一种CRISPR/Cas9单一转录单元定向修饰骨架载体及其应用

摘要

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9单一转录单元定向修饰骨架载体及其应用。本发明要解决的技术问题是：现有CRISPR/Cas9基因组编辑体系物种通用性低及难以实现Cas9蛋白表达及gRNA转录的协同。本发明的技术方案是：构建CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体，由一个启动子来调控Cas9和向导RNA核心单元的转录。本发明还提供了采用所述的CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体来构建针对目标位点特异性修饰Cas9-gRNA重组载体的方法。本发明提供了一种高效的CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体，可以有效实现基于Pol？II型启动子驱动的Cas9及gRNA单元的协同转录，针对多种真核生物进行简单、快捷、高效的基因组定向遗传修饰。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9单一转录单元定向修饰骨架载体及其应用。

背景技术

近年来，随着模式动、植物基因组测序计划的推进及相关基因操纵技术的完善，针对基因组目标位点构建序列特异性核酸酶(zinc-fingernuclease,ZFN；transcriptionactivator-likeeffectorsnuclease,TALEN；clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedprotein-9,CRISPR/Cas9)，在目标生物基因组特异位点造成DSB，在生物体内源DNA修复系统作用下，可以实现目标基因组不同类型的定向遗传修饰。

CRISPR/Cas9基因组编辑体系中，CRISPR/Cas9对基因组目标序列的特异性切割主要依赖于向导RNA(guidedRNA，gRNA)(tracrRNA及crRNA融合后的单一向导RNA单链)中crRNA与Cas9蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别目标序列上的PAM(protospaceradjacentmotif，前间区序列邻近基序)(5’-NGG-3’就是PAM的特征)及其相邻的20bp左右特异性靶序列(protospacer)。实验操作中需要构建含有Cas9蛋白及gRNA单元的表达载体，通过多样的转化方案，在目标生物细胞中进行Cas9蛋白表达及gRNA单元转录，进而Cas9蛋白与gRNA的核糖核蛋白复合物识别、结合、剪切目标生物基因组特定位点，之后在细胞内源DNA修复途径作用下实现不同类型的定向遗传修饰。

目前使用的CRISPR/Cas9基因组编辑体系中，Cas9与gRNA分别构建于独立的转录、表达单元中：Cas9蛋白表达单元依次由PolII型启动子、Cas9ORF、终止子构成，其中Cas9ORF需要融合NLS序列；gRNA转录单元依次由PolIII型启动子(多使用U6、U3等小RNA转录启动子)、gRNA单元(多采用Hwang等2013发表的tracrRNA+crRNA融合gRNA单元)、PolyT终止子构成。Cas9蛋白表达及gRNA转录单元可以分别构建在两个独立载体上进行共转化，也可以作为两个独立单元构建在单一载体上进行转化。其中：Cas9蛋白的表达可以依据转化目标的特性及实验要求选用适宜PolII型启动子，如在动物细胞中常使用CMV、hsP70、SV40及植物中常用的CaMV35S、ZmUb1、AtUb10等启动子等；gRNA转录单元一般根据转化目标，使用目标基因组中特异的U6、U3等小RNA转录启动子。

但以上CRISPR/Cas9基因组编辑体系中，分别独立的Cas9蛋白表达单元及gRNA转录单元的设计存在固有缺陷，难以实现Cas9蛋白表达及gRNA转录的协同性。同时，由于gRNA单元的转录基本依赖物种偏好性强的U6、U3等PolIII型启动子，针对不同目标生物需要筛选特定的PolIII型小RNA转录启动子，而且也难以实现时空特异性及诱导转录调控，极大的限制了CRISPR/Cas9在基因组定向修饰中的工作效率及应用范围。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：现有CRISPR/Cas9基因组编辑体系难以实现Cas9蛋白表达及gRNA转录的协同性；针对不同目标生物需要筛选特定小RNA转录启动子；难以实现时空特异性及诱导转录调控。

本发明的技术方案是CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体，由一个启动子来调控Cas9和向导RNA核心单元的转录。

具体的，所述的核心单元从5’到3’方向依次为Cas9ORF-PolyA-RZcleavagesite-gRNAcloningscaffold-RZcleavagesite-RZ，且gRNAcloningscaffold至少为一个，gRNAcloningscaffold之间为RZcleavagesite；其中，Cas9ORF即Cas9蛋白编码框，RZcleavagesite即核酶识别切割位点，gRNAcloningscaffold(简写为gRNACS)即gRNA克隆及转录单元，RZ即核酶全酶RiboZyme。

