二甲双胍作为转化生长因子-β受体拮抗剂的新应用

摘要

本发明提供了二甲双胍作为转化生长因子-β受体拮抗剂的新应用。具体而言，本发明提供了二甲双胍或其药学上可接受的盐作为转化生长因子-β受体拮抗剂的应用；还提供了一种包括有效量的二甲双胍或其药学上可接受的盐的转化生长因子-β受体拮抗剂；还提供了一种阻止TGF-β配体与受体结合的方法，该方法包括利用二甲双胍或其药学上可接受的盐，使其与TGF-β配体结合，从而阻止TGF-β配体与受体结合。

说明书

技术领域

本发明涉及二甲双胍的新应用，具体是其作为转化生长因子-β受体拮抗剂的新 应用。

背景技术

转化生长因子-β(Transforminggrowthfactorbeta,TGF-β)属于TGF-β超家族蛋 白，是由两个结构相同或相近的、分子量的12.5kDa亚单位借二硫键连接的双体。在 哺乳动物至少发现有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β1β2四个亚型。TGF-β1与 TGF-β2有71%氨基酸同源性，TGF-β1与TGF-β3有77%同源性，TGF-β2与TGF-β3 有80%同源性。TGF-β与TGF-β超家族其化成员有30～40%同源性。人TGF-β1、 TGF-β2和TGF-β3的基因分别定位于染色体19q3、1q41和14q24，均含有7个外显 子，核苷酸序列有高度同源性，所编码的前体分子C端者有9个保守的Cys，提示 TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3基因可能来自一个共同的祖先基因。人和小鼠TGF-β1 的同源性高达99%，表明在不同种属中TGF-β都具有重要的生物学功能。研究表明， TGF-β参与多种细胞功能，包括细胞生长、细胞迁移与侵袭、上皮-间质转化 (Epithelial-mesenchymaltransition,EMT)、细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）重 构及免疫调节等功能。TGF-β在肿瘤、纤维化和炎症等疾病状态中高表达，并且这些 高水平的TGF-β加重了疾病进展，因此TGF-β信号通路成为研发相关药物的重要靶 点。

TGFβ1下游经典的激活通路是Smad信号通路。TGFβ1与II型TGF-β受体结合， II型TGF-β受体二聚化增加，招募I型TGF-β受体组成复合物，II型TGF-β受体具有 丝/苏氨酸激酶活性，可磷酸化并激活I型TGF-β受体，继而磷酸化下游的receptor activatedSmads,R-Smads（Smad2,Smad3），磷酸化后的Smad2/3与Co-Smad(Smad4) 结合，转位入核，作为转录因子启动基因表达（PMID:22992590）。

高水平的TGF-β参与肿瘤发生发展的机制主要包括以下两个方面：第一，促进 上皮-间质转化（EMT）。EMT可促进肿瘤细胞迁移（migration）并更具有侵袭性 （invasive）。EMT还促进细胞向肌成纤维细胞（myofibroblast）表型转化。肌成纤 维细胞增加细胞外基质产生，增加间质液体压力，从而使抗肿瘤药物难以达到肿瘤内。 另外，EMT还使肿瘤细胞向“干细胞样”特性转化，增加肿瘤生长能力以及其抗药 性。第二，抑制免疫反应。肿瘤进展过程中，高水平的TGF-β通过减弱CD8+T细胞， CD4+T细胞和树突状细胞的抗肿瘤效应，抑制机体的免疫监督能力。TGF-β还可抑 制自然杀伤细胞产生干扰素γ，而干扰素γ是自然杀伤细胞杀死肿瘤细胞所必须的因 子。TGF-β可促进巨噬细胞由M1型向M2型转化。M1型主要参与攻击外来物如肿 瘤细胞。而M2型的攻击能力明显下降，主要分泌大量炎症因子，如白介素6、白介 素1和TGF-β。这些因子加重局部疾病状态，促进肿瘤进展和炎症(PMID:23000686)。

TGF-β的另一重要生物学功能为促纤维化。纤维化的主要表现为成纤维细胞的堆 积和细胞外基质如胶原的大量分泌。TGF-β是公认的促纤维化的因子，它促进胶原的 合成和成纤维细胞的沉积。同时，TGF-β促EMT的效应还会进一步的加重纤维化， 包括肺脏、心脏、肾脏以及手术后的动脉再狭窄等（PMID:23000686)。因此TGF-β 已作为不同种纤维化疾病的共同治疗靶点。例如特发性肺纤维化（表现为原因不明的 进行性肺功能下降，5年生存率仅20%）、肾纤维化、硬皮病、马凡氏综合征以及眼 角膜术后的角膜纤维化的治疗等(PMID:23063463PMID:23000686)。由于心脏纤维 化是导致心力衰竭的重要病理过程，因此以TGF-β为靶点的抗纤维化治疗也被认为 是预防心力衰竭的重要治疗靶点（PMID:21883991）。只是目前还没有临床实验将 TGF-β信号通路抑制剂应用于心脏纤维化的治疗。

