一种诱导DC-CIK细胞的化合物在肿瘤细胞免疫治疗中的应用

摘要

本发明属于生物治疗领域，涉及五肽UNAM化合物在肿瘤免疫治疗中的应用，实验研究表明，利用多肽诱导CIK或DC-CIK细胞的培养方法，可以有效增强CIK或DC-CIK细胞的增殖与分化作用，提高UNAM-CIK或DC-CIK免疫细胞的杀瘤活性，有望研发增加一种生物治疗新手段。

说明书

技术领域：

本发明属于生物治疗领域，涉及一种化合物在肿瘤免疫治疗中的应用。

背景技术：

生物治疗是除化学治疗、放射治疗和手术治疗以外的一种新型肿瘤内科治疗技术。自体免疫细胞治疗技术作为肿瘤生物治疗技术，已被国家卫生计生委列入允许临床应用的三类技术。肿瘤患者外周血细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK/DC-CIK细胞)治疗技术，属于所述的生物治疗技术，其核心技术为肿瘤患者自体外周血CIK/DC-CIK细胞体外培养及其回输技术。

自体CIK细胞是指，在体外由多种细胞因子诱导患者自体外周血单个核细胞(PBMC)而生成的异质细胞群。恶性肿瘤患者的免疫机能存在不同程度的受损，CD3+、CD8+、CD56+细胞数量降低，增殖后的CIK细胞具有T细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀瘤的特点。

生物免疫疗法DC-CIK，是指与DC细胞共培养的CIK细胞。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillers,CIK)是一类抗肿瘤抗病毒效应细胞，能在体外被诱导并大量增殖。树突状细胞(dendriticcell,DC)是有效的专职抗原提呈细胞，成熟的DC可以通过Ⅱ型组织相容性抗原(MHC-Ⅱ)等途径提呈肿瘤抗原，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制。CIK细胞和DC细胞是细胞免疫治疗的2个重要组成部分，两者联合可确保高效的免疫反应。

与外周血单个核细胞PBMC相比，CIK细胞中CD3+、CD8+、CD56+细胞比例明显升高，CIK细胞对肿瘤细胞有很强的杀伤力，而且CIK细胞越多，杀瘤效果越好。CIK细胞己成为过继细胞免疫治疗的主要手段。

自体外周血DC-CIK细胞是自体DC细胞和CIK细胞共同培养后生成的异质细胞群，DC和CIK共培养24h后，IL12的分泌量是CIK细胞单独培养的6.93倍，可以高表达CD3+、CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞，低表达CD4+CD25+Treg细胞。尽管DC细胞不具备直接杀伤肿瘤细胞作用，但DC细胞可刺激CIK细胞的增殖，分泌多种肿瘤杀伤细胞因子，比如TNFα和干扰素等。自体外周血DC-CIK细胞抗肿瘤效果一般比CIK细胞好，但制备成本较高。自身DC细胞与自身肿瘤抗原共刺激后，可增强抗肿瘤免疫应答，目前常用于肿瘤细胞疫苗的临床预防。

CIK细胞杀伤肿瘤细胞主要通过以下四种途径：

CIK细胞能通过不同的机制识别肿瘤细胞，从而通过细胞毒作用杀死肿瘤细胞；

CIK细胞能诱导肿瘤细胞凋亡，达到杀死肿瘤细胞的目的；

CIK细胞分泌IL-2、IL-6、IFN-γ等多种抗肿瘤的细胞因子；

肿瘤生物治疗的目标是通过人为干预，调节机体自身的免疫系统，提高对肿瘤细胞的识别、抑制功能。

肿瘤免疫治疗具有以下的优越性：

免疫治疗不仅可以直接产生抗肿瘤作用，还能纠正患者的免疫系统，促进机体抗肿瘤的免疫能力；

无放疗、化疗副作用，可减轻患者痛苦；

可用于已产生耐药性肿瘤患者的治疗；

对于晚期肿瘤患者能够迅速缓解症状，提高生存质量；

对术后肿瘤患者防复发效果较好，远期抗肿瘤效果良好；

可单独使用，也可与其它治疗方法联合使用，单次使用有效，多次使用效果更佳。

尿苷二磷酸-N-乙酰胞壁酸(UDP-MurNAc，简称UNAM)是一种五肽类化合物，是合成肽聚糖过程中的一个重要中间产物，参与细胞壁的合成与调控。肽聚糖作为大多数真菌细胞壁的重要组成，是维持细菌细胞形态和渗透压平衡的重要基础，参与真菌的生长和繁殖过程。基于此，本发明在实验研究中，根据文献提供的化合物来源(MainardiJ.L.atal2002,JBiol.chem277:35801-35807)，选用尿苷二磷酸-N-乙酰胞壁酸(UNAM)作为诱导物，以期诱导产生高活性CIK细胞，提高其对肿瘤细胞的识别能力及杀瘤活性，其产生了意想不到的效果。本发明所述UNAM在外周血细胞因子诱导杀伤细胞功能，进而增强其杀瘤活性的作用，迄今尚未见有国内外的相关报道。