具体的，RNA克隆及转录单元为1～5个。

具体的，Cas9蛋白编码框还包含核定位信号NLS序列，具有如SeqIDNo.1所示的氨基酸序列。

具体的，Cas9蛋白编码框的核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。

具体的，gRNA克隆及转录单元，具有如SeqIDNo.3中所示的核苷酸序列。

具体的，在gRNA克隆及转录单元的5’端还融合了BsaI-ccdB-BsaI单元，融合后具有如SeqIDNo.4所示的核苷酸序列。

具体的，所述的核酶全酶及对应识别的核酶识别切割位点通过以下方式配合使用：

(a)对核酶识别切割位点的核苷酸序列进行取代、缺失或者添加一个或几个核苷酸，且依然被核酶全酶识别切割；

或(b)对核酶全酶进行替换，同时对应替换核酶识别切割位点，替换后的核酶识别切割位点被替换后的核酶全酶识别切割。

具体的，所述的核酶全酶为锤头状核酶、I类内含子、RNaseP、发夹状核酶、丁型肝炎核酶或者VS核酶。

具体的，核酶全酶为锤头状核酶，其编码核苷酸具有如SeqIDNo.6所示的序列。

具体的，所述的核酶识别切割位点被锤头状核酶识别切割，(a)具有如SeqIDNo.5所示的核苷酸序列；

或者(b)在(a)所述的核苷酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个核苷酸，且仍能被锤头状核酶识别切割。

具体的，所述Cas9-polyA-RZcleavagesite-gRNAcloningscaffold-RZcleavagesite-RZ具有如SeqIDNo.7所示的核苷酸序列。

具体的，所述的启动子为PolⅡ型启动子。

具体的，所述的PolⅡ型启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子CaMV35S、玉米Ubi1启动子ZmUbi1、拟南芥Ubi10启动子AtUbi10、巨细胞病毒CMV、热激蛋白70启动子hsP70或猴空泡病毒40启动子SV40。

本发明还提供了针对目标位点特异性修饰Cas9-gRNA重组载体的制备方法，包括如下步骤：

a、明确特定生物基因组目标DNA区域，分析具有PAM特征的区域，选择PAM结构5’端相邻的15～30bpDNA序列作为特异性靶序列；

b、按照选定的特异性靶序列，分别合成具有5’-CGGA-N_X-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-AAAC-N_X-3’特征的反向寡核苷酸链，N表示A、G、C、T中的任一种，X为整数，且14≤X≤30，其中所述正向寡核苷酸链中的N_X和反向寡核苷酸中的N_X具有反向互补特征；通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；

c、将所述的CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体与步骤b得到的互补寡核苷酸双链片段混合，反应体系中同时加入BsaI内切酶及T4DNA连接酶，设置“37℃酶切-16℃连接”循环反应，得到针对目标位点特异性修饰Cas9-gRNA重组载体。

具体的，步骤a中特异性靶序列长度为18～21bp。

优选的，步骤a中特异性靶序列长度为20bp。

优选的，步骤b中18≤X≤21。

优选的，步骤c中应用融合PCR扩增策略，得到由核酶识别切割位点(RZcleavagesite)间隔的多个gRNA转录单元串联扩增产物，通过“BsaI酶切-T4DNA连接酶连接”循环反应的方式，替换BsaI-ccdB-BsaI单元，将此多gRNA转录单元克隆入gRNA克隆及转录单元，得到可针对多个目标位点进行特异修饰的重组载体。

本发明的核心单元(Cas9ORF-PolyA-RZcleavagesite-gRNAcloningscaffold-RZcleavagesite-RZ)可以针对具体转化宿主生物及实验需要，连接在任何PolII型启动子后，由不同启动子启动Cas9-gRNA单元转录(如：在动物细胞中常使用CMV、hsP70、SV40及植物中常用的CaMV35S、ZmUb1、AtUb10等启动子等)，实现Cas9-gRNA的剪切复合体组装。

本发明中，基于CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体，完成构建具体Cas9-gRNA表达载体进行转化后，在活体细胞条件下，PolⅡ启动子驱动“Cas9-PolyA-RZsite-gRNAcloningscaffold-RZsite-RZ”作为整体转录单元转录得到单链初级转录本。在RZ作用下，单一初级转录本分别在两个RZsite处发生自剪切，分别得到完整Cas9蛋白表达框mRNA(含PolyA)及gRNA转录单元。在细胞体系内，Cas9蛋白表达框mRNA(含PolyA)进一步进行翻译得到Cas9蛋白，并和已有的gRNA单元结合形成功能性的Cas9-gRNA复合单元进行基因组目标位点定向剪切。

