一种快速分离、纯化和鉴定微生物产耐盐蛋白酶的方法

摘要

本发明公开了一种快速分离、纯化和鉴定微生物产耐盐蛋白酶的方法，属于发酵工程技术领域。利用磷酸盐浸提、硫酸铵分步离心沉淀、透析、聚乙二醇（PEG）浓缩、低温电泳和质谱等技术相结合的方法分离、纯化和鉴定了微生物产耐盐蛋白酶。与常规方法相比，利用本方法分离、纯化和鉴定微生物产耐盐蛋白酶具有“可视化”、快速、条件温和、不需添置特殊电泳、离子交换和凝胶色谱设备等优势。

说明书

技术领域

本发明涉及一类特殊蛋白酶的分离、纯化和鉴定方法，具体涉及一类微生物产耐盐蛋白酶的分离、纯化和鉴定方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

目前国内大豆发酵食品生产使用的菌种主要为米曲霉、根霉、毛霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌等，在无盐条件下上述微生物所产酶谱较全、蛋白酶酶活较高（500-2000U/g（干曲））。但大量学者（SuN.W.,WangM.L.,KwokK.F.,etal.Effectsoftemperatureandsodiumchlorideconcentrationontheactivitiesofproteasesandamylasesinsoysaucekoji[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2005,53:1521-1525.刘庆，王君高，李旋.NaCl对酱油酿造的影响[J].中国调味品，2010，（12）：28-30.）和本实验室的研究结果证实了上述微生物产蛋白酶耐盐性较差（常温，10-20%NaCl溶液中15d，酶活失活80%以上），导致后期（0.5-6月）发酵过程中蛋白酶酶活严重偏低，无法有效将发酵醪中的蛋白质降解为大豆发酵食品的主要呈味物质—多肽、寡肽、氨基酸等。这是目前我国大豆发酵食品蛋白质原料利用率低、质量和风味较差的最重要原因。

国内外学者（牛春华，高岩，李玉秋，等.紫外诱变选育高产蛋白酶枯草芽孢杆菌[J].中国酿造，2011，（12）：67-69.XuD.F.,PanL.,ZhaoH.F.,etal.BreedingandidentificationofnovelkojimoldswithhighactivityofacidproteasebygenomerecombinationbetweenAspergillusoryzaeandAspergillusniger[J].JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology,201138(9):1255-1265.）对在无盐条件下提高大豆发酵食品菌种中蛋白酶的研究较多，也取得了一定的成果，但所获得的高产蛋白酶新菌株应用到实际生产中并取得较好效果的仍未见报道，其最重要的原因为新菌株所产蛋白酶的耐盐性差。因此，要提高我国大豆发酵食品原料蛋白质利用率、质量和风味的首要任务是提高发酵菌种产蛋白酶的耐盐性，而不是简单的提高其在无盐条件下的蛋白酶酶活。通过基因工程手段提高大豆发酵食品所用菌种同源耐盐蛋白酶的表达分泌量是解决发酵过程中耐盐蛋白酶酶活低的最佳手段。依据蛋白质（酶）结构决定其性质和功能的原理，通过鉴定上述微生物产耐盐和非耐盐蛋白酶及其活性中心结构的差异，阐明耐盐酶及其活性中心的结构特征，是对大豆发酵食品生产过程中耐盐蛋白酶进行定向调控或对上述菌种进行定向改造使其高产耐盐蛋白酶的前提和基础。但目前对上述菌种产耐盐蛋白酶结构特征进行的研究尚未见报道。主要原因为国内外相关的科研工作者对耐盐蛋白酶在提高大豆发酵食品原料利用率和产品质量中的作用认识不足；另一重要原因为上述微生物产耐盐蛋白酶的分离、纯化和鉴定过程操作繁琐、耗时、所需设备昂贵，一般实验室难以开展此项工作。我国台湾地区的Sun等（SuN.W.,LeeM.H.Purificationandcharacterizationofanovelsalt-tolerantproteasefromAspergillussp.FC-10,asoysaucekojimold[J].JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology,2001,26:253-258.）和韩国的Lee等（LeeS.K.,HwangJ.Y.,ChoiS.H.,etal.PurificationandcharacterizationofAspergillusoryzaeLK-101salt-tolerantacidproteaseisolatedfromsoybeanpaste[J].FoodScienceandBiotechnology,2010,19(2):327-334.）分别对米曲霉FC-10和米曲霉LK-101产蛋白酶通过硫酸铵沉淀、离心、透析、离子交换、凝胶色谱、酶活测定和电泳（SDS-PAGE）等技术进行了分离、纯化和初步鉴定，并通过Edman法对分离纯化得到的耐盐蛋白酶N端氨基酸序列进行了分析。上述方法存在需要不断测定分离液是否存在（耐盐）蛋白酶酶活、工作量大、步骤繁琐、耗时、设备昂贵、实验结果无法实现实时“可视化”等缺点。而快速对上述微生物产耐盐蛋白酶进行分离、纯化和鉴定是对耐盐蛋白酶进行结构特征和生物学信息进行分析、定向提高上述菌种耐盐蛋白酶表达和分泌量的关键和前提。本发明基于常规硫酸铵沉淀、离心、透析、PEG浓缩、电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF-MS）技术，建立了一套具有“可视化”、快速、条件温和、不需添置特殊电泳设备等优势的耐盐蛋白酶分离、纯化和鉴定技术。该技术为定向调控大豆发酵食品生产过程中耐盐蛋白酶酶活或定向构建高产耐盐蛋白酶新菌株奠定了前期技术基础，而后者对提高我国发酵行业原料利用率和产品质量具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前现有技术中存在的上述不足，提供一种快速分离、纯化和鉴定微生物产耐盐蛋白酶的方法。具体为，本发明提供一种利用电泳和质谱设备快速、“可视化”分离、纯化和鉴定微生物产耐盐蛋白酶的方法，该方法具有“可视化”、快速、条件温和、不需添置特殊电泳、离子交换和凝胶色谱设备等优势。

