化学方法体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞成神经样细胞分化

摘要

骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）来源于骨髓，是一类具有自我复制、多向分化潜能的干细胞，可在体内外经诱导分化成包括肌细胞、脂肪细胞、骨细胞以及神经元样细胞等在内的多种组织细胞。其来源广泛、可操作性强，又不像胚胎干细胞面临伦理学方面的争议，成为组织工程和细胞治疗学方面的理想种子细胞。本研究分别从大鼠骨髓间充质干细胞的复苏、培养和鉴定，向神经样细胞化学诱导分化，以及分化后持续培养过程神经特异标志分子表达等三个方面进行了研究；同时将密度梯度离心法与流式细胞分选技术相结合，建立了快速分离培养获得高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的方法。这些工作为骨髓间充质干细胞的进一步研究应用奠定了一定基础。
　　在本研究中，我们首次比较了?-巯基乙醇（?-mercaptoethanol, BME）和丁羟基茴醚（butylated hydroxyanisole, BHA）两种方法化学分别诱导大鼠骨髓间充质干细胞成神经样细胞分化过程中相关标志分子表达差异。将大鼠骨髓间充质干细胞培养至第4、5代，用流式细胞术鉴定MSCs相关标志分子（CD44和CD90）和造血细胞系表面标志分子（CD45和CD11b）表达情况。骨髓间充质干细胞经两种化学方法诱导后，细胞开始出现形态变化：细胞收缩，由梭形变成圆形或椭圆形，并伸出轴突样突起，呈现出以双极为主（含多极）的神经样细胞形态，且表达了神经细胞相关标志分子巢蛋白（Nestin）、胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）以及神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE），但表达水平有差异。BHA诱导组相对BME诱导组高表达GFAP和NSE蛋白，而低表达Nestin蛋白，表明BME可能更倾向于诱导BMSCs向神经元前体干细胞分化。骨髓间充质干细胞在诱导分化后，更换成完全培养基继续培养过程中，丁羟茴醚诱导组细胞GFAP基因和?-巯基乙醇诱导组Nestin基因表达量随着培养时间的推移均逐渐下降，细胞也失去神经样细胞形态。这说明化学方法诱导分化的效果可能是可逆、非持续性的。
　　此外，我们在密度梯度离心的方法上，结合流式细胞分选技术，建立了快速分离培养获得高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的方法。先通过密度梯度离心（Ficoll分离液）从大鼠骨髓中初步分离获得原代骨髓间充质干细胞，接种到细胞培养瓶贴壁培养，至第5天可见明显骨髓间充质干细胞生长群落。第7天传第一代，到细胞长满80-90％，胰酶消化，用荧光标记抗CD271抗体孵育后通过贝克曼公司MoFlo XDP超高速流式细胞分选仪圈门分选出CD271阳性细胞。分选出的阳性细胞继续培养，此时细胞形态、性质均一，纯度较高。
　　综上所述，在本研究中，我们比较了丁羟茴醚和?-巯基乙醇两种经典化学方法诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的差异，检测了相关神经标志分子的在基因水平和蛋白水平的表达差异；同时探索了将密度梯度离心与流式分选相结合，快速分离培养获得高纯度骨髓间充质干细胞的方法，为间充质干细胞的进一步研究应用打下了基础。

目录

声明

主要缩略语表

引言

第一章 大鼠骨髓间充质干细胞复苏、培养与流式细胞术鉴定

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 结果分析与讨论

第二章 两种化学方法诱导骨髓间充质干细胞成神经样细胞分化

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 结果分析与讨论

第三章 骨髓间充质干细胞成神经样细胞可持续分化研究

1 实验材料与试剂

2 实验方法

3 实验结果

4 结果分析

第四章 大鼠骨髓间充质干细胞快速分离培养方法

1 实验材料与试剂

2 实验方法

3 实验结果

4 结果分析与讨论

结论

参考文献

综述:骨髓间充质干细胞成神经样细胞分化研究进展

致谢

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