具有肥胖症的预防和治疗作用的化合物的筛选方法

摘要

【问题】提供具有抗肥胖作用的物质的筛选方法和抗肥胖药。【解决方法】一种筛选方法，其包含下述工序：使被验物质与滑膜蛋白基因表达细胞接触的工序，和确认由上述被验物质产生的对滑膜蛋白基因表达的影响或对滑膜蛋白的蛋白活性的影响的工序。抗肥胖作用的例子是脂肪组织量减少作用或脂肪细胞分化诱导抑制作用。一种抗肥胖药，其包含滑膜蛋白的siRNA、滑膜蛋白的诱捕核酸或滑膜蛋白的反义核酸作为有效成分。

说明书

技术领域

本发明涉及筛选具有肥胖症的预防和治疗作用的化合物的方法。

背景技术

肥胖引起脂肪组织的过量蓄积，提高糖尿病、循环器官系疾病、抑郁症等各种健康上的风险(参照非专利文献1)。该问题在现代社会中产生非常大的经济和社会损失。对脂肪细胞代谢的分子机制进行了广泛研究(参照非专利文献2和3)。

滑膜蛋白是作为由来自于风湿病患者的滑膜细胞过表达的膜蛋白而发现的蛋白(参照专利文献1)。而且，通过使用了转基因动物的研究，表明了滑膜蛋白是类风湿性关节炎的发作所必须的分子。

通过蛋白结构预测系统，暗示出滑膜蛋白具有环指(RINGfinger)基序。该基序在对蛋白的泛素化发挥重要作用的E3泛素连接酶这样的酶中被大量发现。而且证明了，滑膜蛋白具有作为E3泛素连接酶的特征之一的自泛素化活性(参照专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第02/052007号发明

非专利文献

非专利文献1:Wickelgren,I.(1998).Obesity:howbigaproblem？Science280,1364-1367.

非专利文献2:Lefterova,M.I.,andLazar,M.A.(2009).Newdevelopmentsinadipogenesis.TrendsEndocrinolMetab20,107-114.

非专利文献3:Rosen,E.D.,andMacDougald,O.A.(2006).Adipocytedifferentiationfromtheinsideout.NatRevMolCellBiol7,885-896.

发明内容

发明所要解决的问题

人们期望开发出筛选具有肥胖症的预防和治疗作用的物质或候选化合物的方法。

用于解决问题的方法

本发明人获得了如果使用滑膜蛋白基因的条件性基因剔除小鼠或称敲除小鼠，破坏滑膜蛋白基因，则引起对象的体重减少和脂肪细胞的分化诱导抑制这样的基于实施例的见解。因此，本发明人发现，通过筛选抑制滑膜蛋白的表达、或抑制滑膜蛋白的活性的化合物，能够筛选具有脂肪细胞分化诱导调节作用、脂肪组织量调节作用和体重调节作用的化合物，从而完成了本发明。

本发明的第1方面涉及具有抗肥胖作用的物质的筛选方法。该方法包括下述工序：使被验物质与滑膜蛋白基因表达细胞接触的工序，以及确认由被验物质产生的对滑膜蛋白基因表达的影响或对滑膜蛋白的蛋白活性的影响的工序。对滑膜蛋白基因表达的影响的例子是对滑膜蛋白mRNA量的影响、对滑膜蛋白的蛋白的自泛素化的影响。所谓具有抗肥胖作用的物质的筛选方法，为寻找具有抗肥胖作用的物质的候选方法。

第1方面的优选形态是，抗肥胖作用为脂肪组织量减少作用或脂肪细胞分化诱导抑制作用。即，该形态中，可以筛选具有脂肪组织量减少作用或脂肪细胞分化诱导抑制作用的化合物。

本发明的第2方面涉及抗肥胖药。该抗肥胖药包含滑膜蛋白的siRNA、滑膜蛋白的诱捕核酸或滑膜蛋白的反义核酸作为有效成分。该抗肥胖药具有例如脂肪组织量减少作用或脂肪细胞分化诱导抑制作用。