本发明通过如下技术方案实现。

一种快速分离、纯化和鉴定微生物产耐盐蛋白酶的方法，按照下述步骤进行：

（1）微生物培养及耐盐蛋白酶样品制备：依据微生物的最适培养基、培养条件进行培养，至蛋白酶酶活达到最高时取样、进行高盐发酵制备耐盐蛋白酶样品，发酵条件为种曲（100g）与20-30%盐水（w/w）按重量比1:1混合、密封，25-60℃发酵15-180d。

（2）耐盐蛋白酶及其对照（新鲜种曲）粗酶液的提取：按照磷酸盐缓冲液（0.01-0.5M，pH5-8）与上述新鲜种曲（100g）的重量比为1:2（对照），与上述盐水发酵醪重量比例为1:1，分别充分混合，40℃浸提1h。

（3）硫酸铵法分步沉淀粗蛋白酶：定性滤纸分别过滤步骤（2）所得粗酶液，添加硫酸铵至10-30%饱和浓度，4℃下离心（5000-10000g/5-30min）、去除沉淀，上清液中继续添加硫酸铵至50-100%饱和浓度，4℃下离心（10000-20000g/5-30min）、去上清，收集沉淀（粗蛋白酶）。

（4）粗酶液透析除盐和小分子杂质：适量蒸馏水（5-10mL）溶解沉淀，移入透析袋，0.01M磷酸盐缓冲液（pH7.2）中透析（透析袋1000-20000Da）24h（冰浴、换缓冲液3-4次）

（5）透析液浓缩：将PEG10000研磨成粉末状，覆盖在透析袋上浓缩至透析液约1ml。

（6）样品和对照蛋白酶的电泳分离：电泳条件为浓缩胶和分离胶丙烯酰胺浓度分别为5%和7.5-12.5%，两种胶中十二烷基磺酸钠（SDS）浓度为0-0.2%；常规电泳槽加电泳缓冲液（pH8.8）置于冰盒中预冷30min；加上述粗酶液15μL进行电泳分离，分离电压50-100V；电泳结束后胶条在2.5%TritonX-100水溶液中洗涤（30min×3次）以去除SDS残留。