针对TGF-β信号通路的不同成分可有多种药物设计策略，目前已经进入临床实 验的有以下几种：其中大分子抑制剂的有拮抗配体的反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides,ASO）和单克隆抗体；小分子抑制剂主要为一些小分子化合物，其作 用靶点是TGF-βI型受体。

反义寡核苷酸（ASO）：ASO是一段人工合成的单链核苷酸序列，与靶基因或 mRNA某一区段互补。ASO进入细胞后，通过碱基互补原则结合于靶基因/mRNA上， 通过不同机制影响靶基因的表达。在靶标实验中证明有效的反义寡核苷酸可以被进一 步开发成为反义寡核苷酸药物。目前开发的针对TGF-β信号通路的ASO主要是针对 配体靶基因，如TGF-β1、TGF-β2。针对TGF-β2的ASO，如AntisensePharma公司 开发的Trabedersen(AP12009)，用于治疗胶质细胞瘤与胰腺癌，现已进入III期临床 实验。同一公司开发的针对TGF-β1的ASO，用于治疗非小细胞肺癌，目前尚在临床 前阶段（PMID:20001556）。此外，基于反义核苷酸技术，NovaRx公司开发了异体 肿瘤细胞疫苗（Belagenpumatucel-L，Lucanix），该异体疫苗制备自四种肺癌细胞株， 用含TGF-β2的反义基因质粒进行转染，使TGF-β2产生减少，从而帮助机体重建对 肿瘤细胞的免疫力，目前已进入III期临床实验（PMID:16966690）。然而，ASO作 为TGF-β抑制剂的实际应用存在以下问题：①效率低：由于ASO需进入细胞内与靶 基因结合才能发挥作用。但是未经修饰的ASO由于其自身电荷特性使得它很难穿过 细胞膜进入细胞内。即便人们设计了多种方案例如化学修饰、加入载体等以促进ASO 进入细胞，但ASO被细胞摄取的效率仍很低。②不稳定：ASO通常为20nt左右的单 链核苷酸，未经修饰的ASO很容易被生物体液中的核酸酶降解。即便化学修饰可以 增强其抵抗核酸酶的能力，但其稳定性仍远不如化合物。③给药不方便，难以到达靶 器官：作为大分子抑制剂，ASO的药代动力学特性使得它难以到达靶器官发挥治疗 效应。虽然可以局部用药，但对于一些内部器官肿瘤，如神经胶质瘤，局部应用通常 为有创的，副作用严重，患者无法因此受益。④造价高：ASO要真正用于临床，需 要经过各种化学修饰并加上载体，以促进ASO抵抗核酸酶的能力和被细胞摄取的效 率。因此造价相对较高。

单克隆抗体：单克隆抗体技术(monoclonalantibodytechnique)是将产生抗体的单 个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体又能无限增殖的杂种细胞并以此 生产抗体的技术。单克隆抗体是一种非常有效的抑制TGF-β信号通路的治疗策略。 它可特异性地与配体结合，阻止配体与受体的结合，从而有效地切断下游信号通路。 与ASO不同的是，单克隆抗体在细胞外发挥作用。这一特性一方面使得它比ASO能 更有效地发挥作用，另一方面使得单克隆抗体可以只阻断过多的配体作用，而不会像 ASO那样有可能使TGF-β表达过低，无法发挥其正常生理功能(PMID:23000686)。 目前进入临床实验的针对TGF-β信号通路的单克隆抗体基本都是人源化抗体，例如 CambridgeAntibodyTechnology开发的抗TGF-β1配体的Metelimumab(CAT-152)，抗 TGF-β2配体的Lerdelimumab(CAT-192)和针对TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三种配体 的Fresolimumab(GC-1008)。EliLilly公司开发的抗TGF-β1配体的LY2382770。然而， 单克隆抗体的应用存在以下局限性：①组织穿透性差：单克隆抗体给药途径仅限于静 脉给药。然而，单克隆抗体分子量大，难以穿透肿瘤组织，到达靶组织。有研究发现， 在动物模型中，给予抗肿瘤特异性抗原的单克隆抗体治疗，只有不到20%的抗体到达 肿瘤内，其余大多数都在血液中（PMID:17154393）。②不易储存：大多数单克隆抗 体是大分子糖蛋白，分子量大，结构复杂，不利储存。储存条件不当，很容易导致抗 体失活。③造价高：单克隆抗体研发费用高（平均每个单抗药物的研发费用为10～ 18亿美元）、生产过程技术含量和质量标准高、用药量大、培养液及发酵设备昂贵 使得抗体药物价格居高不下。

