一种细胞培养液及其应用以及诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化的方法

摘要

本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及一种细胞培养液及其应用以及诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化的方法。本发明提供的细胞培养液中包括基础培养液、GDNF、Shh、EGF和cAMP。本发明提供的培养液能够用于诱导牙髓干细胞分化为神经样细胞。采用该培养液诱导DPSCs，DPSCs形态在12小时开始发生改变；而在诱导24小时后，DPSCs形态发生明显变化，细胞折光性开始增强，突起增多增长，分化为神经样细胞形态。经western？bolt检测，诱导24h后，DPSCs中Nestin和MAP2的表达量显著提高。因此，本发明提供的培养液诱导DPSCs向神经样细胞分化的周期短，效率高。

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及一种细胞培养液及其应用以 及诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化的方法。

背景技术

许多临床上常见的慢性神经系统退化疾病，如：帕金森氏综合征、阿尔 茨海默症、亨丁顿氏症及肌萎缩性脊髓侧索硬化症。这些疾病都是由于中枢 神经系统中的神经细胞退化及死亡造成的。另外，外部创伤也会造成的神经 损伤，导致严重的行为功能障碍。

神经细胞不会像表皮及肝脏细胞那样快速的再生。虽然，中枢神经系统 中的干细胞也可复制及分化，但其复制速度极慢，分化成神经细胞的比例也 非常低，大部分会分化成为神经胶质细胞，不能治疗神经退化疾病或外部创 伤造成的神经损伤。

神经细胞的移植提供了一个治疗神经退化疾病或神经损伤的新的方向， 研究表明，骨髓干细胞能够在体外经诱导分化为尾申鲸胶质细胞及大神经胶 质细胞。另有研究表明，将胚胎干细胞移植如体内后能够分化为星细胞或寡 树突细胞，极少数转变为神经细胞。但是，胚胎干细胞或骨髓干细胞，不仅 取得困难，移植后的生存率也不高，分化为神经细胞的比例就更低。胚胎干 细胞的移植还收到宗教、道德和法律的限制。

牙髓间充质干细胞(DentalPulpStemCell，DPSCs)是来源于神经嵴的多 能干细胞，与骨髓间充质干细胞(bonemarrowstromalcells，BMSCs)相比较， 两者在人类4400个基因表达水平上是一致的，包括表达细胞外基质成分、细 胞粘附分子、生长因子、转录调节因子等基因，并且具有相似的免疫表型， 在形态上也很类似，但牙髓间充质干细胞与骨髓中提取的干细胞相比有明显 的优势：(1)来源广泛，易于采集(乳牙自然脱落、智齿的拔除等)；(2) 自体应用，安全健康，且不产生免疫排斥反应；(3)分化能力和可塑性更强， 可分化为更多种类的组织细胞；(4)具有更强的增殖能力和自我更新能力。 体外研究发现，DPSCs是来源于神经嵴和间充质的多潜能干细胞，在特定的诱 导条件下可分化为神经样细胞，但是现有技术中，将DPSCs诱导为神经细胞周 期较长，分化效率较低。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种细胞培养液及其应用 以及诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化的方法。本发明提供的细胞培养液能 够用于诱导牙髓干细胞分化为神经样细胞。采用该培养液诱导DPSCs向神经 样细胞分化周期短，分化效率高。

本发明提供的细胞培养液，包括基础培养液、GDNF、Shh、EGF和cAMP。

在本发明的实施例中，GDNF、Shh、EGF和cAMP的质量比为(50～100)： (80～120)：(10～100)：(10～100)。

在一些实施例中，GDNF、Shh、EGF和cAMP的质量比为75:10:55:55。

在一些实施例中，GDNF、Shh、EGF和cAMP的质量比为70:105:50:60。

在一些实施例中，GDNF、Shh、EGF和cAMP的质量比为80:110:60:50。

在一些实施例中，GDNF、Shh、EGF和cAMP的质量比为50:80:10:100。

在一些实施例中，GDNF、Shh、EGF和cAMP的质量比为100：120:100:10。

在本发明的实施例中，GDNF的浓度为50ng/mL～100ng/mL；Shh的浓 度为80ng/mL～120ng/mL；EGF的浓度为10ng/mL～100ng/mL；cAMP的浓 度为10ng/mL～100ng/mL。

胶质细胞系衍生的神经营养因子(glialcell-derivedneurotrophicfactor， GDNF)，对多巴胺能神经样、运动神经样、感觉神经样等多种神经样均具有 营养及损伤后修护作用，是一种重要的生物活性营养因子，参与神经细胞程 序化死亡、促进神经样存活、参与轴突损伤的修复及促进pukinje细胞的分化、 发育。

音猬因子(Sonichedgehog，Shh)，是胚胎发育过程中由脊索产生的一种 因子，作为一种重要的调控因子Shh参与了调控了神经系统的发育和分化过 程。当前研究表明Shh信号途径在胚胎干细胞分化为神经系统的过程中是必 须的。音猬因子可以诱导干细胞生成运动神经样和少突胶质细胞,提高骨髓间 充质干细胞分泌神经营养因子，促进神经样的存活和促进轴突的生长，阻碍 星形胶质细胞的生成。