本发明中，完整的向导RNA由能够与所述靶标片段互补结合的18～21bpRNA片段替换骨架载体gRNA克隆及转录单元中的BsaI-ccdB-BsaI单元而成；RNA克隆及转录单元的序列是不变：不包括BsaI-ccdB-BsaI单元的序列如SeqIDNo.3；包括BsaI-ccdB-BsaI单元的序列如SeqIDNo.4)所述骨架RNA片段依次由可以结合protospacer位点的向导gRNA、tracrRNA、crRNA嵌合形成类似发夹结构的功能性RNA,所述骨架RNA片段可与Cas9核酸酶结合。

针对具体的目标基因，确定gRNA位点后(5’-N_X-NGG-3’；N表示A、G、C、T中的任一种，X为整数，且14≤X≤30(18、19、20、21为常用值))，依据发明中提供的Cas9-gRNA重组载体构建方法，将设计的gRNA特异性靶序列(protospacer)“BsaI酶切-T4DNA连接酶连接”循环反应的方式，替换BsaI-ccdB-BsaI单元克隆入gRNA克隆及转录单元，得到特定的有功能的Cas9-gRNA重组载体。

本发明中，在gRNA克隆转录框架单元的5’端融合了BsaI-ccdB-BsaI单元，其作用是作为多克隆位点酶切CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体，以便克隆目标gRAN特异性靶序列(protospacer)。可将BsaI-ccdB-BsaI单元替换为可以在本发明骨架载体上引入切口的限制内切酶，并相应修改gRAN特异性靶序列克隆位点，都可以有效实现本发明的关键内容。

本发明中，通过在gRNA转录表达框5’端融合了637bp的BsaI-ccdB-BsaI单元。BsaI-ccdB-BsaI单元，用于与识别目标基因的特异性靶序列(protospacer)的克隆。通过BsaI内切酶及T4DNA连接酶的协同作用，可以快捷、高效的完成目标位点特定Cas9-gRNA表达载体。在构建针对目标位点特异性修饰Cas9-gRNA重组载体时，特定的互补寡核苷酸双链替换了骨架载体中637bp的BsaI-ccdB-BsaI单元，进入CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体。

在构建目标位点特异性序列修饰的Cas9-gRNA表达载体过程中，可通过转化大肠杆菌、细菌筛选压筛选含正确Cas9-gRNA表达载体的重组克隆，并可采用菌落PCR、质粒酶切、序列测定等方式进行鉴定，以明确获得了用于目的生物基因组定向修饰的Cas9-gRNA重组表达载体。

本发明所述核心单元中使用的核酶全酶(RZ)及其对应识别的核酶识别切割位点(RZcleavagesite)需要配合使用，但可以有不同变化形式，如：1)可以保留本发明中的RZ元件，但对本发明中的RZcleavagesite的核苷酸序列进行取代、缺失或者添加一个或几个核苷酸，使其依然可以被本发明中的RZ元件识别切割；2)可以替换本发明中的锤头状核酶(hammerheadribozyme)的RZ元件为其他类型的核酶(如：I类内含子、RNaseP、发夹状核酶、丁型肝炎核酶或VS核酶)，并对应替换本发明中的RZcleavagesite，使其可以被替换后的核酶识别切割。这些变化都不影响本发明的核心内容，即：将Cas9蛋白编码框序列(Cas9ORF)与gRNA克隆及转录单元通过可以被特定核酶(RZ)识别切割的核酶识别切割位点(RZcleavagesite)连接为单一转录单元，实现Cas9ORF与gRNA转录单元可以由任意PolII型启动子协同转录。

应用融合PCR扩增策略，可以得到由核酶识别切割位点(RZcleavagesite)间隔的多个gRNA转录单元串联扩增产物，通过“BsaI酶切-T4DNA连接酶连接”循环反应的方式，替换BsaI-ccdB-BsaI单元，可以将此多gRNA转录单元克隆入gRNA克隆及转录单元，得到可针对多个目标位点进行特异修饰的Cas9-gRNA1-gRNA2-…-gRNAx重组载体(图5)。

本发明中，通过原生质、基因枪及农杆菌介导的多种转化方法，将依据本发明构建的Cas9-gRNA重组载体转入植物细胞，使转化细胞同时具有Cas9核酸酶蛋白及针对特定基因组目标序列的gRNA单元；在Cas9核酸酶蛋白及gRNA单元共同作用下，对特定基因组目标序列DNA双链进行定向剪切；进而在细胞内源DNA修复途径作用下，实现目标序列NHEJ(nonhomologousendjoining，非同源末端连接)或HR(homologousrecombination，同源重组)定向修饰结果。本发明所述的CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体在植物中应用时，可以使用包括卡那霉素、潮霉素、basta等抗性基因进行植物转化子筛选，由阳性转化子细胞或组织(如原生质体或愈伤组织)分化再生，得到而来包含目标位点定向修饰的再生植株。