小分子抑制剂：目前开发的小分子抑制剂主要是在受体水平阻断TGF-β超家族 信号通路。这些小分子抑制剂通常为ATP类似物，可以竞争性地结合在TGF-βI型 受体激酶的ATP结合口袋，抑制TGF-βI型受体的激酶活性，从而抑制下游Smad磷 酸化，发挥其拮抗TGF-β信号通路的作用。这些小分子化合物的优点在于：造价低 廉，可大规模生产；稳定，不易失活；给药方便，可口服。但这些小分子抑制剂也存 在以下缺点：特异性不够高，由于这些小分子抑制剂针对的是受体的激酶活性，有可 能抑制其它激酶的活性，产生非预期的副作用。

另一方面，二甲双胍是一类广泛用于治疗糖尿病的一线口服降糖药，它主要通过 抑制肝脏葡萄糖产生发挥降糖作用。由于二甲双胍并不刺激胰岛素分泌，不会出现低 血糖的副作用，甚至对于高胰岛素血症还具有降低血浆胰岛素的作用，因而它被称作 “胰岛素增敏剂”。二甲双胍是目前唯一被证实具有心血管保护作用的降糖药。此外 它还可以用于治疗一些伴随有胰岛素抵抗的疾病，如多囊卵巢综合征（PMID 14576245）、非酒精性肝病（PMID11567710）。二甲双胍的副作用较少，主要为胃 肠道反应和乳酸酸中毒。乳酸酸中毒多见于药物过量和有禁忌症的患者（如肾功能受 损等）。二甲双胍是一个小分子化合物，临床用药为盐酸二甲双胍，分子量仅165.62。 它在生理pH值条件下为水溶性的正价阳离子，脂溶性很低，因而难以透过细胞膜， 需要转运子转运入胞内。二甲双胍在体内几乎不与任何蛋白结合，不被代谢，以原型 进入尿液排出体外。对于肾功能正常的患者，清除半衰期为5小时（PMID:21241070）。 目前认为二甲双胍药理作用的分子机制主要是通过激活AMP激活激酶(AMP activatedkinase,AMPK)。

另有文献报道二甲双胍可以抑制病理刺激引起的心脏纤维化，其机制为抑制 TGF-β下游Smad3信号通路（PMID:20200042）。但是具体二甲双胍如何抑制TGF-β 信号通路并不清楚。

经检索，未发现现有技术中有将二甲双胍或其盐用作TGF-β拮抗剂的报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种新型安全的转化生长因子-β（Transforminggrowth factorbeta,TGF-β）拮抗剂。

本发明的另一目的在于提供二甲双胍（metformin）或其药学上可接受的盐作为 TGF-β受体拮抗剂的新应用。

本发明的另一目的在于提供一种阻止TGF-β配体与受体结合的方法。

本案发明人在研究中发现，二甲双胍或其药学上可接受的盐可作为TGF-β受体 拮抗剂，其能够与TGF-β结合，阻止配体与受体的结合，从而有效地切断下游信号 通路。

具体而言，本发明通过实验证实二甲双胍或其药学上可接受的盐对碘¹²⁵标记 TGF-β1结合其受体具有抑制作用。进一步，利用单分子荧光成像技术分析二甲双胍 或其药学上可接受的盐对TGF-β1II型受体(TβRII)二聚化比例的影响，明确二甲双胍 或其药学上可接受的盐抑制TGF-β1引起的受体二聚化比例增加。更进一步的研究证 实二甲双胍或其药学上可接受的盐并不影响TGFβ1与其受体的结合力，但抑制 TGFβ1与其受体的结合概率。此外，通过分子对接与分子动态模拟分析了二甲双胍 或其药学上可接受的盐与TGFβ1或其受体之间可能的结合位点。并最终通过蛋白质 印迹法验证了二甲双胍或其药学上可接受的盐通过与TGF-β1而非TβRII结合阻断 TGF-β信号通路。

从而，一方面，本发明提供了一种新型安全的转化生长因子-β（Transforminggrowth factorbeta,TGF-β）受体拮抗剂，其包括有效量的二甲双胍或其药学上可接受的盐。

