所得到的灭活率取决于灭活方法的施加条件，本领域技术人员根据待得到的灭 活率来调整该灭活方法。根据一个实施方式，本发明包括含有100％灭活的德氏 乳酸杆菌细菌的制剂。

适用于本发明的德氏乳酸杆菌灭活细菌可通过对德氏乳酸杆菌细菌的制剂 进行辐射、热灭活或冻干来制备。这些方法是本领域技术人员所已知的。

根据本发明的德氏乳酸杆菌细菌可以以完整的形式(即基本上以其天然形 式)使用，或者以包括这些细菌的碎片和/或代谢物的提取物或裂解物的形式使 用。

在本发明的意义中，术语“碎片”涉及类似于所述完整细菌的、具有有效诱 发作用的所述细菌的片段。

从本发明的意义上说，术语“代谢物”表示来源于细菌的新陈代谢的任何物 质，尤其是根据本发明所研究的细菌所分泌的以及还具有有效诱发作用的任何 物质。

适用于本发明的提取物或裂解物可利用生长阶段结束时的细菌来制备。

根据优选的实施方式，适用于本发明的细菌德氏乳酸杆菌可以以提取物的 形式来制备。

从本发明的意义上说，提取物通常是指如下所得到的材料：通过被称为细 胞裂解的现象来破坏或溶解生物细胞，从而引起所研究的微生物细胞中天然含 有的细胞内生物组分的释放。在本发明的意义上说，术语“提取物”同样表示通 过所讨论的微生物的裂解所得到的全部裂解物或仅表示其一部分。因此，所使 用的提取物全部或部分地由细菌德氏乳酸杆菌的细胞内生物组分以及细胞壁和 细胞膜的组分构成。有利地是，本发明所使用的提取物可为通过裂解细菌德氏 乳酸杆菌所得到的全部提取物。

可利用不同的技术，诸如例如渗透压休克、热休克；通过超声或在机械应 力，诸如离心或压力下来进行这种细胞裂解。

更具体地，可根据以下方案来得到该提取物：使包括德氏乳酸杆菌细菌的 培养基穿过通French压制机，优选地随后进行多级过滤，以及优选进行冻干。

提取物可以各种形式使用，诸如溶液形式或粉末形式。

本发明人已经证实：特别地，通过上文所述的技术得到的德氏乳酸杆菌属 乳酸菌的提取物在鸢尾属植物细胞上起到诱发因子的作用，而其它革兰氏阳性 菌并不具有该性质。

鸢尾科植物细胞

鸢尾科(Iridaceae)家族(或虹彩(Iridescent))具有大约有750个物种。 该家族的植物主要是利用其芳香性和观赏性。

在鸢尾科的种类中，在本发明的框架中使用的植物细胞包括例如下列属： 罗慕华属(Romulea)、番红花属(Crocus)、鸢尾属(Iris)、唐菖蒲属(Gladiolus)、 庭菖蒲属(Sisyrinchium)和黑花鸢尾属(Hermodactylus)。优选地，在本发明 的框架中使用的植物细胞为来自鸢尾属的植物细胞。

更具体地，本发明的框架中使用的植物细胞可来自德国鸢尾Irisgermanica、 Irisflorentina、香根鸢尾(Irispallida)、彩色番红花Crocusversicolor、Romulea bulbucodium或Gladioluscommunis。优选地，在本发明的框架中所使用的植物 细胞源自于香根鸢尾。

特别优选地，本发明的框架内所使用的植物细胞是诸如上文所限定的去分 化的鸢尾科细胞。

在本文中，“去分化的植物细胞”是指没有展现出具体专化特征，并且能自 身生存而不依靠其它细胞的植物细胞。这些去分化的植物细胞在诱导作用下能 可选地按照其基因组进行任何分化。

在本发明的框架中所使用的植物细胞优选地为体外培养的植物细胞。

与体内培养的植物不同，在植物细胞的体外培养过程中通过物理-化学条件 所施加的选择压力能够在一年中获得可用的标准化植物材料。

诱发方法

本发明涉及诸如上文“德氏乳酸杆菌”一节中所限定的德氏乳酸杆菌，更具 体地德氏乳酸杆菌的提取物，用于诱发诸如上文“鸢尾科植物细胞”一节中所限 定的鸢尾科的植物细胞的应用。

本发明还涉及诱发鸢尾科的植物细胞的方法，所述方法包括：在适用于诱 导诸如上文“CGRP拮抗剂”一节中所限定的CGRP拮抗剂活性表达的条件下， 使诸如上文“鸢尾科植物细胞”一节中所限定的鸢尾科的植物细胞与诸如上文 “德氏乳酸杆菌”一节中所限定的德氏乳酸杆菌，优选与德氏乳酸杆菌属乳酸菌 提取物接触。