本发明的第2方面所具有的形态是，有效成分为滑膜蛋白的siRNA的形态。滑膜蛋白的siRNA的例子为具有选自序列号2～6中的一碱基序列、与这些碱基序列互补的碱基序列、或从任一这些碱基序列取代、插入、缺失或附加了1个或2个碱基的碱基序列的RNA。具有序列号2～4所示的碱基序列的RNA为滑膜蛋白的siRNA，如IzumiT，etal.,ArthritisRheum.2009；60(1):63-72.，YamasakiS,etal.,EMBOJ.2007；26(1):113-22.中使用实验而公开地那样是公知的。具有序列号5和6所示的碱基序列的RNA为滑膜蛋白的siRNA，如WO2005/074988号发明中使用实验而公开地那样是公知的。

序列号2：5’-GCUGUGACAGAUGCCAUCA-3’

序列号3：5’-GGUGUUCUUUGGGCAACUG-3’

序列号4：5’-GGUUCUGCUGUACAUGGCC-3’

序列号5：5’-CGUUCCUGGUACGCCGUCA-3’

序列号6：5’-GUUUTGGUGACUGGUGCUA-3’

“具有从任一这些碱基序列取代、插入、缺失或附加了1个或2个碱基的碱基序列的RNA”，为具有从选自序列号2～6中的一碱基序列和与这些碱基序列互补的碱基序列任一碱基序列，取代、插入、缺失或附加了1个或2个碱基的碱基序列的RNA。取代、插入、缺失或附加可以发生任1种，也可以发生2种以上。

本发明的第2方面所具有的形态是，有效成分为具有序列号7所示的碱基序列或从序列号7所示的碱基序列取代、插入、缺失或附加了1个或2个碱基的碱基序列的滑膜蛋白的诱捕核酸。具有序列号7所示的碱基序列的核酸为滑膜蛋白的诱捕核酸，例如，如TsuchimochiK,etal.,MolCellBiol.2005；25(16):7344-56.中使用实施例而显示地那样是公知的。

序列号7：5’-AUGGUGACUGGUGCUAAGA-3’

本发明的第2方面所具有的形态是，有效成分为滑膜蛋白的反义核酸。

发明的效果

通过本发明，可以提供具有肥胖症的预防和治疗作用的化合物的筛选方法。

附图说明

图1A是滑膜蛋白条件性基因剔除小鼠(syvn1cKO)的制作所使用的基因标靶载体的设计图。外显子表示黑色的箱，黑色箭头表示新霉素(Neo)，白底箭头表示白喉毒素基因亚基A。白底三角形表示loxP部位，黑圆点表示FRT部位。通过在内源性滑膜蛋白基因座与标靶载体之间进行同源基因重组，可获得与外显子2～12的上游和下游相邻地导入了loxP，进一步与新霉素盒的上游和下游相邻地导入了FRT的染色体。“FloxAllele”中，显示除去新霉素后的、导入了loxP的等位基因。缺损等位基因表示通过他莫昔芬(Tam)被诱导的、经由Cre重组酶而被除去的物质。

图1B是将他莫昔芬处理后的来自于(CAG)-Cre-ER；syvn1^+/+小鼠、(CAG)-Cre-ER；syvn1^flox/+小鼠和(CAG)-Cre-ER；syvn1^flox/flox小鼠的基因组DNA进行了PCR解析而得的照片。野生型等位基因作为70bp的片段(下侧的谱带)被检测到，目的等位基因作为100bp的片段(上侧的谱带)被检测到。

图1C是将他莫昔芬处理后的来自于syvn1^flox/flox小鼠(syvn1WT)和(CAG)-Cre-ER；syvn1^flox/flox小鼠(syvn1cKO)的脂肪细胞进行了实时PCR解析而得的图。