（7）分离胶（条带上的蛋白酶）与底物胶（含大豆分离蛋白）的酶解反应。将上述（6）处理过的胶条与底物胶（丙烯酰胺浓度7.5%（不含SDS），含1%大豆分离蛋白）“面对面”放置，表面覆盖一层0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.2）浸润的定性滤纸保湿，20-60℃反应1-10h。

（8）耐盐和非耐盐蛋白酶的“可视化”鉴定。反应结束后考马斯亮蓝R-250染色、脱色液（甲醇:乙酸:水=10:10:80）脱色。对比样品和对照电泳图谱和相应的底物胶透明条带，找出耐盐和非耐盐蛋白酶条带。

（9）耐盐蛋白酶和非耐盐蛋白酶的质谱鉴定。将目标蛋白酶条带挖点，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF-MS）鉴定，得出耐盐蛋白酶的种类、来源和氨基酸序列等生物学信息。

上述制备方法中，步骤（1）所采用的耐盐蛋白酶样品制备条件为种曲（100g）与20-30%盐水（w/w）按重量比1:1混合、密封，30-50℃发酵15-180d。

上述制备方法中，步骤（2）所采用的磷酸盐缓冲液浓度和pH分别为0.01-0.2M/pH5-8。

上述制备方法中，步骤（3）去除沉淀时添加硫酸铵至10-30%饱和浓度，4℃下离心（5000-10000g/10-30min）、去除沉淀，上清液中继续添加硫酸铵至40-70%饱和浓度，4℃下离心（10000-20000g/20-30min）、去上清，收集沉淀（粗蛋白酶）。

上述制备方法中，步骤（4）所采用透析袋截留分子量范围为8000-15000Da。

上述制备方法中，步骤（6）所采用电泳条件中分离胶丙烯酰胺浓度为7.5-12.5%、十二烷基磺酸钠（SDS）浓度为0.05-0.2%、电泳系统置于冰盒预冷30min、直接添加粗酶液进行分离、分离电压80-100V，电泳结束后胶条在2.5%TritonX-100水溶液中洗涤（30min×3次）以去除SDS残留。

上述制备方法中，步骤（7）所采用底物胶的制备（丙烯酰胺浓度7.5%（不含SDS），含1%大豆分离蛋白）及分离胶与底物胶的反应条件为25-50℃/3-10h。

上述制备方法中，步骤（8）所采用的是电泳分离胶和底物胶通过常规SDS-PAGE电泳染色、脱色的方法，实现耐盐蛋白酶和非耐盐蛋白酶的这种“可视化”鉴定。

上述制备方法中，步骤（9）所采用是通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF-MS）法获取耐盐和非耐盐蛋白酶种类、来源和氨基酸序列等生物学信息。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

本发明利用磷酸盐浸提、硫酸铵分步离心沉淀、透析、PEG浓缩、低温电泳和质谱等技术相结合的方法分离、纯化和鉴定了微生物产耐盐蛋白酶，具有“可视化”、快速、条件温和、不需添置特殊电泳、离子交换和凝胶色谱设备等优势。

附图说明

图1为发酵醪浸提粗酶液和新鲜种曲浸提粗酶液电泳图，其中条带1和2分别为发酵醪和新鲜种曲浸提的粗酶液，条带区域1’和2’分别为条带1和2的对应酶解区域。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的具体实施方式作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。