在本文中，“诱发”是指通过外源诱发因子在另一生物体或细胞中诱导几乎 不表达的代谢途径，或者在另一生物体或细胞中唤醒沉默的代谢途径的行为。

优选地，在本文中，“诱发”是指通过外源诱发因子在另一生物体或细胞中 激发诸如上文“CGRP拮抗剂”一节中所限定的CGRP拮抗剂活性。

在本文中，“诱发因子”是指能够在另一生物体或细胞中诱导几乎不表达的 代谢途径，或者在另一生物体或细胞中唤醒沉默的代谢途径的分子或生物体。 大量的诱发因子是本领域技术人员已知的，并且包括生物诱发因子(诸如茉莉 酮酸酯及其衍生物)和非生物诱发因子(诸如温度，pH或渗透压休克)。

在本文中，“使…接触”是指在同一培养基中孵育植物细胞和细菌德氏乳酸 杆菌，尤其是德氏乳酸杆菌的提取物。

在本文中，“用于诱导CGRP拮抗剂活性表达的恰当条件”是指时间和温度 的条件，和/或细菌德氏乳酸杆菌属的浓度，它们能够诱导诸如上文“CGRP拮抗 剂”一节中所限定的CGRP拮抗剂活性的表达，优选地能够诱导CGRP拮抗剂 活性的表达，该CGRP拮抗剂活性引起对CGRP受体超过80％、优选超过90％、 更优选95％、96％、97％、98％、99％、最优选100％的抑制。本领域技术人员 通过常规技术能够确定上述条件。

事实上，用于确定CGRP拮抗剂活性表达的技术对于本领域技术人员是熟 知的，并且例如在Calcitoningene-relatedpeptide(CGRP)andItsrolein hypertension,"Sarah-JaneSmillie,SusanD.Brain.BHFCentreofCardiovascular ExcellenceandCentreforIntegrativeBiomedicine,CardiovascularDivision, Franklin-WilkinsBuilding,WaterlooCampus,King’sCollegeLondon,LondonSE1 9NH,UK中描述。

通常，CGRP拮抗剂活性的表达可证实如下：优选在37℃和5％CO₂下， 在DMEM+血清中，培养通过接受体hCALCRL和相关蛋白hRAMPI稳定转染 的、并且在环状AMP(CRE)的应答元件的控制下表达β-内酰胺酶的报道基因 的HEK细胞。然后，用例如至其EC80(通常最终为0.2nM)的对照配体CGRP 和不同剂量的候选组合物分别处理该细胞。在37℃和5％CO₂下孵育，在孵育 2至4小时，例如3小时后，加入β-内酰胺酶的底物。例如孵育2小时后，通 常在室温下，例如使用分光光度计测量β-内酰胺酶的底物的降解。

优选地，根据本发明的诱发方法中，使诸如上文“鸢尾科植物细胞”一节中 所限定的鸢尾科的植物细胞与上文“德氏乳酸杆菌”一节中所限定的德氏乳酸杆 菌，优选德氏乳酸杆菌乳酸亚种的提取物，在26℃的温度下以200μg提取物/ 升培养物的浓度，接触7天。

具有CGRP拮抗剂活性的组合物的制备

本发明还涉及诸如上文“德氏乳酸杆菌”一节中所限定的德氏乳酸杆菌，优 选德氏乳酸杆菌的提取物通过诸如上文“鸢尾科植物细胞”一节中所限定鸢尾科 的植物细胞用于诱导产生诸如上文“CGRP拮抗剂”一节中所限定的CGRP的拮 抗剂的应用。

本发明还涉及具有CGRP拮抗剂活性的组合物的制备方法，所述制备方法 包括以下步骤：

a)在诸如上文“诱发方法”一节中所限定的适用于诱导CGRP拮抗剂活性表 达的条件下，使诸如上文“鸢尾科植物细胞”一节中所限定的鸢尾科的植物细胞 与诸如上文“德氏乳酸杆菌”一节中所限定的德氏乳酸杆菌，优选与德氏乳酸杆 菌的提取物在培养基中接触；

b)可选地，从培养基中分离在步骤a)中培养的植物细胞；以及

c)获得具有CGRP拮抗剂活性的组合物。

在本文中，“使…接触”是指在同一培养基中孵育植物细胞和细菌德氏乳酸 杆菌，尤其是德氏乳酸杆菌的提取物。

在本文中，“培养基”是指包括植物存活和生长所必须的所有营养物质的溶 液。这种培养基对于本领域技术人员是熟知的，并且可例如为“PlantCulture Media:FormulationandUses,EdwinF.George,DavidJ.M.PuttockandHeather J.George”中所描述的。用于本发明的合适的培养基的实例包括在Murashigeand Skoog(1962)Physiol.Plant.15:473-497中所描述的培养基。

在本文中，“用于诱导CGRP拮抗剂活性表达的恰当条件”是指在上文“诱发 方法”一节中所述的相同条件。

在可选步骤b)中，可使用任何常规技术来分离植物细胞和培养基。这种 技术包括，例如离心、过滤或倾析。

在本文中，“具有CGRP拮抗剂活性的组合物”是指包括诸如上文中“CGRP 拮抗剂”一节中所限定的具有CGRP拮抗剂活性的分子的混合物，并且在根据本 发明的方法的步骤a)中，由与德氏乳酸杆菌接触之后的植物细胞产生。因此， 除了含有具有CGRP拮抗剂活性的化合物外，该组合物可含有其它化合物，尤 其是来自植物细胞和/或德氏乳酸杆菌和/或培养基的其它化合物。