图1D是来自于syvn1WTmice和syvn1cKOmice的尾部蛋白的、使用了抗滑膜蛋白抗体的蛋白印迹。

图1E是表示新生后的滑膜蛋白条件性基因剔除小鼠的生存比例的图。

图2A是表示新生后的滑膜蛋白条件性基因剔除小鼠的体重变化的图。

图2B是表示滑膜蛋白基因剔除小鼠(雄和雌)的食物摄取量的图。

图2C是表示新生后的滑膜蛋白条件性基因剔除小鼠的皮下脂肪的状态的照片。白色箭头表示皮下脂肪。

图2D是表示syvn1WT(左侧)和syvn1cKO(右侧)的附睾脂肪组织的照片。

图2E是表示新生后的滑膜蛋白条件性基因剔除小鼠的内脏脂肪的脂肪滴的状态的显微镜照片。黑色箭头表示脂肪滴。倍率是400倍。

图2F是表示新生后的滑膜蛋白条件性基因剔除小鼠的附睾(上图)和皮下脂肪(下图)的脂肪滴的状态的显微镜照片。黑色箭头表示脂肪滴。倍率为400倍。

图3A是表示syvn1cKO:ob/ob小鼠中的由新生后的滑膜蛋白基因剔除引起的体重变化的图。

图3B是表示syvn1cKO:ob/ob小鼠中的由新生后的滑膜蛋白基因剔除引起的皮下脂肪的状态的照片。黑箭头表示皮下脂肪。

图3C是表示syvn1cKO:db/db小鼠中的由新生后的滑膜蛋白基因剔除引起的体重变化的图。

图3D是表示syvn1cKO:db/db小鼠中的由新生后的滑膜蛋白基因剔除引起的皮下脂肪的状态的照片。黑箭头表示皮下脂肪。

图4是表示滑膜蛋白基因抑制对3T3-L1细胞株的脂肪细胞分化诱导的影响的照片。○：分化了的脂肪细胞，□：非正常脂肪细胞的脂肪滴。

图5A是表示可以制作脂肪特异性滑膜蛋白基因剔除小鼠的PCR的结果。通过以常规方法的凝胶电泳分离出从aP2-Cre；Syvn1^flox/flox(脂肪特异性基因剔除)小鼠和Syvn1^flox/flox小鼠(对照)的WAT和BAT所离析出的基因组DNA进行了扩增的PCR产物。

图5B是表示脂肪特异性滑膜蛋白基因剔除小鼠的生存率的图。是进行了aP2-Cre；Syvn1^flox/flox小鼠和对照小鼠(Syvn1^flox/flox和Syvn1^flox/+小鼠)生存分析而得的图，Kaplan-Meier曲线表示相对于日龄的生存率。

图5C是表示脂肪特异性滑膜蛋白基因剔除小鼠的体重变化的图。从出生后第3天开始测定体重。AdiposeKO：aP2-Cre；Syvn1^flox/flox(脂肪特异性基因剔除)小鼠。Contorol：Syvn1^flox/flox和Syvn1^flox/+小鼠。Adiposeheterozygous：aP2-Cre；Syvn1^flox/+小鼠。结果以平均±SD表示。*P<0.01：aP2-Cre；Syvn1^flox/flox小鼠与其它小鼠的比较通过ANOVA的posthoc检验(Tukey-Kramer法)来进行。

图5D是出生后第19天的对照小鼠与aP2-Cre；Syvn1^flox/flox(脂肪特异性基因剔除)小鼠的照片。

图5E是图5D的小鼠的腹部的皮下脂肪照片。白色箭头表示皮下脂肪。

图5F是图5D的小鼠的附睾照片。

图5G是图5D的小鼠的背部的皮下脂肪照片。aP2-Cre；Syvn1^flox/flox小鼠的WAT的减少(BAT不减少)。

图5H是出生后第18天的对照小鼠(左)和aP2-Cre；Syvn1^flox/flox小鼠(右)的脂肪组织的显微镜照片。倍率：400倍。scalebar：50μm。黑箭头：脂肪滴。

图6A是表示LS-102处理对体重变化率的影响的图。每天进行对C57BL/6J小鼠腹腔内注射DMSO或50mg/kgLS-102的处理，测定体重。结果以平均值±SD表示。*P<0.05：C57BL/6JDMSO处理小鼠与C57BL/6JLS-102处理小鼠的比较通过Student’st检验来进行。

图6B为表示LS-102处理对食物摄取的影响的图。测定一天的食物摄取的平均值。结果以平均值±SD表示，进行Student’st检验。

图6C是表示通过LS-102处理而附睾的脂肪量减少的照片和图。是用DMSO(左)或50mg/kgLS-102(右)处理了57天的C57BL/6J小鼠的附睾的脂肪组织。结果以平均值±SD表示，进行了Student’st检验(n＝4)。