本发明的有益效果：本发明提供了一种高效的CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体，可以有效实现基于PolII型启动子驱动的Cas9及gRNA单元的协同转录，针对多种真核生物进行简单、快捷、高效的基因组定向遗传修饰。本发明所述骨架载体中，在PolII型启动子驱动下，Cas9核酸酶蛋白表达框与gRNA转录表达框处于同一转录单元，并在gRNA转录表达框5’端融合了637bp的BsaI-ccdB-BsaI单元，通过BsaI内切酶及T4DNA连接酶的协同作用，可以快捷、高效的完成目标位点特定Cas9-gRNA表达载体。Cas9核酸酶蛋白表达框与gRNA转录表达框由唯一PolII型启动子调控转录的策略，可以有效实现Cas9核酸酶蛋白及gRNA转录单元的协同表达，提高CRSIPR/Cas9系统的定向剪切效率。通过使用相关动植物通用PolII型启动子(如动物细胞中常用的CMV及植物中常用的CaMV35S、ZmUbi1等启动子)，可以有效避免在不同物种中需要使用物种特异性U6、U3等小RNA转录启动子的问题，极大拓展了基于CRSIPR/Cas9系统的基因组定向遗传修饰的应用范围。同时，通过进一步的不同组织特异性及诱导表达启动子的使用，可以有效实现组织特异性及诱导型基因组定向遗传修饰。

附图说明

图1本发明中设计的CRISPR/Cas9单一转录单元结构及工作原理示意图；PolIIpromoter：PolII型启动子；Cas9ORF：Cas9蛋白编码框；RZcleavagesite：RZ识别剪切位点；gRNAcloningscaffold：gRNA克隆及转录单元；transcription：转录；translation：翻译；Cas9protein：Cas9蛋白；cleavage：剪切；

图2本发明中实施例2～5中，针对特定水稻内源基因位点，具体构建及使用的CRISPR/Cas9单一转录单元表达载体示意图。其中：具体使用的PolII型启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35Spromoter)；不同实施案例中，gRNA克隆及转录单元包含可以特异结合目标位点的18～21bp向导RNA单元。

图3基于本发明中CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体，对水稻内源基因OsYSA、OsPDS、OSMPK2、OsROC5的定点突变检测结果图。其中，1号泳道为对应水稻基因的PCR扩增产物，2、3号泳道分别为对不同水稻基因野生型及CRISPR/Cas9表达载体转化材料的PCR扩增产物经对应限制酶酶切产物(图3a：OsYSA-gRNA1：SfiI；图3b：OsYSA-gRNA2：EcoNI；图3c：OsPDS-gRNA2：HindIII；图3d：OsMPK2-gRNA：MscI；图3e：OsROC5-gRNA：AhdI)；

图4针对不同水稻内源基因，基于CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体构建对应Cas9-gRNA表达载体，转化水稻原生质体后，针对定向修饰目标位点进行PCR产物克隆测序结果。其中，WT表示野生型基因序列，M1、M2分别表示两个独立定向修饰结果，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量。

图5多个gRNA转录单元串联示意图。

图6针对水稻内源基因OsYSA两个不同位点，构建并使用的CRISPR/Cas9单一转录单元表达载体示意图。其中：具体使用的PolII型启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35Spromoter)；OsYSA-gRNA1及OsYSA-gRNA2克隆及转录单元分别包含可以特异结合目标位点的18～21bp向导RNA单元。

图7基于本发明中CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体，对水稻内源基因OsYSA的两个不同位点进行同时定点突变检测结果图。其中，1号泳道为对应OsYSA基因PCR扩增产物，2、3号泳道为OsYSA-gRNA1诱导的定向修饰结果(SfiI酶切抗性条带)，4、5号泳道为OsYSA-gRNA2诱导的定向修饰结果(EcoNI酶切抗性条带)。

图8针对水稻内源基因OsYSA多基因位点，基于CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体构建多基因位点敲除Cas9-gRNA表达载体，转化水稻原生质体后，针对定向修饰目标位点进行PCR产物克隆测序结果。其中，WT表示野生型基因序列，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量。

具体实施方式

实施例1CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体的构建

本发明设计一种用于基因组工程的CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体，其核心单元由PolII型启动子(可以通过AscI、SbfI双酶切基础CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体的方案，实现不同PolII型启动子的替换)、Cas9蛋白编码框(含NLS序列)、PolyA序列、核酶识别位点(RZcleavagesite)、gRNA克隆及转录单元(包含BsaI-ccdB-BsaI单元)、核酶识别位点(RZcleavagesite)、核酶(全酶)(RiboZyme)依次构成。CRISPR/Cas9单一转录单元结构及工作原理见图1。