腺苷-3',5'-环化一磷酸(CyclicAdenosinemonophosphate，cAMP)，参与 调节细胞的许多代谢过程，其影响激素的合成和分泌。并且，cAMP参与神经 节突触传递，在神经组织中起重要作用。

表皮细胞生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)能促进上皮细胞、成 纤维细胞的增值；增强表皮细胞的活力；延缓表皮细胞的老化。

本发明将GDNF、Shh、EGF和cAMP添加入基础培养基，从而提高DPSCs 向神经样细胞分化的百分率。实验表明，添加GDNF、Shh、EGF和cAMP的 实验组中，DPSCs形态在12小时开始发生改变；而在诱导24小时后，DPSCs 形态发生明显变化，细胞折光性开始增强，突起增多增长，分化为神经样细 胞形态。经westernbolt检测，诱导24h后，DPSCs中Nestin和MAP2的表达 量显著提高。

在本发明的实施例中，基础培养液为DMEM/F12无血清培养液。

本发明所用的基础培养液可为自制也可为购买获得，本发明对此不做限 定，其实施皆在本发明的保护范围之内。本发明采用的人干细胞无血清培养 基为DMEM/F12无血清培养液。。本发明采用的基础培养液皆不含有异源血 清，降低了动物源血清给人体带来的风险。

本发明以GDNF、Shh、EGF和cAMP作为诱导因子，以DMEM/F12无 血清培养液作为基础培养液。实验表明，采用本发明提供的细胞培养液诱导 DPSCs向神经样细胞分化的效果优于现有技术。

本发明提供的细胞培养液在诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化中的应 用。

本发明还提供了诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化的方法，包括以下步 骤：

步骤1：牙髓干细胞以基础培养基培养至贴壁后，以EGF预诱导；

步骤2：将经预诱导的细胞以本发明提供的细胞培养液诱导。

在一些实施例中，基础培养基为DMEM/F12无血清培养液。

在一些实施例中，步骤1中牙髓干细胞以基础培养基培养的接种密度为 2×10³个/cm²。

在一些实施例中，步骤1所述培养的时间为4h～6h。

在一些实施例中，步骤1所述培养的条件为5％CO₂、37℃、湿度95％。

在本发明的实施例中，预诱导所用EGF的浓度为10ng/mL～100ng/mL。

在一些实施例中，预诱导所使用EGF的浓度为20ng/mL。

在一些实施例中，预诱导的条件为5％CO₂、37℃、湿度95％。

在本发明的实施例中，预诱导的时间为12h～36h。

在一些实施例中，预诱导的时间为24h。

在本发明的实施例中，预诱导后，弃除培养基，以PBS清洗细胞2次后， 以本发明提供的细胞培养液诱导。

在一些实施例中，步骤2所述诱导的条件为5％CO₂、37℃、湿度95％。

在本发明的实施例中，步骤2所述诱导的时间为12h～36h。

在一些实施例中，步骤2所述诱导的时间为24h。

在本发明的实施例中，牙髓干细胞为3～5代的牙髓干细胞。

在一些实施例中，牙髓干细胞的制备方法为：将牙髓组织以I型胶原酶消 化后，用无血清培养基培养，培养24小时后换液，然后每2～3天换液一次， 培养至贴壁细胞汇合度达80％-90％后，传代。

在一些实施例中，I型胶原酶的质量分数为0.3％。

在一些实施例中，消化的时间为30min。

在一些实施例中，传代具体为：以质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化细胞 后，按照0.8×10⁴个/cm²的密度传代培养。

以本发明提供的方法制备的牙髓干细胞传代3次后，纯度不低于98％。

本发明提供了一种细胞培养液及其应用以及诱导牙髓干细胞向神经样细 胞分化的方法。本发明提供的细胞培养液中包括基础培养液、GDNF、Shh、 EGF和cAMP。本发明提供的培养液能够用于诱导牙髓干细胞分化为神经样 细胞。采用该培养液诱导DPSCs，DPSCs形态在12小时开始发生改变；而在 诱导24小时后，DPSCs形态发生明显变化，细胞折光性开始增强，突起增多 增长，分化为神经样细胞形态。经westernbolt检测，诱导24h后，DPSCs中 Nestin和MAP2的表达量显著提高。因此，本发明提供的培养液诱导DPSCs 向神经样细胞分化的周期短，效率高。

附图说明

图1示未经诱导的DPSCs细胞形态；

图2示实施例1诱导24h后细胞形态；

图3示对比例1诱导24h后细胞形态；

图4示对比例2诱导24h后细胞形态；

图5示实施例1～5和对比例1～3诱导后细胞Nestin、MAP2和β-tubulin (对照)的表达量；其中，泳道1示实施例1诱导24h后细胞中Nestin、MAP2 和β-tubulin的表达量；泳道2示实施例2诱导12h后细胞中Nestin、MAP2 和β-tubulin的表达量；泳道3示实施例3诱导36h后细胞中Nestin、MAP2 和β-tubulin的表达量；泳道4示实施例4诱导36h后细胞中Nestin、MAP2 和β-tubulin的表达量；泳道5示实施例5诱导24h后细胞中Nestin、MAP2 和β-tubulin的表达量；泳道6示对比例1诱导24h后细胞中Nestin、MAP2 和β-tubulin的表达量；泳道7示对比例2诱导24h后细胞中Nestin、MAP2 和β-tubulin的表达量；泳道8示对比例3诱导24h后细胞中Nestin、MAP2 和β-tubulin的表达量；

