人类胚胎脊髓性肌萎缩症突变基因检测试剂盒

摘要

本发明提供了一种基于高通量测序技术检测SMN1突变的方法及相应的试剂盒。其中，所用的引物组合物包括特异性扩增SMN1基因第7号外显子的引物和特异性扩增SMN1基因上下游3Mb范围内紧密连锁多态性位点（SNP）的引物。本发明的方法具有通用性、多位点SNP测序、高通量、成本低、高灵敏度、特异性强的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及基因诊断领域，具体而言，涉及人类胚胎脊髓性肌萎缩症突变基因检测引物及相应的试剂盒。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy，SMA)是一种以脊髓前角细胞变性为主要病理改变，以进行性、对称性肌无力、肌萎缩为特征的常染色体隐性遗传性神经肌肉病，是临床第二大致死性常染色体隐性遗传性疾病。在活产婴儿中，其发病率约为1/10000至1/6000，人群基因携带率约1/40(KolbSJ,KisselJT.Spinalmuscularatrophy.ArchNeurol,2011,68(8):979-984)。目前SMA尚无有效的治疗方法。对病情进展缓慢者，理疗、支架以及特殊矫正器材是防止脊柱侧凸及关节痉挛的主要方法，但是这些治疗并不能治愈疾病。因此，对于SMA这种严重致残、致死而又无法根治的疾病，开展产前检测显得尤为重要。

位于人类5号染色体上的运动神经元存活基因1(survivalmotorneuron1，SMN1)缺陷是导致SMA的原因。1995年该基因被克隆。正常人的两条5号染色体上至少存在1个SMN1基因拷贝，而SMA患者SMN1基因缺失(特指7号外显子纯合缺失)或者带有1个突变的SMN1基因。研究表明，约95％的SMA患者为SMN1基因纯合缺失所致(缺失型)，另5％的患者为SMN1基因突变所致(突变型)(LunnMR,WangCH.Spinalmuscularatrophy.Lancet,2008,371(9630):2120-2133)。

SMA的遗传方式为常染色体隐性遗传，即两条染色体上的SMN1基因均存在缺陷时才会导致SMA。一条染色体上的SMN1基因正常，而另一条染色体上的SMN1基因存在缺陷不会致病，此时称之为SMA携带者。若男女双方均为SMA携带者，生育SMA患儿的风险为25％(图1)。

虽然SMA的发病率较低，但是人群携带率却非常高。文献报道各个国家SMA携带者频率为1/40至1/60(SmithM,CalabroV,ChongB,etal.PopulationscreeningandcascadetestingforcarriersofSMA[J].EurJHumGenet,2007,15(7):759-766.)。台湾地区SMA携带率为1/48(SuYN,HungCC,LinSY,etal.Carrierscreeningforspinalmuscularatrophy(SMA)in107,611pregnantwomenduringtheperiod2005-2009:Aprospectivepopulation-basedcohortstudy.PLoSone,2011,6(2):e17067)。我国南方地区应用DHPLC技术，筛查1712例新生儿，表明中国大陆地区SMA人群携带率为1/42(ZhuSY,FuX,ChenYJ,etal.MolecularcharacterizationofSMNcopynumberderivedfromcarrierscreeningandfromorefamilieswithSMAinaChinesepopulation.EurJHumGenet,2010,18(9):978-984.)。

采用试管婴儿技术能有效帮助夫妻均携带SMN1基因的父母解决下一代出现SMA的难题。试管婴儿技术是将卵子与精子取出后置于特定的培养液内培养、受精，受精卵在恒温孵箱中发育为胚胎后移植回母体子宫，最终发育成胎儿。挑选健康胚胎移植是成功预防的关键。胚胎植入前遗传学筛查是指胚胎植入着床之前进行染色体数目和结构异常的检测，挑选无SMA的胚胎植入子宫，以期获得正常的后代。

SMN1基因检测已成为SMA诊断的主要依据。目前临床常用的特异性针对SMN1外显子7纯合缺失的基因检测技术有PCR限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)以及定量PCR技术。SMN1外显子7纯合缺失，则可以确诊为SMA(缺失型)；对于含有1个SMN1基因，而临床表型又极似SMA的患者，可以进一步通过基因测序，检测患者是否存在SMN1基因无义、错义、移码突变而致病(突变型)。但这些方法灵敏度低，只适合于采用新生儿外周血作为检测对象，不适合针对单细胞的移植前筛查。因此急需开发一种试管婴儿技术中胚胎SMN1突变检测的新方法。

发明内容

本发明设计了一种基于高通量测序技术检测SMN1突变的方法。

本发明的第一方面提供了一种检测SMN1突变的引物组合物，其包括特异性扩增SMN1基因第7号外显子的引物和特异性扩增SMN1基因上下游3Mb范围内紧密连锁多态性位点(SNP)的引物。

优选地，所述特异性扩增SMN1基因第7号外显子的引物的上下游序列分别如SEQIDNO：29和30所示。

优选地，所述特异性扩增SMN1基因上下游3Mb范围内紧密连锁多态性位点(SNP)的引物的上下游序列分别选自SEQIDNO：2n-1和SEQIDNO：2n，其中n为1-14或16-43的自然数。