尚未确定具有CGRP拮抗剂活性的分子的性质。然而，本申请人已经证实 了具有拮抗剂活性的这些分子仅由培养后的植物细胞来表达，而不通过德氏乳 酸杆菌来表达。

在本发明的具体实施方式中，在步骤c)中获得的具有CGRP拮抗剂活性 的组合物为在阶段b)中分离的植物细胞的提取物。

可使用本领域技术人员已知的任何提取方法来得到阶段b)中分离的植物 细胞的提取物。尤其可提及的是醇类提取物，特别是乙醇或水醇提取物。植物 细胞的提取物还可为如下制备的水性提取物：将分离的植物细胞重新悬浮在优 选与起始培养物体积等量的渗透水中，优选地随后通过高压均化器(HPH)(通 常为1250巴)，优选在4℃下以6000g离心20分钟，例如在为过滤器的 厚过滤器上和/或在GFF过滤器(“重力纤维流”)上进行过滤，以及例如在-20℃ 进行冷冻。

本申请人已经证实：与德氏乳酸杆菌接触使得能够将分泌物诱导至植物细 胞产生的具有CGRP拮抗剂活性的分子的外部环境中。

因此，在本发明的具体实施方式中，获得具有CGRP拮抗剂活性的组合物 的步骤c)在分离培养基的步骤b)之后。该培养基可被冻干、喷雾干燥或浓缩， 或在切向过滤型的分子筛上进行分级，随后根据上面描述的技术进行处理。

在本发明另一具体实施方式中，具有CGRP拮抗剂活性的组合物的制备方 法不包括分离培养基中的步骤a)中培养的植物细胞的步骤，并且因此，步骤c) 中获得的具有CGRP拮抗剂活性的组合物包括培养基和在步骤a)中诱发的培 养的植物细胞。

在本文中，“具有CGRP拮抗剂活性的组合物”是指包括诸如上文“CGRP拮 抗剂”一节中所限定的包括具有CGRP拮抗剂活性的分子的混合物，并且根据本 发明的方法，通过在步骤a)中使植物细胞与德氏乳酸杆菌接触后产生。因此， 除了含有具有CGRP拮抗剂活性的化合物外，该组合物可含有其它化合物，尤 其是来自植物细胞和/或德氏乳酸杆菌和/或培养基的其它化合物。

因此，本发明还涉及具有CGRP拮抗剂活性的组合物，该组合物能够通过 上文所述的根据本发明的制备方法来得到，优选通过上文所述的根据本发明的 制备方法来得到。优选地，具有CGRP拮抗剂活性的组合物包括来自德氏乳酸 杆菌的化合物。

尚未确定具有CGRP拮抗剂活性的分子的性质。然而，本申请人已经证实 了具有拮抗剂活性的这些分子仅通过培养的植物细胞来表达，而不通过德氏乳 酸杆菌来表达。

化妆品和药物组合物

本发明还涉及一种化妆品或药物组合物，该化妆品或药物组合物包括诸如 上文“具有CGRP拮抗剂活性的组合物的制备”一节中所限定的具有CGRP拮抗 剂活性的组合物，以及化妆品上或药学上可接受的载体。

在本文中，术语“化妆品上可接受的载体”表示不具有令人不快的气味或外 观的介质，并且在施用期间，尤其是在将其局部施用至皮肤和皮肤附件期间不 会引起使用者不能接受的刺痛、紧绷或发红。

在本文中，“药学上可接受的载体”是指在人或动物中无副作用(例如过敏) 产生的任何溶剂、分散介质、吸收延迟剂等。药学上可接受的载体是本领域技 术人员所熟知的，并且包括“Remington'sPharmaceuticalSciences”(Mack PublishingCompany,Easton,USA,1985)中所描述的那些药学上可接受的载体。

上述化妆品上或药学上可接受的载体将适用于化妆品或药物组合物的施应 用径，尤其适用于化妆品或药物组合物将被施用于其上的基底，以及化妆品或 药学组合物将要被包装的形式，即在室温和大气压力下为固体或液体。

根据本发明，诸如上文“具有CGRP拮抗剂活性的组合物的制备”一节中所 限定的具有CGRP拮抗剂活性的组合物以化妆品或药物组合物的总重量的 0.001％至20％的量，并且优选以化妆品或药物组合物的总重量0.1％至10％的来 使用。

本发明的化妆品或药物组合物可被摄入、注入或涂覆到皮肤(身体的任何 皮肤区域)、头发、指甲或粘膜(口腔、面颊、牙龈、生殖器、结膜)。根据施 用模式，根据本发明的化妆品或药物组合物可为通常使用的任何剂型。