根据本发明的具体实施方案，二甲双胍或其药学上可接受的盐中，所述药学上可 接受的盐为盐酸盐，即，二甲双胍的药学上可接受的盐为盐酸二甲双胍。

另一方面，本发明提供了二甲双胍或其药学上可接受的盐作为TGF-β受体拮抗 剂的新应用。

另一方面，本发明提供了一种阻止TGF-β配体与受体结合的方法，该方法包括 利用二甲双胍或其药学上可接受的盐，使其与TGF-β配体结合，从而阻止TGF-β配 体与受体结合。

二甲双胍兼具单克隆抗体和小分子抑制剂的优点：它与单克隆抗体一样在细胞外 发挥作用；分子量小，易于进入靶向组织；给药方便，可口服；半衰期短，易于控制 剂量，如出现不良反应可及时停药；稳定，不易失活；造价低廉，可大规模生产。另 外，由于二甲双胍已在临床应用几十年，从安全性的角度来说已有大量证据。因此， 根据本发明的研究成果提示，二甲双胍有望作为新的TGF-β拮抗剂应用于临床。

附图说明

图1：二甲双胍对碘¹²⁵标记TGF-β1结合其受体的抑制作用。将无二甲双胍组的 特异性结合放射强度设为100%。此为三次独立实验结果。

图2A～图2D：单分子荧光成像技术分析二甲双胍对TGF-β1II型受体(TβRII)二 聚化比例的影响。其中，图2A：细胞膜表面TβRII-GFP的典型单分子图像，圈内的 即为单个分子的TβRII-GFP信号，用于荧光强度分析，再进行荧光漂白得到漂白曲 线，标尺为5μm。图2B：二甲双胍对TGF-β1（5ng/mL）作用下TβRII二聚化比例的 影响。图2C：一步漂白曲线代表图，提示该荧光信号代表单个TβRII-GFP分子即单 体形式。图2D：二步漂白曲线代表图，提示该荧光信号代表两个TβRII-GFP分子即 二聚体形式。

图3：用TGF-β1修饰的AFM针尖在活细胞上进行单分子测力的示意图。

图4A～图4D：原子力显微镜分析TGF-β1与TGF-βII型受体(TβRII)之间结合力 及结合概率。图4A与图4B分别为无二甲双胍（metformin）和1mM二甲双胍下， TGF-β1与TGF-β受体结合力的统计分布。图4C：比较有无二甲双胍情况下，TGF-β1 与TGF-β受体结合力的大小。图4D：比较有无二甲双胍情况下，TGF-β1与TGF-β 受体结合概率的变化。TGF-β1中和抗体可以阻止TGF-β1与其受体结合，此处作为 阳性对照。

图5A为二甲双胍（灰色小分子）在TGF-β1ARG25和His34处的结合视图。图 5B为二甲双胍与TβRII在ILE53和PHE30处形成的结合构象。蛋白质表面以深色代 表TGF-β1和TbRII的结合界面。

图6A与图6B分别为TGF-β1:二甲双胍（metformin）体系与TGF-βII型受体 (TbRII):二甲双胍体系的均方根位移偏差（RMSD）变化图。

图7：二甲双胍（metformin）与TGF-β1相互作用图。虚线代表氢键，实线代表 疏水作用。

图8：蛋白质印迹法验证二甲双胍通过与TGF-β1而非TGF-β受体结合阻断TGF-β 信号通路。

图9：二甲双胍抑制血管紧张素II引起的心脏纤维化实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照所属领 域的常规操作进行，或按照制造厂商所建议的条件进行。

以下各实施例中，所用原始试剂和材料均可商购获得。各实施例中所用二甲双胍 为其盐酸盐的形式，即，盐酸二甲双胍。

实施例1、碘¹²⁵标记TGF-β1结合实验

小鼠胚胎成纤维细胞系3T3细胞种于24孔板，当接近长满状态时，加入50pM 碘¹²⁵标记TGF-β1(PerkinElmer)以及不同浓度的二甲双胍（metformin）。4度孵育4 小时后，冰上用结合缓冲液（50mMHepes,128mMNaCl,5mMKCl,5mMMgSO₄, 和1.2mMCaCl₂）冲洗5次。再用含1%TritonX-100的结合缓冲液裂解细胞，收集 各孔裂解液，利用γ计数器（上海核所日环光电仪器有限公司）测放射性强度。非特 异结合孔加入10nM非标记TGF-β1（Peprotech）。三次独立实验。

结果参见图1。将无二甲双胍组的特异性结合放射强度设为100%。三次独立实 验测得二甲双胍对碘¹²⁵标记TGF-β1结合其受体的半数抑制浓度IC50的对数值为 -4.16±0.53。