在一个特定的实施方案中，所述检测SMN1突变的引物组合物包括SEQIDNO：1-86的全部引物序列。

本发明的第二方面提供了一种人类胚胎脊髓性肌萎缩症(SMA)检测产品，其由本发明的引物组合物制备得到。

在一个特定的实施方案中，所述检测产品为试剂盒，其包括：

1)用于文库构建的反应试剂，包括：特异性结合引物、通用PCR引物、多重PCR聚合酶、DNA连接酶、末端修复酶、dNTPs、反应缓冲液；

2)用于纯化PCR的反应产物的试剂；优选地，其包括产物纯化磁珠及缓冲液。优选地，所述试剂盒还包括：

3)阴性质控品；和

4)阳性质控品。

本发明的第三方面提供了一种检测胚胎SMN1基因突变的方法，其包括以下步骤：

1)提取体外培养的囊胚滋养层细胞经全基因组扩增；

2)磁珠纯化全基因组扩增产物；

3)提取夫妻双方全血DNA；

4)利用本发明的引物组合物通过多重PCR扩增单体型目标区域；

5)纯化PCR产物，并测序；

6)将测定的胚胎和夫妻3方的DNA序列进行比对，判断胚胎的单倍体型。

其中，步骤1)中所述囊胚滋养层细胞全基因组扩增方法优选为多重置换扩增(MDA)。

步骤5)中采用IontorrentPGM或IontorrentProton进行测序。

步骤6)中利用Torrent_Server_4.0_VM软件对PGM测序仪产生的原始数据去除接头序列，用Tmap软件比对到人类hg19参考基因组，最后分析目标位点覆盖倍数和基因型。

本发明的第四方面提供了一种检测人类胚胎脊髓性肌萎缩症(SMA)的方法，其使用本发明的方法确定胚胎的SMN1基因突变情况，从而诊断SMA。

本发明的优越性主要有以下几点：

(1)通用性：本发明的优选引物组合物采用了43个SNP进行分析，可用于不同配偶的胚胎移植前诊断。

(2)多位点SNP测序：基于第二代测序技术，本发明可以对SMN1基因附近的多个SNP进行分析，不需依赖已知的探针和设计探针。

(3)高通量：基于高通量测序技术，本发明可以高通量地进行SMN1突变的单倍体，通过在每个样品上加上不同的标签序列，可以一次地对大量样品进行分析。

(4)成本低：随着测序技术的不断发展和测序成本的不断降低，以及一次对大量样品进行分析，本发明对SMN1突变的单倍体分析的成本也在不断下降。

(5)高灵敏度：本发明可用于3～5个细胞的分析，因此适合于试管婴儿技术中胚胎移植前的检测。

(6)特异性强：本发明选取千人基因组计划数据(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)中SMN1基因上下游3Mb范围内CHB(北方汉人)和CHS(南方汉人)最小等位基因频率均大于0.1的高频突变位点，去除多聚核苷酸(polyN)和位点上下游50bp序列中GC含量>70％的多态性位点，并选择unique比对到人类基因组hg19的43个SNP突变位点和SMN1基因外显子7下游第6位C碱基作为目标区域。这些引物具有很高的特异性。

附图说明

图1SMA遗传方式。X.常规“2+1+1”家系，父母均为携带者(含1个SMN1拷贝)子代可能为以下四种基因型(A1：缺失型患者；A2、A3：携带者；A4：含两个SMN1拷贝的正常人)；Y.突变型家系，一人为携带者，一人含2个SMN1拷贝，但其中1个拷贝发生突变，子代可能为以下四种基因型(B1：突变型患者；B2：携带者；B3：突变型携带者；B4：含两个SMN1拷贝的正常人)。

图2脊髓性肌萎缩症家系单体型结果。H1、H2、H3、H5、H6、H10为该家系胚胎，不同单体型元件用不同灰度标示：F1和F2为父亲SMN1基因上、下游3M区域的两条单体型链，M1和M2为母亲SMN1基因上、下游3M区域的两条单体型链，J(先证者1)和K(先证者2)为脊髓性肌萎缩症SMN1基因7和8号外显子纯合缺失，因此可以推断J(先证者1)和K(先证者2)SMN1基因上、下游3M区域的两条SMN1基因7和8号外显子缺失链来分别来自父母双方的两条SMN1基因7和8号外显子杂合缺失链。“透明标底”(C)表示SMN1_e7碱基未检测到，“反色标底”表示该链在此处发生基因脱扣。

具体实施方式

在本发明中，读段(reads)是指测序获得的序列片段。

在本发明中，单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

在本发明中，单体型(Haplotype)是指位于一条染色体特定区域的一组相互关联，并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态的组合，又称单倍体型或单元型。

本发明中，基因组DNA的获取是当胚胎发育至囊胚期时取出外围滋养层细胞3～5个，运用全基因组扩增方法对细胞中基因组DNA进行富集。

在本发明中，目标区域DNA分子富集采用的是多重PCR扩增的方法。具体原理和方法请参见生厂商提供的说明书，将DNA分子富集为比较集中的一定大小的片段。在本发明的一个特定实施方案中，DNA片段大小在125～275bp的大小。