图6示实施例1、对比例1诱导48小时过程中细胞中Nestin、MAP2和 β-tubulin的表达量变化。

具体实施方式

本发明提供了一种细胞培养液及其应用以及诱导牙髓干细胞向神经样细 胞分化的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易 见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施 例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文 的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中，牙髓干细胞的制备方法为：将牙髓组织用0.3％I型胶原酶消化30min 后，以1500rpm离心5min，弃除上清液。用DMEM/F12无血清培养液重悬 细胞沉淀，放置37℃、5％CO₂培养箱中培养，24小时换液，随后每2-3天换 液一次；当贴壁细胞汇合度达80％～90％后，用0.25％胰蛋白酶消化,以 1000rpm离心5min，按照0.8×10⁴cells/cm²细胞密度传代。

牙髓干细胞传至第3代，流式细胞检测牙髓干细胞细胞表面标志，方法 为：调整细胞密度1×10⁶个/mL的单细胞悬液。分装4管，每管200μl，每管 加入CD45、CD59、CD90及HLA-DR抗体各2μl，室温反应30min,流式 细胞仪检测。结果显示，流式细胞仪检测牙髓细胞的表面标志，观察到牙髓 干细胞表面标志CD45(白细胞阳性)、HLA-DR(MHC-II类分子)为均呈现阴性， 同时牙髓干细胞表面标记物CD59、CD90均呈现阳性。第三代以后的牙髓干 细胞细胞形态均一，纯度在98％以上。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1～5

采用3-5代的牙髓干细胞，按照2×10³个/cm²接种密度接种六孔板中。用 DMEM/F12培养4h～6h细胞贴壁后，分别加入EGF预诱导后，弃去完全培养 基，以PBS清洗细胞两次，加入本发明提供的细胞培养液(含GDNF、Shh、 EGF、cAMP的DMEM/F12无血清培养基)，诱导培养细胞后。观察牙髓干细 胞分化情况。各实施例采用的预诱导条件、细胞培养基成分核诱导条件如表1 所示：

表1，实施例1～5

将各实施例细胞经预诱导和诱导后，以电镜观察细胞形态，结果显示， 细胞形态在12小时开始发生改变，而在诱导24小时后发生明显变化，细胞 折光性开始增强，突起增多增长，分化为神经样细胞形态。其中，未经诱导 或预诱导的细胞形态如图1所示，实施例1诱导24h后的细胞形态如图2所 示。本发明其他实施例诱导后的细胞形态与图2相似。

对比例1～3

采用3-5代的牙髓干细胞，按照2×10³个/cm²接种密度接种六孔板中。用 DMEM/F12培养4h～6h细胞贴壁后，分别加入EGF预诱导后，弃去完全培养 基，以PBS清洗细胞两次，加入各对比例的细胞培养液，诱导培养细胞后。 观察牙髓干细胞分化情况。各实施例采用的预诱导条件、细胞培养液成分核 诱导条件如表2所示：

表2对比例1～3

将各对比例细胞经预诱导和诱导后，以电镜观察细胞形态，结果显示， 细胞形态在诱导24小时后发生变化，单但变化不及实施例1～5明显，细胞折 光性有所增强，突起增多增长，呈现一定的分化状态，但还不能完全表现为 神经样细胞形态。其中，对比例1诱导24h后的细胞形态如图3所示；对比 例2诱导24h后的细胞形态如图4所示。对比例3的效果与图3相似。

实施例6

提取实施例1～5和对比例1～3诱导有细胞的总蛋白，进行Westernblot 检测诱导过程中Nestin和MAP2表达的变化，具体为，将各提取获得的总蛋 白以12％的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，80V转膜1h至PVDF膜。用 5％BSA室温封闭1h，加入抗Nestin、MAP2一抗(1:200)或β-tubulin抗体 (1:200)，4℃过夜；洗膜，加入HRP标记的二抗(1:2000)，室温孵育60min； ECL发光。结果如图5。

结果显示，各实施例和对比例在诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化后， Nestin、MAP2的表达量均升高，符合神经样细胞中特异性蛋白表达情况。 各实施例诱导细胞中的Nestin、MAP2的表达量明显高于对比例，说明各实 施例的牙髓干细胞与对比例相比，更进一步的分化为了神经样细胞。

实施例7

采用对比例1和实施例1的方案诱导细胞48小时，分别于诱导的24小 时、36小时、48小时收集细胞提取总蛋白，以实施例6所述的方法进行Nestin 和MAP2表达量的检测。结果如图6。结果显示，实施例1诱导细胞24h后， 细胞中Nestin和MAP2的表达量已经显著高于对比例1诱导细胞48h。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。