本实施例的结果表明，二甲双胍能够抑制TGF-β1与其受体结合。

实施例2、单分子荧光成像技术分析TGF-β1II型受体(TβRII)二聚化比例

TGF-β1与II型TGF-β受体结合后，II型TGF-β受体二聚化增加，进而招募I型 TGF-β受体组成复合物，II型TGF-β受体具有丝/苏氨酸激酶活性，可磷酸化并激活I 型TGF-β受体，继而磷酸化下游的Smad通路。II型TGF-β受体的二聚化，是激活 下游Smad通路的始动步骤。本实施例是研究二甲双胍对II型TGF-β受体二聚化的 影响。

本实施例中，在HEK293细胞中转染胞内端连接有单个绿色荧光蛋白（green fluorescenceprotein，GFP）分子的TGF-βII型受体（TβRII-GFP）质粒（编码全长T βRII的DNA片段通过基因重组被连接到pEGFP-N1（Clontech）的HindIII和BamHI 两个酶切位点之间，形成表达质粒TβRII-GFP）。TβRII-GFP质粒在细胞内低水平 表达后，利用全内反射荧光显微镜，对细胞膜下表面进行单分子成像，根据单个GFP 分子呈现一步荧光光漂白、两个GFP分子呈现两步荧光光漂白的光物理特性，对 TβRII-GFP的光漂白步数进行分析统计，得到受体单体和二聚体的比例。从而研究二 甲双胍对TGF-β1与受体结合后受体二聚化情况的影响。

具体操作步骤如下：

1）质粒转染：HEK293细胞在37℃，5%的CO2的培养箱中培养，培养基为添 加有10%的胎牛血清（HyClone）的DMEM（Gibco）。转染试剂是lipofectamine2000 （Invitrogen）。细胞培养在35-mm的玻璃底培养皿（杭州生友生物技术有限公司） 中。转染时质粒用量为0.2ug/ml。为了实现单分子成像，细胞与质粒孵育时间都小于 4h。冲洗完转染试剂后，细胞在无血清、无酚红的培养基中培养并成像。为使蛋白表 达量升高，细胞用无血清的培养基转染，4h后换成有血清的完全培养基，蛋白再次 表达4-12h后才用于荧光成像。若要对细胞添加配体刺激，首先往转染后的细胞中 加入含有200pMTGF-β1（R&D）的无血清培养基中，在4℃条件下刺激15min。转 染或刺激后的细胞用磷酸缓冲液（phosphatebuffersolution,PBS）（4℃）冲洗两次， 然后用4%的多聚甲醛/PBS溶液室温固定30分钟，PBS洗3遍后，室温下成像。

2)单分子荧光成像：单分子荧光成像在物镜型全内反射显微镜上完成,物镜型全 内反射荧光显微镜（TIRFM）搭载于倒置的OlympusIX71显微镜上，配有TIRF照 明器、100X/1.45NA的平场复消色差全内反射物镜（Olympus）和14-bitEMCCD （back-illuminatedelectron-multiplyingcharge-coupleddevicecamera，AndoriXon DU-897BV）。EGFP使用氩离子激光器（MellesGriot）488nm激光激发。采集速度 为10Hz，连续采集300帧。

3)图像分析：细胞单分子荧光强度通过以下步骤得到：每个影像的背景荧光利 用ImageJ（NIH）软件中的“rollingballmethod”去除。每个图像的第一帧用于荧光 点的选择。扣除背景后的影像经滤波过滤再次降低噪音。然后设定一合适的阈值（无 荧光点的区域的平均强度的四倍），低于该阈值被视为背景噪音而丢弃。高于阈值的 候选荧光点中，如果光斑小于3个像素也被视为噪音而丢弃。如果两个荧光点相邻很 近（中心像素间隔小于3像素），两个点都被舍弃。以荧光点的强度最高的像素为中 心的3×3像素区域被作为一个衍射极限内的点，统计这些点的像素强度值并且再次 扣除残余背景而得到强度分布。对于固定细胞，首先对拍摄的300帧图像的每一帧图 像利用ImageJ软件rollingball方法去除荧光背景，然后将前五帧图片叠加后进行平 均。对平均后图片，使用无荧光区域平均强度的四倍设置阈值后，采用高斯拟合的方 法寻找所有高于阈值的点，并对选出的点采用上述提到的标准进行筛选。对于最终符 合标准的单分子点，记录其每一帧的荧光强度值，从而获得其荧光强度随时间的漂白 曲线图，用作漂白步数统计分析。对于部分漂白台阶无法判断或者漂白行为异常的点 给予舍弃（约30%）。漂白步数的分析方法与文献（PMID:18757751）报道的一致。