发明内容：

本发明提供了一种利用多肽诱导DC-CIK的方法，经该法制备的UNAM-DC-CIK细胞杀瘤活性较常规诱导的DC-CIK得到显著提高。

本发明采用的技术方案是：利用多肽诱导DC-CIK细胞的培养方法，其特征在于向CIK或DC-CIK细胞培养液中加入UNAM诱导CIK或DC-CIK细胞增殖与分化，以提高CIK或DC-CIK细胞的杀瘤作用。

所述向CIK或DC-CIK培养液中加入多肽诱导DC-CIK细胞增殖与分化，具体包含以下步骤：

步骤1：外周血采集，无菌抽取肿瘤疾病患者外周血75ml，肝纳素抗凝并充分混匀，避免凝血；

步骤2：肿瘤抗原获取，室温条件下，外周血1000rpm离心10分钟，收集10ml上层血浆，将收集的血浆加入UNAM-DC-CIK诱导培养基中，所得细胞沉淀用于分离单个核细胞；

步骤3：所得细胞沉淀用生理盐水加至50ml洗涤，1000rpm离心10分钟。弃上清，再次洗涤。轻轻加至淋巴细胞分离液表面，650g条件下离心20分钟。用灭菌的巴氏收集淋巴细胞分离液表层细胞，移至50ml一次性塑料离心管中，加入生理盐水至50ml，混匀，再次洗涤离心；

步骤4：UNAM-DC-CIK细胞培养，离心后弃上清，沉淀用含多肽的诱导培养基重悬，并用稀释液稀释计数，均分至4个75cm²一次性的细胞培养瓶中，放入37℃、5％CO₂(v/v)饱和湿度的培养箱中培养，培养期间根据细胞生长情况适时换液和扩增，直至细胞数达到回输所需。该步骤中，所述的UNAM-DC-CIK诱导培养基多肽浓度为0.01ug/ml～1mg/ml。

发明效果：

本发明利用UNAM可以有效增强巨噬细胞的吞噬能力，增加其抗原递呈能力、促进T细胞分化、促进免疫双向调节以及对免疫细胞的免疫佐剂等特性。通过该诱导培养基培养的DC-CIK细胞，流式细胞仪检测发现，起到关键作用的CD3+、CD56+的无MHC限制性NKT细胞的比例高达82％以上，高于国内外文献报道。同时，其杀瘤作用在实验室检测条件下达到99.2％。体外实验显示，经此方法培养的DC-CIK细胞杀瘤活性高于常规培养的细胞。动物实验显示，经该法制备的UNAM-DC-CIK细胞治疗荷瘤小鼠，其肿瘤负荷可明显降低或消失，延长带瘤生存期。临床应用发现，经该法制备的UNAM-DC-CIK细胞治疗肿瘤患者均不同程度改善了生活质量，延长了生存期，部分病人病情得到缓解甚至治愈，得到广大医务工作者以及肿瘤病患者的认可和重视，为肿瘤的治疗提供了一种更为有效的方法和手段。