可选地，该骨架载体还包括：T-DNA的左、右边界序列，PolII启动子驱动“Cas9-polyA-RZcleavagesite-gRNAcloningscaffold-RZcleavagesite-RZ”单一转录单元位于所述T-DNA左、右边界之间；T-DNA的左、右边界序列间还包括潮霉素抗性基因表达单元(依次组成元件为：2×CaMV35S启动子-hygromycinphosphotransferaseORF-CaMVpolyA”；可以通过AvrII、PacI双酶切基础CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体的方案，实现不同抗性基因ORF的替换)作为植物转化子筛选标记。

为了实现特定基因组目标Cas9-gRNA表达载体的快捷、高效构建，本发明所述的CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体在gRNA转录表达单元的5’端融入637bp的的BsaI-ccdB-BsaI单元，基于此设计策略，在后续目标Cas9-gRNA表达载体构建过程中，仅需在构建体系中混合本发明所述的CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体、退火的特异性靶序列互补寡核苷酸双链片段、BsaI内切酶及T4DNA连接酶，并设置“37℃酶切-16℃连接”循环反应，即可实现特定Cas9-gRNA表达载体的有效构建。该载体可以采用现有分子克隆技术中的常规方式来构建，同时需要说明的是上述元件序列是该骨干质粒载体的特有部分，其还可以包括一些常规载体所具有的一般结构，本发明中不再累述。

基于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9核酸酶蛋白编码基因(StreptococcuspyogenesCas9，SpCas9)进行密码子优化(3’端添加NLS信号)，人工合成Cas9核酸酶蛋白编码基因完整ORF序列(包含3’段的NLS)，DNA序列如SeqIDNo.2所示。进一步，通过人工合成方式得到另外3个基本单元：a、frag-A(PolyA+核酶识别位点：SeqIDNo.8所示)；b、frag-B(BsaI-ccdB-BsaI单元：SeqIDNo.9所示)；c、frag-B(gRNA转录单元+核酶识别位点+核酶全酶：SeqIDNo.10所示)。通过融合PCR方式，依次将Cas9核酸酶蛋白ORF、frag-A、frag-B、frag-C进行融合，并分别在融合PCR产物5’、3’端添加SbfI、SacI限制酶切位点，得到5013bp组装单元。分别针对载体骨架pTC097(CermakT,StarkerCG,VoytasDF.EfficientdesignandassemblyofcustomTALENsusingtheGoldenGateplatform.MethodsMolecularBiology,2005,1239:133-59.)及5013bp组装单元进行SbfI、SacI双酶切，回收目标片段，进行连接、转化，针对筛选的阳性克隆进行测序确认，完成CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体构建工作。

实施例2、基于CRISPR/Cas9单一转录单元系统的水稻内源基因OsYSA的定点遗传修饰

1、水稻OsYSA基因目标gRNA设计及Cas9-gRNA重组表达载体构建

依据水稻OsYSA序列(NCBI号NM001057140)为参考序列，分别依据第365bp-387bp(CCGCTTCGGCCGAGGTGGCGCGC，下划线为PAM结构)及第571bp-593bp(CCTCATGAAGGTGCTCGTCGCGG，下划线为PAM结构)区域，设计OsYSA-gRNA1、OsYSA-gRNA2(表1)。

表1水稻OsYSA基因gRNA设计、合成及检测信息

依据设计的OsYSA-gRNA1、OsYSA-gRNA2位点核酸序列，人工合成对应的正、反向寡核苷酸链，具体序列如下(大写碱基序列代表设计的gRNA位点中去除PAM结构的序列；小写碱基序列代表与骨架载体互补的粘性末端序列)：

OsYSA-gRNA1-F：cggaGCGCGCCACCTCGGCCGAAG

OsYSA-gRNA1-R：aaacCTTCGGCCGAGGTGGCGCGC

OsYSA-gRNA2-F：cggaCCGCGACGAGCACCTTCATG

OsYSA-gRNA2-R：aaacCATGAAGGTGCTCGTCGCGG

分别将OsYSA-gRNA1-F/R及OsYSA-gRNA-2-F/R等比例混合，沸水浴10min，而后自然降温退火，形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的插入片段。于200uLPCR管中加入CRISPR/Cas9单一转录骨架载体、粘末端插入片段、BsaI内切酶、T4DNA连接酶，设置“37℃酶切-16℃连接”10个循环反应，80℃处理失活内切及连接酶后，取反应产物进行大肠杆菌转化。通过卡那霉素抗性筛选、菌落PCR及酶切鉴定阳性转化子，最终通过经测序验证得到对应Cas9-gRNA表达载体，分别命名为pTX171::OsYSA-gRNA1、pTX171::OsYSA-gRNA2。