为了局部施用到皮肤上，根据本发明的化妆品或药物组合物可尤其采用水 性溶液或油性溶液，或洗液或乳浆型的分散体，通过将脂肪相分散在水性相 (O/W)或与之相反的(W/O)所得到的乳型的液体或半液体稠度的乳液，或 软型霜或水性凝胶型或无水凝胶型的悬浮液或乳液，或可替代地微胶囊或微粒， 或离子型表面活性剂和/或非离子型表面活性剂的泡沫状分散体。这些化妆品或 药物组合物根据常规方法来制备。

它们也可以以水性溶液、醇溶液或水醇溶液的形式，或以乳霜、凝胶、乳 液或摩丝的形式，或者可替代地以包括在压力下的推进剂的气雾剂组合物的形 式用在头发上。

对于注射，根据本发明的化妆品或药物组合物可为水性或油性洗剂的形式 或以乳浆的形式。对于眼睛，其可为滴剂的形式；以及对于摄入，其也可为胶 囊剂、颗粒剂、糖浆剂或片剂的形式。

根据本发明的化妆品或药物组合物的各种组分的量可为研究领域中常规使 用的量。

具体地，这些组合物构成用于保护、治疗或护理脸、手、脚以及用于主要 解剖褶皱或身体的清洁霜(例如日霜、晚霜、清洁剂、肤色粉底霜、防晒霜)， 粉底液，卸妆乳，用于保护或护理的身体乳，防晒乳，用于皮肤护理的洗液、 凝胶或泡沫体，诸如清洁液、防晒液、人工晒黑液，沐浴组合物，包括杀菌剂 的除臭组合物，须后水凝胶或乳液，脱毛膏，抗昆虫叮咬的抗痛组合物，用于 治疗某些皮肤病(如湿疹、腿溃疡、红斑痤疮、牛皮癣、苔藓病和严重瘙痒、 脓疱或妊娠纹)的组合物。

根据本发明的化妆品或药物组合物还可由构成肥皂或清洁棒的固体制剂组 成。

根据本发明的化妆品或药物组合物也可被包装成包括加压推进剂的气雾剂 组合物的形式。

根据本发明所使用的具有CGRP拮抗剂活性的组合物也可被并入到用于头 发护理的各种组合物，并且尤其是洗发水、头发定型液、处理乳液、定型膏或 定型胶、可选地以着色洗发水形式的染发组合物(特别是氧化染料)、用于头发 的塑型乳液、烫发组合物(特别是用于烫发的第一阶段的组合物)、用于按摩头 发的乳液或凝胶、抗寄生虫洗发水等。

根据本发明的化妆品或药物组合物还可以口腔使用，例如牙膏。在这种情 况下，它们可以含有用于口腔组合物的常规佐剂和添加剂，包括表面活性剂、 增稠剂、保湿剂、诸如二氧化硅的抛光剂、诸如氟化物(特别是氟化钠)的多 种活性成分以及可选的诸如糖精钠的甜味剂。

当根据本发明的化妆品或药物组合物为乳液时，相对于组合物的总重量， 脂肪相的比例可为5wt％至80wt％，优选5wt％至50wt％。在乳液形式的组合物 中所使用的油、蜡、乳化剂和共乳化剂选自在化妆品领域中常规使用的那些。 相对于化妆品或药物组合物的总重量，乳化剂和共乳化剂优选以0.3wt％至 30wt％，并且更优选以0.5wt％至20wt％的量存在于化妆品或药物组合物中。乳 化液可进一步含有脂囊泡。

当根据本发明的化妆品或药物组合物为油性凝胶或溶液时，脂肪相可占该 化妆品或药物组合物的总重量的90％以上。

在已知的方式中，化妆品组合物还可包含化妆品领域中常用的添加剂，如 亲水性或亲脂性凝胶剂、亲水性或亲脂性添加剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、 芳香剂、填充剂、遮蔽剂、气味吸收剂和染料。这些各种添加剂的量为化妆品 领域中常规使用的量，例如化妆品组合物的总重量的0.01％至10％。根据添加 剂的性质可将这些添加剂引入到脂肪相、水性相和/或脂质球中。

对于可在本发明中使用的油或蜡，可提及的是矿物油(凡士林油)、植物油 (牛油树脂的液体馏分、向日葵油)、动物油(角鲨烷)、合成油(Purcelin油)、 硅酮油或蜡(环甲硅油)和氟化油(全氟聚醚)、蜂蜡、巴西棕榈蜡或石蜡。也 可向这些油加入脂肪醇和脂肪酸(硬脂酸)。

对于可在本发明中使用的乳化剂，可提及的是例如硬脂酸甘油酯、聚山梨 醇酯60和由Gattefosse出售的商品名为的PEG-6/PEG-32/硬脂酸乙 二醇酯。

对于可在本发明中使用的溶剂，可提及的是低级醇，尤其是乙醇和异丙醇， 丙二醇。

对于可在本发明中使用的亲水性凝胶剂，可提及的是羧基乙烯基聚合物(卡 波姆)、诸如丙烯酸酯/烷基丙烯酸酯共聚物的丙烯酸类共聚物、聚丙烯酰胺、 诸如羟丙基纤维素的多糖、天然树胶和粘土；亲脂性胶凝剂包括诸如膨润土的 改性粘土、诸如硬脂酸铝的脂肪酸的金属盐以及疏水性二氧化硅、乙基纤维素 和聚乙烯。