在本发明中，针对人类SMN1基因，分别设计43对序列特异性引物。这些引物的特点为：(1)在目标染色体上序列唯一；(2)位置特异的寡核苷酸具有相同的退火温度；(3)44对引物混合到两个PCR反应管中，在两个PCR反应管中能进行44重反应。

在本发明中，所采用的测序方法可以为高通量测序方法。DNA片段长度分布在125～275bp之间。在本发明的一个特定实施方案中，测序平台为IonTorrentPGM，得到DNA长度分布在125～275bp之间的DNA序列分子。

在本发明中，测序深度可以是300～3000×，即每条特异PCR扩增产物被测序300～3000次，例如在本发明的一个特定实施方案中，测序深度为1000，即该条特异PCR扩增产物被测序1000次。

本发明中，当待测的DNA分子来自多个受试样品时，每个样品可以被加上不同的标签序列(barcode)，以用于在测序过程中进行样品的区分(MicahHamady,JeffreyJWalker,JKirkHarrisetal.Error-correctingbarcodedprimersforpyrosequencinghundredsofsamplesinmultiplex.NatureMethods,2008,5(3))，从而实现同时对多个样品进行测序。

本发明中，基因组参考序列可以来自公共数据库。例如，人类基因组序列可以是NCBI或者ucsc数据库中的人类基因组参考序列。

本发明中，序列比对可以通过任何一种序列比对程序，例如本领域技术人员可获得的TorrentMappingAlignmentProgram(TMAP)和BWA(Burrow-Wheeler-Aligner)进行比对，将读段与参考基因组序列比对，得到读段在参考基因组上的位置。

本发明中，利用Torrent_Server_4.0_VM软件对PGM测序仪产生的原始数据去除接头序列，用Tmap软件比对到人类hg19参考基因组，最后分析单体型SNP覆盖倍数和基因型。

在本发明的一个特定实施方案中，SMN1检测方法包括以下步骤：

DNA提取及测序：按照MDA全基因组扩增法(Qiagen试剂盒)提取细胞DNA后，按照IonAmpliSeq^TMLibraryKits2.0标准建库流程进行建库。在这个过程中，胚胎MDA全基因组扩增通过目标区域多重PCR扩增为集中在125～275bp左右的DNA分子，两端加上测序所用接头，每个样品被加上不同的标签序列(barcode)，从而在一次测序得到的数据中可以使多个样品的数据区分开。

比对及统计：利用Torrent_Server_4.0_VM软件对PGM测序仪产生的原始数据去除接头序列，用Tmap软件比对到人类hg19参考基因组，最后分析单体型SNP覆盖倍数和基因型。

本发明用于对适用人群进行脊髓性肌萎缩症胚胎移植前诊断，有利于提供遗传咨询和提供临床决策依据。本发明适用人群可以是脊髓性肌萎缩症携带者和患者。

下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例胚胎脊髓性肌萎缩症胚胎移植前诊断

1.建库和测序

在一个家系中母亲连续生出2例脊髓性肌萎缩症患儿，经基因检测2例脊髓性肌萎缩症患儿都为脊髓性肌萎缩症SMN1基因7和8号外显子纯合缺失，父母双方为脊髓性肌萎缩症7和8号外显子杂合缺失携带者。按照全基因组扩增方法，获取该家系6例胚胎样本细胞DNA，用Qubit(Invitrogen,theQuant-iTTMdsDNAHSAssayKit)定量，并分离10ng进行后续实验。

按照IonAmpliSeq^TMLibraryKits2.0标准建库流程进行建库。简而言之，多重PCR扩增产物的DNA分子两端加上测序所用的接头，在一定条件下使核酸分子成簇生长，然后在IonTorrentPGM上测序，得到片段长度分布在125～275bp目标区域的DNA片段序列。

本实施例中，对于获自上述6例胚胎细胞的DNA样品按照IonTorrent官方公布的测序说明书进行操作。测序使用的特异性引物如表1所示。

表1检测SMN1突变的引物

表1中序号为n(n＝1,2,...,42,43)的引物对的上游和下游引物序列分别为SEQIDNO:2n-1和SEQIDNO:2n。

2.比对与统计

利用Torrent_Server_4.0_VM软件对PGM测序仪产生的原始数据去除接头序列、用Tmap软件比对到人类hg19参考基因组、分析单体型SNP覆盖倍数和基因型。

3.数据分析

利用父母和先证者与脊髓性肌萎缩症致病基因SMN1紧密连锁的多态性位点(SNP)在染色体上位置和基因型构建单体型。利用已经建好的单体型对胚胎是否致病进行判断。

4.结果

选取目标区域43个SNP突变位点和SMN1基因外显子7下游第6位C碱基构建脊髓性肌萎缩症家系单体型(单体型结果如图2)。根据脊髓性肌萎缩症家系单体型结果可以推断：H1胚胎为母源携带者；H2胚胎为母源携带者；H3胚胎为母源携带者；H5胚胎为父源携带者；H6胚胎为母源携带者。