2、pTX171::OsYSA-gRNA1、pTX171::OsYSA-gRNA2表达载体于水稻原生质体转化

分离水稻日本晴原生质体，基于PEG方法，分别进行pTX171::OsYSA-gRNA1、pTX171::OsYSA-gRNA2表达载体的水稻原生质体转化。水稻原生质体转化具体过程参考文献1：Sheen,J.SignaltransductioninmaizeandArabidopsismesophyllprotoplasts.PlantPhysiology(2001)及文献2：Zahng,Y.etal.Transcriptionactivator-likeeffectornucleasesenableefficientplantgenomeengineering.PlantPhysiology(2013)中公开的实验方法。

3、水稻OsYSA基因定向遗传修饰结果检测

水稻原生质体转化后，25℃暗培养48小时，收集转化细胞，CTAB方法提取水稻原生质体基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR扩增及限制性内切酶验证分析(OsYSA-gRNA1、OsYSA-gRNA2分别对应SfiI、EcoNI进行酶切检测)，具体方法参考文献：Zhang,Y.etal.Transcriptionactivator-likeeffectornucleasesenableefficientplantgenomeengineering.PlantPhysiology(2013)中公开的实验方法。实验分析结果见图3a、3b及图4。图3a、3b结果表明在OsYSA-gRNA1、OsYSA-gRNA2位点处，水稻内源序列发生了定向剪切突变，根据条带强度用软件计算的突变效率分别为28.9％、34.8％；针对图3a、3b中3号泳道限制酶抗性条带进行回收，并进行TA克隆及测序，测序结果见图4，测序结果表明在OsYSA-gRNA1、OsYSA-gRNA2位点发生了碱基突变。

实施例3、基于CRISPR/Cas9单一转录单元系统的水稻内源基因OsPDS的定点遗传修饰

1、水稻OsPDS基因目标gRNA设计及pCas9-gRNA表达载体构建

依据水稻OsPDS序列(NCBI号NM001055721)为参考序列，依据第1290bp-1312bp(GTTGGTCTTTGCTCCTGCAGAGG，下划线为PAM结构)区域，设计OsPDS-gRNA2(表2)。

表2水稻OsPDS基因gRNA设计、合成及检测信息

依据设计的OsPDS-gRNA2位点核酸序列，人工合成对应的正、反向寡核苷酸链，具体序列如下(大写碱基序列代表设计的gRNA位点中去除PAM结构的序列；小写碱基序列代表与骨架载体互补的粘性末端序列)：

OsPDS-gRNA2-F：cggaGTTGGTCTTTGCTCCTGCAG

OsPDS-gRNA2-R：aaacCTGCAGGAGCAAAGACCAAC

分别将OsPDS-gRNA2-F/R等比例混合，沸水浴10min，而后自然降温退火，形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的插入片段。于200uLPCR管中加入CRISPR/Cas9单一转录骨架载体、粘末端插入片段、BsaI内切酶、T4DNA连接酶，设置“37℃酶切-16℃连接”10个循环反应，80℃处理失活内切及连接酶后，取反应产物进行大肠杆菌转化。通过卡那霉素抗性筛选、菌落PCR及酶切鉴定阳性转化子，最终通过经测序验证得到对应Cas9-gRNA表达载体，命名为pTX171::OsPDS-gRNA2。

2、pTX171::OsPDS-gRNA2表达载体于水稻原生质体转化

分离水稻日本晴原生质体，基于PEG方法，进行pTX171::OsPDS-gRNA2表达载体的水稻原生质体转化。水稻原生质体转化具体过程参考文献1：Sheen,J.SignaltransductioninmaizeandArabidopsismesophyllprotoplasts.PlantPhysiology(2001)及文献2：Zhang,Y.etal.Transcriptionactivator-likeeffectornucleasesenableefficientplantgenomeengineering.PlantPhysiology(2013)中公开的实验方法。

3、水稻OsPDS基因定向遗传修饰结果检测

水稻原生质体转化后，25℃暗培养48小时，收集转化细胞，CTAB方法提取水稻原生质体基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR扩增及限制性内切酶验证分析(OsPDS-gRNA2对应HindIII进行酶切检测)，具体方法参考文献：Zahng,Y.etal.Transcriptionactivator-likeeffectornucleasesenableefficientplantgenomeengineering.PlantPhysiology(2013)中公开的实验方法。实验分析结果见图3c及图4。图3c结果表明在OsPDS-gRNA2位点处，水稻内源序列发生了定向剪切突变，根据条带强度用软件计算的突变效率为11.1％；针对图3c中3号泳道限制酶抗性条带进行回收，并进行TA克隆及测序，测序结果见图4，测序结果表明在OsPDS-gRNA2位点发生了碱基突变。