根据本发明的化妆品组合物可包含其它亲水性活性试剂，如蛋白质或蛋白 质水解物、氨基酸、多元醇、脲、尿囊素、糖和糖衍生物、水溶性维生素、植 物提取物和羟基酸。

对于亲脂性活性试剂，可提及的是视黄醇(维生素A)及其衍生物、生育 酚(维生素E)及其衍生物、必需脂肪酸、神经酰胺、精油、水杨酸及其衍生 物。

除其它外，根据本发明能够使如上文“具有CGRP拮抗活性的组合物的制 备”一节中所限定的具有CGRP拮抗活性的至少一种组合物与尤其用于预防和/ 或治疗皮肤病症的活性试剂相结合。在这些活性试剂中，可提及的例如为：

调节皮肤分化和/或增殖和/或色素沉着的试剂，诸如视黄酸及其异构体、视 黄醇及其酯、维生素D及其衍生物、诸如雌二醇的雌激素、曲酸或对苯二酚；

抗菌剂，诸如克林霉素磷酸酯、红霉素，或四环素类抗生素；

抗寄生虫剂，特别是甲硝唑、克罗米通或拟除虫菊酯；

抗真菌剂，特别是属于咪唑类的化合物，诸如益康唑、酮康唑或咪康唑或 它们的盐、诸如两性霉素B的多烯化合物、诸如特比萘芬烯的丙胺家族的化合 物；

抗病毒剂，诸如阿昔洛韦；

抗炎剂，特别是甾体抗炎剂，诸如氢化可的松、倍他米松戊酸酯或氯倍他 索丙酸酯；或者非甾体抗炎剂，诸如布洛芬和其盐，双氯芬酸和其盐，乙酰水 杨酸，对乙酰氨基酚或甘草亭酸；

麻醉剂，诸如盐酸利多卡因及其衍生物；

止痒剂，诸如西那利定、异丁嗪或赛庚啶；

角质软化剂，诸如α-和β-羟基羧酸或β-酮羧酸和它们的盐、酰胺或酯；以 及更具体地，羟基酸，诸如乙醇酸、乳酸、水杨酸、柠檬酸和常见的水果酸和 正辛酰基-5-水杨酸；

自由基或自由基清除剂，诸如α-生育酚或其酯、超氧化物歧化酶、某些金 属螯合剂，或抗坏血酸及其酯；

镇痛剂，诸如丝状细菌或丝状菌的提取物，在EP761204中描述，并且以 商品名Mexoryl由Chimex进行销售的线状透明颤菌Vitreoscillafiliformis；

抗脂溢性剂，诸如孕酮；

去头皮屑剂，诸如羟甲辛吡酮或吡啶硫锌；

抗痤疮剂，诸如视黄酸或过氧化苯甲酰；

维生素及其衍生物或其前体，单独使用或以混合物的形式使用；

抗氧化剂；

亲水性UV屏蔽剂或不溶于水和油的UV遮蔽剂；

无机UV过滤剂；

自鞣制剂；

抗糖化剂；

NO合成酶抑制剂；

用于刺激真皮或表皮大分子和/或预防其降解的试剂；

刺激成纤维细胞增殖的试剂；

刺激角质形成细胞增殖的试剂；

真皮松弛剂；

紧致剂；

消光剂；

剥离剂；

保湿剂；

作用于细胞能量代谢的试剂；

驱虫剂；

物质P拮抗剂；

抗皱剂；

抗光老化剂；

着色剂；

珠光剂；以及

颜料。

因此，根据具体的实施方式，本发明涉及一种化妆品或药物组合物，该化 妆品和药物组合物包括具有诸如上文中“具有CGRP拮抗剂活性的组合物的制 备”一节所限定的具有CGRP拮抗剂活性的组合物，以及化妆品上或药学上可接 受的载体，以及选自抗菌剂、抗寄生虫剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗炎剂、止 痒剂、麻醉剂、角质软化剂、抗自由基剂、镇痛剂、抗脂溢性剂、去头皮屑剂、 抗痤疮剂，和/或调节皮肤分化和/或增殖和/或色素沉着的试剂中的至少一种试 剂。

化妆品应用

本申请人已经证实，敏感性皮肤的本质特征之一与CGRP的释放相关，因 此使用具有CGRP拮抗剂活性的组合物能够对敏感性皮肤起到预防性和/或治 愈性治疗。

因此，本发明涉及诸如上文“化妆品或药物组合物”一节中所限定的化妆品 组合物在治疗敏感性皮肤中的应用。

回顾欧洲申请EP0723774，敏感性皮肤可被分为两个主要临床形式，过敏 性皮肤和/或反应性皮肤以及不耐受性皮肤。

过敏性和/或反应性皮肤为对多种因素，诸如环境、情绪、食品、风、摩擦、 刮蹭、肥皂、表面活性剂、具有高钙浓度的硬水、温度变化或羊毛有反应而引 起瘙痒症，也就是发痒或刺痛的皮肤。通常，这些症状与患有或未患有溃疡的 干性皮肤或呈现红斑的皮肤相关。