附图说明：

图1-UNAM诱导的免疫细胞UNAM-DC-CIK与DC-CIK细胞增殖

图2-UNAM诱导的免疫细胞UNAM-DC-CIK与DC-CIK杀伤肿瘤细胞活性

图3-UNAM诱导的免疫细胞UNAM-DC-CIK与DC-CIK治疗荷瘤小数的生存期结果

实施方式：

以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地了解本发明，但不用于限制本发明。

《实施例1》免疫细胞UNAM-DC-CIK的分离、诱导、培养

患者准备：根据免疫细胞UNAM-DC-CIK治疗的适应症和禁忌症选择适合该治疗的肿瘤患者，告知该治疗所涉及的各种相关信息和注意事项，获得患者及家属的理解和配合；

签署知情同意书，检测血常规；

外周血动员：采血前24小时，应皮下注射GM-CSF150ug；

外周血采集：病人采血前应清淡饮食，无菌抽取肿瘤疾病患者外周血50ml，肝素钠抗凝并充分混匀，避免凝血；

肿瘤抗原获取：外周血室温2000rpm离心沉淀10分钟，收集适量的上层血浆，加入诱导培养基UNAM-DC-CIK诱导培养，细胞沉淀物用于分离单个核细胞；

单个核细胞分离：细胞沉淀物用生理盐水稀释混匀至原体积，轻轻加至淋巴细胞分离液表面，1000rpm条件下离心20分钟；

收集单个核细胞：离心结束，用一次性塑料巴氏小心收集淋巴细胞分离液表层细胞，移至50ml一次性塑料离心管中，加入生理盐水至50ml，混匀；

单个核细胞的洗涤：室温2000rpm离心沉淀5分钟。弃上清，沉淀物用生理盐水再次悬浮混匀，室温2000rpm离心沉淀5分钟；

UNAM-DC-CIK细胞的诱导、培养：离心结束，弃上清，沉淀物用含浓度为10ug/ml的多肽的UDP-MurNAc-DC-CIK诱导培养基悬浮，并用白细胞稀释液适当稀释计数。均分至4个75cm²的一次性塑料细胞培养瓶中，补充UNAM-DC-CIK诱导培养基至50ml/瓶。置37℃、5％CO₂、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养。其间根据细胞的生长状况适时换液扩增，直至细胞数量达到回输所需。

《实施例3》免疫细胞UNAM-DC-CIK的回输

1)预计细胞总数达要求的数目前3天，应取样进行微生物学检测、细胞标志物检测(CD3、CD4、CD8及CD16/56)；

2)细胞质检合格方可进行回输，否则重新进行诱导；

3)回输大约于采血后的8～14天，细胞总数达4×10⁹个后进行首次回输，每天回输一次，每一疗程分4-5次回输完毕；

4)回输过程可采用静脉或局部两个途径进行；

a.静脉回输：将UNAM-DC-CIK细胞生理盐水混悬液，用输血器静脉滴注。在滴注过程中，每5～10分钟轻轻晃动输液袋直至滴完，避免细胞沉降堆积。细胞输注前后均需要生理盐水冲管。细胞回输应在实验室处理完毕后2小时内完成；

b.局部注射：注射部位选择依次为：瘤体、有肿瘤转移的胸腹腔、有肿瘤转移的淋巴结周围；

5)回输过程中应密切观察患者的各种反应情况，作好各种不良反应发生的应急处理预案。

《实施例4》诱导活化的UNAM-DC-CIK细胞与常规诱导的DC-CIK细胞生长特性

1)常规分离外周血单个核细胞，用RPMI-1640调细胞浓度为1×10⁵/ml，分别接种于96孔细胞培养板，每孔100μl，每板8孔，共三板；

2)分别用2×浓缩的UNAM-DC-CIK细胞和2×浓缩的常规诱导的DC-CIK培养液150μl/孔，每板的前四孔标识为实验组、后四孔标识为对照组；

3)置37℃、5％CO₂(V/V)饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养；

4)分别于不同时间段3天、5天、7天，用MTT法检测其OD570；

UNAM诱导的免疫细胞UNAM-DC-CIK与DC-CIK细胞增殖结果如(图1)所示。

《实施例5》检测不同时间段UNAM诱导的免疫细胞UNAM-DC-CIK杀伤肿瘤细胞活性

收集培养诱导7、15、21天的UNAM-DC-CIK细胞和DC-CIK细胞各1×10⁶个；检测不同时段UNAM诱导的免疫细胞UNAM-DC-CIK杀伤肿瘤细胞活性，结果见(图2)。

《实施例6》荷瘤小鼠UNAM-DC-CIK细胞治疗前后生存期检测

1)复苏小鼠黑色素瘤B16细胞株；

2)取C57小鼠脾脏，常规制备小鼠UNAM-DC-CIK细胞和DC-CIK细胞；

3)C57小鼠腋下接种小鼠黑色素瘤B16细胞，每只注射约2.5×10⁶个，共三十只，随机分为三组；

4)从第三天起，每日腹腔注射诱导7天的UNAM-DC-CIK细胞和DC-CIK细胞，共五次，每次每只注射1×10⁶个/0.5ml，空白对照组注射生理盐水0.5ml；

5)观察并记录荷瘤小鼠的生存期，结果见(图3.)。表明UNAM诱导的免疫细胞UNAM-DC-CIK治疗荷瘤小数的生存期可达40天以上，明显高于DC-CIK治疗的天数。