实验结果如图2A～图2D所示，图2A显示细胞膜表面TβRII-GFP的典型单分子 图像，圈内的即为单个分子的TβRII-GFP信号，用于荧光强度分析，再进行荧光漂 白得到漂白曲线，标尺为5μm。图2B显示二甲双胍对TGF-β1（5ng/mL）作用下TβRII 二聚化比例的影响，根据该图所示结果，二甲双胍可以剂量依赖地抑制TGF-β1引起 的II型TGF-β受体二聚化比例增加。图2C为一步漂白曲线代表图，提示该荧光信号 代表单个TβRII-GFP分子即单体形式。图2D为二步漂白曲线代表图，提示该荧光信 号代表两个TβRII-GFP分子即二聚体形式。

实施例3、原子力显微镜分析TGF-β1与受体之间结合力及结合概率

本实施例利用原子力显微镜（atomicforcemicroscope，简称AFM）分析二甲双胍 对TGF-β1与受体(TbRII)之间结合力及结合概率的影响。实验用的AFM针尖为氮化 硅针尖（型号：NP，针尖半径为20-60nm，Veeco，SantaBarbara，CA，USA），通过 热扰动方法进行校正，弹性常数范围在0.0347到0.0621N/m范围内。针尖的修饰方 法参考文献(PMID:17997544，PMID:19497323)：对于针尖的修饰除用乙醇浸泡代替 在氯仿中超声外，清洗方法参照文献(PMID:17997544，PMID:19497323)，得到Si-OH 表面。然后将针尖转移至1.0%（v/v）MPTMS的甲苯溶液中，室温反应2h，并依次 用甲苯、丙酮和乙醇清洗，这样就在针尖表面上修饰上了巯基。用氮气吹干后，将硅 片转移到1mg/mlNHS-PEG-MAL（双功能团的PEG作为联结剂）的二甲亚砜（DMSO） 溶液中室温反应3h，然后用DMSO溶液清洗除去未反应的NHS-PEG-MAL，这样通 过AFM针尖上的巯基基团与MAL共价作用将NHS-PEG-MAL连接在了针尖表面。 活化的针尖浸泡在蛋白质TGF-β1的PBS溶液中（3X10^-8mol/l），室温培育0.5h，这 样蛋白质通过氨基与PEG的NHS端共价连接。PBS清洗后，将蛋白质修饰好的针尖 在4℃中储存于PBS缓冲溶液中待用。配体TGF-β1修饰的AFM针尖在活细胞上测 力的示意图如图3所示。实验所用仪器为PicoSPMII配有PicoScan3000控制器，及 大扫描头（Agilent，USA）。AFM扫描器安装于倒置荧光显微镜上方（OlympusIX71， Japan）。活细胞上力曲线用PicoScan5软件（Agilent，USA）进行采集，并采用高斯 拟合的方法进行数据统计和分析。所有活细胞上的力曲线均为室温下接触模式所测 得。另外，AFM在活细胞上测得力的大小都是在1.0X104pN/s加载速率下所得。

结果如图4A～图4D所示，图4A与图4B分别为无二甲双胍（metformin）和1mM 二甲双胍下，TGF-β1与TGF-β受体结合力的统计分布；图4C为比较有无二甲双胍 情况下，TGF-β1与TGF-β受体结合力的大小；图4D为比较有无二甲双胍情况下， TGF-β1与TGF-β受体结合概率的变化。TGF-β1中和抗体可以阻止TGF-β1与其受体 结合，此处作为阳性对照。可见二甲双胍并不影响TGF-β1与其受体的结合力（对照 vs.二甲双胍,49.5±1.3vs.49.3±1.4pN），但抑制TGF-β1与其受体的结合概率（对照 vs.二甲双胍,21.7±3.5%vs.9.9±1.2%,P<0.05）。

实施例4、分子对接与分子动态模拟分析二甲双胍与TGF-β1或其受体(TβRII)之 间可能的结合位点

由于二甲双胍可抑制TGF-β1与其受体的结合概率，从理论上来存在三种可能： 通过与TGF-β结合以抑制TGF-β与TβRII的相互作用；通过结合TβRII以抑制TGF-β 与TβRII的相互作用；二甲双胍可以同时与TGF-β和TβRII结合以抑制TGF-β与TβRII 的相互作用。本实施例采用分子对接手段研究TGF-β和TβRII上二甲双胍可能的结 合位点，综合比较了结合自由能、结合位点与TGF-β:TβRII复合体结合界面的远近 程度、二甲双胍结合的稳定性等指标，认为有较大的可能是二甲双胍通过与TGF-β 结合以抑制TGF-β与TβRII的相互作用，进而抑制TGF-β信号通路的靶标，其结合 位点位于在TGF-β参与结合TβRII的关键氨基酸Arg25所形成的口袋。