不耐受性皮肤为对多种因素，诸如环境、情绪、食品有反应，引起发热、 紧绷、刺痛和/或发红过敏的皮肤。通常，这些症状与患有溃疡或未患有溃疡并 且具有红斑的高脂溢性(hyperseborrheic)皮肤或痤疮(acneic)皮肤相关。

此外，在某些解剖部位，诸如主要褶皱(腹股沟、生殖器、腋窝、腘、肛 门、乳房下、肘折痕)和足中，敏感性皮肤尤其反映为与汗水、摩擦、羊毛、 表面活性剂、具有高钙浓度的硬水和/或温度变化相关的痒疹感觉和/或触物痛感 (发热，刺痛)。

本申请人已经表明：包括诸如上文“CGRP拮抗剂”一节中所限定的具有 CGRP拮抗剂活性的组合物的化妆品组合物将避免皮肤和/或粘膜和/或红斑的 刺激和/或触物感痛和/或瘙痒。

更确切地说，由于外源试剂能够改变受影响的组织(皮肤、粘膜)的生物 物理和生物化学常数，所以本发明能够治疗神经性起源的症状。

此外，与其它皮肤相比，敏感性皮肤是更容易对外部因素起反应的皮肤。 在达到发炎之前，敏感性皮肤的刺激首先由主观症状(麻刺感、变热等)开始。

因此，具体地，本发明还涉及诸如在上文中“化妆品或药物组合物”一节中 所限定的化妆品组合物在预防和/或消除对皮肤的刺激和/或皮肤和/或粘膜的溃 疡和/或红斑和/或过热的感觉和/或触物感痛和/或瘙痒中的应用，特别是化妆品 应用。

“敏感性”头皮有更明确的临床症状学：瘙痒和/或刺痛和/或炎症的感觉基本 上是由局部因素诸如摩擦、肥皂、表面活性剂、具有高钙浓度的硬水、洗发水 或洗剂来触发。这些感觉有时也由诸如环境、情绪和/或食品等因素来触发。在 具有这种“敏感性”头皮的个体中，经常观察到头皮的红斑和皮脂溢出以及头皮 屑。

因此，具体地，本发明还涉及诸如上文中“化妆品或药物组合物”一节中所 限定的化妆品组合物在去头皮屑治疗中的应用，特别是化妆品应用。

本发明还涉及敏感性皮肤的化妆品治疗的非治疗方法，其中，将化妆品上 有效量的诸如上文“化妆品或药物组合物”一节中所限定的化妆品组合物施用至 皮肤、头皮和/或粘膜上。

本发明具有的一目的是提供一种用于治疗头皮屑的方法，其中将化妆品上 有效量的诸如上文“化妆品或药物组合物”一节中所限定的化妆品组合物施用至 头皮上。

本文中，术语“化妆品上有效量”表示在本发明的框架中所使用的试剂足以 治疗和/或预防所述化妆品病症的量，其并不导致使用者不能接受的副作用。

明显地，本发明的化妆品治疗的方法可通过这些化合物的常规技术来施用 诸如上文“化妆品或药物组合物”一节中所限定的化妆品组合物来进行。例如， 将乳霜、凝胶、精华液、洗剂、卸妆乳或晒后组合物施用在皮肤上或干燥的头 发上，将头发洗剂、洗发水施用至湿发上，或将牙膏施用至牙龈上。

治疗应用

由于CGRP的广泛分布，所以许多病症与CGRP的过度合成和/或释放相关。 具体地，呼吸性疾病和炎性疾病、过敏性疾病和皮肤病(诸如包括湿疹，痒疹 或红斑痤疮的皮肤病症)就是这样的情况。

本发明进一步涉及诸如上文“具有CGRP拮抗剂活性的组合物的制备”一节 中所限定的具有CGRP拮抗剂活性的组合物，该组合物用于治疗与CGRP的过 量合成和/或释放相关的病症。

本发明还涉及诸如上文“具有CGRP拮抗剂活性的组合物的制备”一节中所 限定的具有CGRP拮抗剂活性的组合物在制备用于治疗与CGRP的过量合成和 /或释放有关的病症的药物组合物中的应用。

本发明还涉及一种治疗受试者中与CGRP的过度合成和/或释放相关的病 症的方法，其中，将治疗有效量的诸如上文“化妆品或药物组合物”一节中所限 定的药物组合物施用至有需要的受试者。

在本文中，“治疗有效量”是指在本发明的框架内使用的试剂的量足以治疗 和/或预防所述疾病，其具有对于任何医学治疗可接受的益处/风险比率。然而， 应该理解的是，对于具体患者的特定治疗有效剂量将取决于多种因素，包括待 治疗的病症；疾病的严重程度；所采用的特定药剂的活性；所采用的具体组合 物；治疗的持续时间；治疗的受试者年龄、体重和状况；以及在医疗领域中众 所周知的类似因素。