实施例1米曲霉沪酿3.042产耐盐和非耐盐蛋白酶的分离、纯化和鉴定

大豆:面粉:水=7:3:9（w/w/w）充分混合，121℃/30min灭菌。降温至40℃时接种米曲霉沪酿3.042（Aspergillusoryzae3.042），28℃培养44h得新鲜种曲。称取种曲100g，加种曲重量1倍的盐水（20%，w/w），放于1L烧杯、密封，35℃恒温箱发酵15d。发酵结束后添加种曲1倍重量的磷酸盐缓冲溶液（0.1M，pH7.2）、充分搅拌后40℃恒温水浴锅浸提粗酶液1h，用定性滤纸过滤酱醪，收集醪液（耐盐蛋白酶样品）。按照上述方法制备新鲜种曲，取100g种曲，用200mL中性磷酸盐（0.1M，pH7.2）于40℃恒温水浴锅浸提粗酶液1h，定性滤纸过滤，收集滤液制备粗酶液。在冰浴和磁力搅拌条件下分别向两种收集液中缓慢添加硫酸铵饱和度30%的硫酸铵，4℃下、5000g离心20min，去除沉淀。上清液中继续添加硫酸铵至70%饱和浓度，4℃下12000g离心20min，去上清，收集沉淀（粗蛋白酶）。粗蛋白酶用少量蒸馏水（约10mL）溶解后密封于截留分子量为8000Da的透析袋中，透析液为pH7.2磷酸盐缓冲液（0.01M），冰浴条件下透析24h，期间换缓冲液3-4次。透析结束后样品用分子量为10000Da粉末状PEG浓缩至约1mL。电泳条件为浓缩胶和分离胶的丙烯酰胺浓度分别为5%和7.5%，两种胶中十二烷基磺酸钠（SDS）浓度为0.1%；常规电泳槽加电泳缓冲液（pH8.8）后置于冰盒中预冷30min；加上述粗酶液15μL进行电泳分离，分离电压100V；电泳结束后胶条在2.5%TritonX-100水溶液中洗涤（30min×3次）以去除SDS残留。将上述处理过的胶条与底物胶（丙烯酰胺浓度7.5%（不含SDS），含1%大豆分离蛋白）“面对面”放置，表面覆盖一层0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.2）浸润的定性滤纸保湿，40℃反应3h。反应结束后考马斯亮蓝R-250染色、脱色液（甲醇:乙酸:水=10:10:80）脱色。对比样品和对照电泳图谱和相应的底物胶透明条带，找出耐盐和非耐盐蛋白酶条带（见图1）。将目标耐盐和非耐盐蛋白酶条带挖点，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF-MS）鉴定，获得目标蛋白酶的种类、来源、基因信息和氨基酸序列（见（SEQIDNO1）：耐盐蛋白酶—液泡天冬氨酰氨基肽酶（vacuolaraspartylaminopeptidase）Lap4氨基酸序列，其中液泡天冬氨酰氨基肽酶（vacuolaraspartylaminopeptidase）Lap4来源于Aspergillusoryzae，分子量56763Da，含有510个氨基酸，GeneID为5994794。和见（SEQIDNO2）：中性蛋白酶（neutralprotease）I氨基酸序列，其中非耐盐蛋白酶—中性蛋白酶（neutralprotease）I来源于Aspergillusoryzae，分子量69102Da，含有634个氨基酸，geneID为AAF04628.1）。

如图1所示为米曲霉3.042产耐盐和非耐盐蛋白酶的“可视化”谱图，由图1可知新鲜种曲提取粗酶液电泳条带对应的底物胶部分有两条明显的透明带（上部的液泡天冬氨酰氨基肽酶（vacuolaraspartylaminopeptidase）Lap4对应区域和下部的中性蛋白酶（neutralprotease）I对应区域）。而发酵醪提取粗酶液电泳条带对应的底物胶部分仅上部（液泡天冬氨酰氨基肽酶Lap4对应区域）有一条明显的透明条带，而下部（中性蛋白酶I）对应区域的透明度远不如新鲜种曲相应部分。上述现象说明米曲霉产液泡天冬氨酰氨基肽酶Lap4属于耐盐蛋白酶，中性蛋白酶I耐盐性较差，后者在后续研究中可作为耐盐蛋白酶的对照。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰。因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCELISTING

<110>江苏大学

<120>一种快速分离、纯化和鉴定微生物产耐盐蛋白酶的方法

<130>

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