实施例4、基于CRISPR/Cas9单一转录单元系统的水稻内源基因OsMPK2的定点遗传修饰

1、水稻OsMPK2基因目标gRNA设计及Cas9-gRNA表达载体构建

依据水稻OsMPK2序列(NCBI号NM001067563)为参考序列，依据第65bp-86bp(GCGGCGGCCATGGCCATCACGG，下划线为PAM结构)区域，设计OsMPK2-gRNA(表3)。

表3水稻OsMPK2基因gRNA设计、合成及检测信息

依据设计的OsMPK2-gRNA位点核酸序列，人工合成对应的正、反向寡核苷酸链，具体序列如下(大写碱基序列代表设计的gRNA位点中去除PAM结构的序列；小写碱基序列代表与骨架载体互补的粘性末端序列)：

OsMPK2-gRNA-F：cggaGCGGCGGCCATGGCCATCA

OsMPK2-gRNA-R：aaacTGATGGCCATGGCCGCCGC

分别将OsMPK2-gRNA-F/R等比例混合，沸水浴10min，而后自然降温退火，形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的插入片段。于200uLPCR管中加入CRISPR/Cas9单一转录骨架载体、粘末端插入片段、BsaI内切酶、T4DNA连接酶，设置“37℃酶切-16℃连接”10个循环反应，80℃处理失活内切及连接酶后，取反应产物进行大肠杆菌转化。通过卡那霉素抗性筛选、菌落PCR及酶切鉴定阳性转化子，最终通过经测序验证得到对应Cas9-gRNA表达载体，命名为pTX171::OsMPK2-gRNA。

2、pTX171::OsMPK2-gRNA表达载体于水稻原生质体转化

分离水稻日本晴原生质体，基于PEG方法，进行pTX171::OsMPK2-gRNA表达载体的水稻原生质体转化。水稻原生质体转化具体过程参考文献1：Sheen,J.SignaltransductioninmaizeandArabidopsismesophyllprotoplasts.PlantPhysiology(2001)及文献2：Zhang,Y.etal.Transcriptionactivator-likeeffectornucleasesenableefficientplantgenomeengineering.PlantPhysiology(2013)中公开的实验方法。

3、水稻OsMPK2基因定向遗传修饰结果检测

水稻原生质体转化后，25℃暗培养48小时，收集转化细胞，CTAB方法提取水稻原生质体基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR扩增及限制性内切酶验证分析(OsMPK2-gRNA对应MscI进行酶切检测)，具体方法参考文献：Zahng,Y.etal.Transcriptionactivator-likeeffectornucleasesenableefficientplantgenomeengineering.PlantPhysiology(2013)中公开的实验方法。实验分析结果见图3d及图4：图3d结果表明在OsMPK2-gRNA位点处，水稻内源序列发生了定向剪切突变，根据条带强度用软件计算的突变效率为10.5％；针对图3d中3号泳道限制酶抗性条带进行回收，并进行TA克隆及测序，测序结果见图4，测序结果表明在OsMPK2-gRNA位点发生了碱基突变。

实施例5、基于CRISPR/Cas9单一转录单元系统的水稻内源基因OsROC5的定点遗传修饰

1、水稻OsROC5基因目标gRNA设计及Cas9-gRNA表达载体构建

依据水稻OsROC5序列(NCBI号NM001054253)为参考序列，依据第647bp-669bp(GCGGAGAACGACAGCCGGTCGGG，下划线为PAM结构)区域，设计OsROC5-gRNA(表4)。

表4水稻OsROC5基因gRNA设计、合成及检测信息

依据设计的OsROC5-gRNA位点核酸序列，人工合成对应的正、反向寡核苷酸链，具体序列如下(大写碱基序列代表设计的gRNA位点中去除PAM结构的序列；小写碱基序列代表与骨架载体互补的粘性末端序列)：

OsROC5-gRNA-F：cggaGCGGAGAACGACAGCCGGTC

OsROC5-gRNA-R：aaacGACCGGCTGTCGTTCTCCGC

分别将OsROC5-gRNA-F/R等比例混合，沸水浴10min，而后自然降温退火，形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的插入片段。于200uLPCR管中加入CRISPR/Cas9单一转录骨架载体、粘末端插入片段、BsaI内切酶、T4DNA连接酶，设置“37℃酶切-16℃连接”10个循环反应，80℃处理失活内切及连接酶后，取反应产物进行大肠杆菌转化。通过卡那霉素抗性筛选、菌落PCR及酶切鉴定阳性转化子，最终通过经测序验证得到对应Cas9-gRNA表达载体，命名为pTX171::OsROC5-gRNA。

2、pTX171::OsROC5-gRNA表达载体于水稻原生质体转化

分离水稻日本晴原生质体，基于PEG方法，进行pTX171::OsROC5-gRNA表达载体的水稻原生质体转化。水稻原生质体转化具体过程参考文献1：Sheen,J.SignaltransductioninmaizeandArabidopsismesophyllprotoplasts.PlantPhysiology(2001)及文献2：Zhang,Y.etal.Transcriptionactivator-likeeffectornucleasesenableefficientplantgenomeengineering.PlantPhysiology(2013)中公开的实验方法。