刚性对接：在最初的对接中，把配体与受体均视为刚性，对整个蛋白的周围空间 进行全局搜索，并对二甲双胍与受体蛋白的复合体构象作聚类分析(同一个聚类中配 体位置的均方根偏差RMSD<0.2nm)，从而挑选出二甲双胍可能的一些结合位点。 在这些结合位点中优先选择二甲双胍在TGF-β1:TbRII的结合位点附近且配体与受体 的几何匹配程度好的结合构象。图5A为二甲双胍（深色小分子）在TGF-β1ARG25 和His34处的结合视图，图5B显示二甲双胍与TβRII在ILE53和PHE30处形成的 结合构象。蛋白质表面以深色代表TGF-β1和TbRII的结合界面。其对应的结合数据 由表1可得。以TGF-β1蛋白为例，在一百次对接中二甲双胍有12次结合在TGF-β1 与TβRII的结合界面，其中最低的结合自由能为-17.66kJ/mol，排名第6。而在TβRII 蛋白中，在一百次对接中二甲双胍有2次结合在TGF-β1与TbRII的结合界面，其中 最低的结合自由能为-17.37kJ/mol，排名第4。

表1二甲双胍刚性对接数据（在TGF-β1-TbRII结合位点附近）

柔性对接：在上述的基础上，将搜索区域限制在刚性对接中挑选出的结合位点（即 排名第6/4的两个复合体结构中二甲双胍的结合位点）附近4.5A的区域，并考虑了 配体的柔性作了进一步的精细的对接，而受体仍为刚性。从表2比较可以明显看到， 在考虑了配体柔性后，受体蛋白与二甲双胍的结合稳定性进一步上升，尤其在TGF 系统中更为明显。本发明进一步对这两个复合体进行分子动力学的优化。

表2二甲双胍柔性对接数据

分子动力学模拟：在动力学模拟的过程，将通过二甲双胍位置的均方根位移偏差 (RMSD)来反映药物与蛋白的结合稳定性(药物相对于蛋白的运动)及蛋白质和配体自 身构象的变化，并在此基础上进一步分析药物与蛋白间形成相互作用力。

TGF-β1:二甲双胍（metformin）体系与TbRII:二甲双胍体系的RMSD变化图参见 图6A与图6B。由图6A可以明显看出在TGF-β1:二甲双胍体系中，二甲双胍相对于 TGF-β1的RMSD很小，与TGF-β1或二甲双胍分子本身的结构RMSD接近。这提示 二甲双胍可以较稳定的与蛋白结合在一起，这很大程度上是由于配体与结合位点的形 状匹配程度较好。而由图6B可看出在TbRII:二甲双胍体系中，二甲双胍相对于 TGF-β1的RMSD明显大于TbRII或二甲双胍分子本身的结构RMSD。这提示二甲双 胍与TbRII的结合很不稳定。再请参见图7所示二甲双胍（metformin）与TGF-β1相 互作用，虚线代表氢键，实线代表疏水作用，二甲双胍的两个甲基主要与结合口袋底 部的PHE24、ILE33的疏水侧链发生相互作用，而极性的N原子可以与ARG25侧链 的NE-HE和NH2-HH21形成氢键。

MM/PBSA计算结合自由能

ΔG_bind=ΔG_vacum+ΔG_sol

其中：ΔG_vacum=ΔE_MM–TΔS

ΔE_MM=ΔE_inte+ΔE_coul+ΔE_vdw

ΔG_sol=ΔG_PB+ΔG_SAS

ΔG_SAS=λΔSAS+βλ=2.2kJ/(mol.nm²)β=3.84kJ/mol

结合过程中自由能的变化分为配体和受体直接的相互作用能（ΔE_MM），包含分 子内能（即分子自身的相互作用能ΔE_inte），库伦相互作用（ΔE_coul），范德华（ΔE_vdw）； 结合过程中熵的变化（–TΔS），这两项并不需要考虑溶剂效应，可归纳为ΔG_vacum。 而结合过程中的溶剂效应包含非极性溶剂化自由能（ΔG_SAS），正比于溶剂可及面积 的差值（即：ΔSAS）；以及极性部分的溶剂化自由能（ΔG_PB）。

在计算过程中，分子内能的变化为零，ΔE_inte=0。ΔE_coul=-90.76kJ/mol；ΔE_vdw=-61.66kJ/mol；ΔSAS=-2.92nm²；ΔG_SAS=-2.58kJ/mol；-TΔS=-63.67。