与CGRP的过度合成和/或释放相关的病症尤其选自呼吸性疾病和炎性疾 病，过敏性疾病和诸如湿疹、痒疹、红斑痤疮、瘙痒症严重的痤疮，下肢溃疡， 牛皮癣，粉刺和妊娠纹的皮肤疾病所组成的组。

优选地，在本发明的框架内治疗的与CGRP的过度合成和/或释放相关的病 症是皮肤疾病，如湿疹，痒疹，红斑痤疮，严重瘙痒症，痤疮，下肢溃疡，牛 皮癣，粉刺和妊娠纹。更优选地，在本发明的框架内治疗的与CGRP的过度合 成和/或释放相关的病症选自由湿疹、痒疹和红斑痤疮的所组成的组。最优选地， 被视为本发明的一部分的与CGRP的过度合成和/或释放相关的病症是红斑痤 疮。

在说明书和在下列实施例中，除非另有说明，百分比为重量百分比和措辞 为“…和...之间”的数值范围包括所指定的上限和下限。

实施例

实施例1：诱发因子的制备

本实施例示出了可用于实施本发明的德氏乳酸杆菌属乳酸菌的提取物的制 备方法。

在被称为传统MRS的常规培养基上培养德氏乳酸杆菌属乳酸菌。

完全长成后，使细胞通过French压制机。在多级过滤之后，对提取液进行 冻干。

实施例2：鸢尾属去分化植物细胞提取物的制备

本实施例示出了可用于进行本发明的鸢尾属去分化植物细胞提取物的制备 方法。

a)鸢尾属去分化植物细胞的培养

培养基：Murashige&Skoog萘乙酸(NAA)和2激动素0.6，蔗糖20g/l。

艾伦美氏培养(ErlenmeyerCulture)：在400mL的培养体积上，在26℃下， 100rpm搅拌下进行培养15天。

在10L发酵罐中培养：发酵罐中有效的10升，未调整pH值，通过空气控 制的15％的氧分压。在26℃下，100rpm(Rushton)的震荡下进行培养。

在14天的一批中，得到120g鲜重的细胞/升或8g干重/升。

在发酵罐中移植香根鸢尾的预培养物7天后，将细胞诱发因子的水性溶液 无菌引入至该发酵罐中。将培养物在相同条件下维持7天。

b)步骤a)中制得的去分化鸢尾属植物细胞的提取

将培养物通过50μm孔隙率的尼龙过滤器进行过滤，以回收生物量并且去 除条件培养基。

使生物质重新悬浮在与起始培养物等量的反渗透水中。

使该悬浮液在微流体上通过高压均化器(HPH)达到1250巴，然后在4℃ 下以6000g离心20分钟，并且通过GFD和GFF进行过滤。

随后，将最终产物于-20℃下进行冷冻，并被冻干。

从而，得到在2.5g至3.5g之间的提取物/100g新鲜细胞，其为3g/L至4g/L 的培养物。

实施例3：德氏乳酸杆菌的诱发作用的证实

该实施例表明，使用德氏乳酸杆菌属乳酸菌的提取物能够通过去分化的鸢 尾属植物细胞诱导CGRP拮抗剂活性的表达和分泌。

材料和方法

使根据实施例2制备的鸢尾属提取物与不同剂量的根据实施例1制备的德 氏乳酸杆菌属乳酸菌提取物接触或未接触，在HEK细胞系上测试该鸢尾属提取 物，其中，该HEK细胞系经过接受体hCALCRL和相关蛋白hRAMPI稳定转 染。该细胞系在环状AMP(CRE)的应答元件的控制下表达报道基因β-内酰胺 酶。

培养基的组成：

500mLDMEM培养基4.5g/L(葡萄糖)

50mL透析过的血清

12.5mL的Hepes(1M)

5mLpeni/链球菌/两性霉素B(100X)

将提取物以20mg/mL的初始浓度在使用前即时稀释在补充有1％DMSO和 0.1％聚醚酸的1mL的培养基中。

对于一些样品，其溶解并不完全，因此可进行视觉分级：

“好”：完全溶解。

“悬浮液”：相同尺寸的小粒子的均匀混合物。

“颗粒”：不同尺寸的粒子的非均匀混合物。

将细胞在前一天接种到384孔的板上，并在37℃和5％CO₂进行孵育。

24小时后，用至其EC80(最终为0.2nM)的对照配体CGRP和剂量响应 的待测试提取物来处理这些细胞。将提取物预稀释成剂量-响应中的10个点， 第一次稀释至2000mcgmL终浓度，并且连续稀释1/4。