3、水稻OsROC5基因定向遗传修饰结果检测

水稻原生质体转化后，25℃暗培养48小时，收集转化细胞，CTAB方法提取水稻原生质体基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR扩增及限制性内切酶验证分析(OsROC5-gRNA对应AhdI进行酶切检测)，具体方法参考文献：Zahng,Y.etal.Transcriptionactivator-likeeffectornucleasesenableefficientplantgenomeengineering.PlantPhysiology(2013)中公开的实验方法。实验分析结果见图3e及图4。图3e结果表明在OsROC5-gRNA位点处，水稻内源序列发生了定向剪切突变，根据条带强度用软件计算的突变效率为26.7％；针对图3e中3号泳道限制酶抗性条带进行回收，并进行TA克隆及测序，测序结果见图4，测序结果表明在OsROC5-gRNA位点发生了碱基突变。

实施例6、基于CRISPR/Cas9单一转录单元系统的水稻内源基因OsYSA多位点同时定点遗传修饰

1、水稻OsYSA基因多位点目标gRNA设计及Cas9-gRNA重组表达载体构建

依据水稻OsYSA序列(NCBI号NM001057140)为参考序列，分别依据第365bp-387bp(CCGCTTCGGCCGAGGTGGCGCGC，下划线为PAM结构)及第571bp-593bp(CCTCATGAAGGTGCTCGTCGCGG，下划线为PAM结构)区域，设计OsYSA-gRNA1、OsYSA-gRNA2(表5)。

表5水稻OsYSA基因gRNA设计、合成及检测信息

依据设计的OsYSA-gRNA1、OsYSA-gRNA2位点核酸序列，人工合成对应的正、反向寡核苷酸链，具体序列如下(大写碱基序列代表设计的gRNA位点中去除PAM结构的序列；小写碱基序列代表与骨架载体互补的粘性末端序列)：

OsYSA-gRNA1-F：cggaGCGCGCCACCTCGGCCGAAG

OsYSA-gRNA1-R：aaacCTTCGGCCGAGGTGGCGCGC

OsYSA-gRNA2-F：cggaCCGCGACGAGCACCTTCATG

OsYSA-gRNA2-R：aaacCATGAAGGTGCTCGTCGCGG

将OsYSA-gRNA1-F/R及OsYSA-gRNA-2-F/R分别等比例混合，沸水浴10min，而后自然降温退火，形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的插入片段。于200uLPCR管中加入CRISPR/Cas9单一转录骨架载体(图5)、两个粘末端插入片段、BsaI内切酶、T4DNA连接酶，设置“37℃酶切-16℃连接”10个循环反应，80℃处理失活内切及连接酶后，取反应产物进行大肠杆菌转化。通过卡那霉素抗性筛选、菌落PCR及酶切鉴定阳性转化子，最终通过经测序验证得到对应Cas9-gRNA表达载体，命名为pTX171::OsYSA-gRNA1-gRNA2(图6)。

2、pTX171::OsYSA-gRNA1-gRNA2表达载体于水稻原生质体转化

分离水稻日本晴原生质体，基于PEG方法，分别进行pTX171::OsYSA-gRNA1-gRNA2表达载体的水稻原生质体转化。水稻原生质体转化具体过程参考文献1：Sheen,J.SignaltransductioninmaizeandArabidopsismesophyllprotoplasts.PlantPhysiology(2001)及文献2：Zhang,Y.etal.Transcriptionactivator-likeeffectornucleasesenableefficientplantgenomeengineering.PlantPhysiology(2013)中公开的实验方法。

3、水稻OsYSA基因多位点同时定向遗传修饰结果检测

水稻原生质体转化后，25℃暗培养48小时，收集转化细胞，CTAB方法提取水稻原生质体基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR扩增及限制性内切酶验证分析(OsYSA-gRNA1、OsYSA-gRNA2分别对应SfiI、EcoNI进行酶切检测)，具体方法参考文献：Zahng,Y.etal.Transcriptionactivator-likeeffectornucleasesenableefficientplantgenomeengineering.PlantPhysiology(2013)中公开的实验方法。实验分析结果见图7、图8。图7结果表明在OsYSA-gRNA1、OsYSA-gRNA2位点处，水稻内源序列发生了定向剪切突变；针对图7泳道2、3及4、5中抗性条带分别进行回收，并进行TA克隆及测序，测序结果见图8，测序结果表明在OsYSA-gRNA1、OsYSA-gRNA2位点均发生了突变。