溶剂化能中的极性项由APBS1.4软件计算：ΔG_PB=22.83kJ/mol

最后得到结合自由能为ΔG_bind=-68.50kJ/mol。

结论：本实施例通过分子对接和分子动力学模拟手段探讨了TGF-β和TβRII上 二甲双胍可能的结合位点。认为有较大的可能是二甲双胍通过结合TGF-β1抑制 TGF-β信号通路，其结合位点位于在TGF-β参与结合TβRII的关键氨基酸Arg25附 近。具体相互作用方式包括二甲双胍的两个甲基主要与结合口袋底部的PHE24、ILE33 的侧链发生相互疏水作用，和极性的N原子与ARG25侧链的NE-HE和NH2-HH21 形成氢键作用。本实施例同时采用MM/PBSA法估算二甲双胍与TGF-β1蛋白的结合 自由能约为-68.50kJ/mol。

实施例5、蛋白质印迹法验证二甲双胍通过与TGF-β1而非TβRII结合阻断TGF-β 下游Smad信号通路

小鼠胚胎成纤维细胞系3T3细胞种于6孔板，分为两组。一组细胞给予不同浓度 的二甲双胍预处理2小时后再给予TGF-β15ng/mL刺激细胞30分钟。另一组细胞的 处理则是：将不同浓度的二甲双胍与TGF-β1在试管中预混于细胞培养液中，然后放 入细胞培养箱2小时，再将混合培养液加入另一组细胞中刺激30分钟。收样时，冷 PBS洗细胞二次，加入80μl细胞裂解液（20mmol/LTris-HClPH7.4,150mmol/L NaCl,2.5mmol/LEDTA,50mmol/LNaF,0.1mmol/LNa4P2O7,1mmol/LNa3VO4,1% TritonX-100,10%glycerol,0.1%SDS,1%deoxycholicacid,1mmol/LPMSF,and1 mg/mlaprotinin）裂解细胞10分钟，用细胞刮刮下并移入Ep管中，超声处理后于4 ℃，12,000g离心15min。收上清，蛋白定量后加入5×SDS凝胶加样缓冲液，100 ℃煮沸5min后冻存。将细胞裂解液进行蛋白质印迹法实验检测TGF-β信号通路下游 磷酸化Smad3，具体步骤包括：10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳90V2小时，硝酸纤 维素膜转膜200mA2小时；电泳转移结束后，将膜放入5%牛奶（inTBST）室温封 闭1小时；一抗（磷酸化Smad31:1000in5%BSATBST,cellsignaling）4度孵育过 夜;TBST洗膜后，二抗（1:2000in5%牛奶TBST）室温1小时，TBST洗膜后显影； 将膜置于2mL反应液（1mLA液，1mLB液，MilliporeCorporation）室温孵育2min， 缓慢轻摇，将膜上液滴滴尽后封入保鲜膜，压入X光片曝光（曝光时间视信号强弱 而定）。

结果如图8所示，第一组处理方式，二甲双胍需至少100μM才可明显抑制TGF-β1 引起的磷酸化Smad3增加；第二组处理方式，二甲双胍仅1pM便可显著抑制TGF-β1 引起的磷酸化Smad3增加。第一组处理方式是让二甲双胍与细胞上的TβRII充分接 触，第二组处理方式是让二甲双胍与TGF-β1在体外充分接触。结果提示二甲双胍通 过与TGF-β1而非TβRII结合阻断TGF-β信号通路。

综上所述，二甲双胍可作为TGF-β受体拮抗剂，与TGF-β结合，阻止TGF-β1 与其受体的结合，从而有效地切断下游信号通路。

实施例6、二甲双胍减轻高血压疾病模型小鼠的心脏纤维化实验

10周龄雄性C57BL6小鼠，采用血管紧张素II（3mg/kg*dayX7天）皮下埋泵方法 制备高血压疾病模型。埋泵前3天开始每天皮下注射盐酸二甲双胍（200mg/kg体重） 至埋泵后1周。采用组织切片的方法评价心脏纤维化情况。结果如图9所示，与对照组 相比,血管紧张素II明显促进心脏纤维化（纤维化面积百分比：1.99±0.846vs.12.60± 1.97%，P<0.05）,盐酸二甲双胍对心脏纤维化无明显影响（纤维化面积百分比：1.99 ±0.846vs.2.31±0.51%），二甲双胍抑制血管紧张素II引起的心脏纤维化（纤维化面 积百分比：12.60±1.97%vs.7.26±1.30%，P<0.05），因此应用二甲双胍可以减轻高 血压疾病模型小鼠的心脏纤维化。

在其它与TGF-β相关的疾病模型中，也可应用二甲双胍治疗抑制TGF-β的作用。