在37℃，5％CO₂下孵育3小时后，加入β-内酰胺酶的底物。

在室温下孵育2小时后，用分光光度计来读板。

根据板中的所包含的对照组，将数据标准化为在0％至100％活性之间。利 用XL拟合软件来绘制剂量-响应曲线，IC50值以μg/ml来表示。

结果

下表1中示出了所得到的结果。

表1：与L.delbrueckii接触，通过鸢尾属植物细胞表达的CGRP的拮抗活 性

条件培养基为已经与植物细胞接触的培养基。

原始培养基为接种前的培养基，其未与植物细胞接触。

因此，这些结果表明，相对于没有诱发因子的对照组，以0.2％的浓度加入 德氏乳酸杆菌导致活性的增加。然而，诱发因子德氏乳酸杆菌单独并没有活性。

因此，申请人已经开发了用于植物细胞的诱发技术，其不仅允许细胞内生 产CGRP的拮抗剂活性，还允许CGRP的拮抗剂活性成分分泌至细胞外，从而 至少以因数2来增加产率。

实施例4:德氏乳酸杆菌与其它诱发因子之间有效性的比较

材料和方法

检测了若干“常规的”鸢尾诱发因子：甲基茉莉酮酸酯、甲壳素和藻朊酸盐； 以及其它“非常规的”诱发因子：CaCl₂、表皮葡萄球菌Staphylococcusepidermidis、 德氏乳酸杆菌、β-D-葡聚糖、AlCl₃和SrCl₂。

根据实施例2制备的去分化的鸢尾属植物细胞上对所有的诱发因子以3种 浓度每种浓度重复三次来进行测试。

如实施例3所述来测量CGRP拮抗剂活性。

结果

下表2示出了所得到的结果。

表2：通过放置与不同诱发因子接触的鸢尾植物细胞表达的CGRP拮抗剂 活性

诱发因子 浓度 来源 ％抑制 - - 细胞内 51 - - 细胞内 32 甲基-茉莉酮酸酯 20mM 细胞内 57 甲基-茉莉酮酸酯 20mM 细胞外 4 甲基-茉莉酮酸酯 100mM 细胞内 54 甲基-茉莉酮酸酯 100mM 细胞外 5 甲基-茉莉酮酸酯 500mM 细胞内 55 甲基-茉莉酮酸酯 500mM 细胞外 0 甲壳素 0.2g/L 细胞内 57 甲壳素 0.2g/L 细胞外 10 甲壳素 1g/L 细胞内 42 甲壳素 1g/L 细胞外 12 甲壳素 5g/L 细胞内 37 甲壳素 5g/L 细胞外 0 藻朊酸盐 0.2g/L 细胞内 60 藻朊酸盐 0.2g/L 细胞外 39 藻朊酸盐 1g/L 细胞内 53 藻朊酸盐 1g/L 细胞外 61 藻朊酸盐 5g/L 细胞内 61 藻朊酸盐 5g/L 细胞外 16 表皮葡萄球菌 0.20％ 细胞内 54 表皮葡萄球菌 0.20％ 细胞外 9 表皮葡萄球菌 1％ 细胞内 50 表皮葡萄球菌 1％ 细胞外 14 表皮葡萄球菌 5％ 细胞内 50 表皮葡萄球菌 5％ 细胞外 16 CaCl₂0.20％ 细胞内 42 CaCl₂0.20％ 细胞外 57 CaCl₂1％ 细胞内 49 CaCl₂1％ 细胞外 68

诱发因子 浓度 来源 ％抑制 CaCl₂5％ 细胞内 69 CaCl₂5％ 细胞外 70 β-D-葡聚糖 0.2g/L 细胞内 83 β-D-葡聚糖 0.2g/L 细胞外 1 β-D-葡聚糖 0.8g/L 细胞内 82 β-D-葡聚糖 0.8g/L 细胞外 -1 β-D-葡聚糖 2.25g/L 细胞内 82 β-D-葡聚糖 2.25g/L 细胞外 0 SrCl₂0.69mg/L 细胞内 79 SrCl₂0.69mg/L 细胞外 0 SrCl₂69.9mg/L 细胞内 79 SrCl₂69.9mg/L 细胞外 1 SrCl₂699mg/L 细胞内 80 SrCl₂699mg/L 细胞外 1 SrCl₂6.99g/L 细胞内 79 SrCl₂6.99g/L 细胞外 7 AlCl₃0.024g/L 细胞内 77 AlCl₃0.024g/L 细胞外 1 AlCl₃0.121g/L 细胞内 80 AlCl₃0.121g/L 细胞外 2 AlCl₃0.603g/L 细胞内 81 AlCl₃0.603g/L 细胞外 26 德氏乳酸杆菌 0.20％ 细胞内 98 德氏乳酸杆菌 0.20％ 细胞外 97 德氏乳酸杆菌 1％ 细胞内 78 德氏乳酸杆菌 1％ 细胞外 86 德氏乳酸杆菌 5％ 细胞内 44 德氏乳酸杆菌 5％ 细胞外 75

仅来自德氏乳酸杆菌属乳酸菌的提取物诱发因子起到诱发因子的作用：观 察到将近100％的抑制。这是使培养基非常活跃(等价于抑制97％的干物质) 的罕见诱发因子之一。最后，该诱发因子在0.2％的最低浓度下是非常活跃的。

应当注意的是，表皮葡萄球菌也为革兰氏阳性菌，但是对鸢尾属培养物并 没有作用。