图6D为表示通过LS-102处理而脂肪滴减少的照片。将用DMSO(左)和50mg/kgLS-102(右)进行了处理的C57BL/6J小鼠的附睾的脂肪组织用HE进行了染色。倍率：400倍。scalebar：50μm。黑色箭头：脂肪滴。

图7是表示观察syvn1WT(WT)、syvn1cKO(KO)、ob/+小鼠、ob/ob小鼠的皮下脂肪白色脂肪组织中的滑膜蛋白的蛋白的表达量而得的蛋白印迹(左图)，及基于图像解析的表达量程度的图(右图)。

具体实施方式

本发明的第1方面涉及具有抗肥胖作用的物质的筛选方法。该方法包括下述工序：使被验物质与滑膜蛋白基因表达细胞接触的工序，以及确认由被验物质产生的对滑膜蛋白基因表达的影响或对滑膜蛋白的蛋白活性的影响的工序。所谓具有抗肥胖作用的物质的筛选方法，是寻找具有抗肥胖作用的物质的候选方法。

抗肥胖作用之一是体重调节作用。所谓体重调节作用，是指在处置前后，使体重以显著性差异变化。体重调节作用通过例如脂肪组织量调节、脂肪细胞分化诱导调节而作用。

人的滑膜蛋白基因的公共基因数据库Genbank中的登录号为AB024690(序列号1)。

将编码人中的滑膜蛋白的基因的碱基序列示于序列号1。此外即使是由该碱基序列编码的蛋白以外的蛋白，也与其具有高同源性(通常为70％以上，优选为80％以上，更优选为90％以上，最优选为95％以上)，并且，具有滑膜蛋白的蛋白所具有的功能的蛋白包含在本发明的滑膜蛋白中。

本发明中的“滑膜蛋白基因”中，例如，包含与包含序列号1所记载的碱基序列的DNA对应的其它生物中的内源性基因(人的滑膜蛋白基因的同源物等)。

此外，与包含序列号1所记载的碱基序列的DNA对应的其它生物的内源性的DNA，一般而言，与序列号1所记载的DNA具有高同源性。所谓高同源性，是指为50％以上，优选为70％以上，进一步优选为80％以上，更优选为90％以上(例如，为95％以上，进一步为96％、97％、98％或99％以上)的同源性。该同源性可以通过mBLAST算法(Altschuletal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-8；KarlinandAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-7)来确定。此外，该DNA在从生物体内离析的情况下，可以认为与序列号1所记载的DNA在严格条件下进行杂合。这里作为“严格条件”，可以举出例如“2×SSC，0.1％SDS，50℃”、“2×SSC，0.1％SDS，42℃”、“1×SSC，0.1％SDS，37℃”，作为更严格的条件，可以举出“2×SSC，0.1％SDS，65℃”、“0.5×SSC，0.1％SDS，42℃”和“0.2×SSC，0.1％SDS，65℃”的条件。对于本领域技术人员而言，能够基于滑膜蛋白基因的碱基序列来适当取得与其它生物中的滑膜蛋白基因相当的内源性基因。另外，在本说明书中，有时将与人以外的生物中的滑膜蛋白的蛋白(基因)相当的蛋白(基因)、或与上述滑膜蛋白在功能上同等的蛋白(基因)简单记载为“滑膜蛋白的蛋白(基因)”。

本发明的“滑膜蛋白”，除了天然的蛋白以外，可以作为利用了基因重组技术的重组蛋白而调制。天然的蛋白能够通过例如对被认为滑膜蛋白的蛋白表达了的细胞(组织)的提取液，使用使用了针对滑膜蛋白的蛋白的抗体的亲和色谱的方法来调制。另一方面，重组蛋白能够通过将用编码滑膜蛋白的蛋白的DNA进行了转化的细胞进行培养来调制。本发明的“滑膜蛋白的蛋白”，例如，在后述的筛选方法中适合使用。

在本发明中所谓“表达”，包含从基因的“转录”或向多肽的“翻译”和蛋白的“分解抑制”所产生的表达。所谓“滑膜蛋白的蛋白的表达”，是指发生编码滑膜蛋白的蛋白的基因的转录和翻译，或通过这些转录·翻译而生成滑膜蛋白的蛋白。

上述各种功能，对于本领域技术人员而言，能够使用一般的技术适当评价(测定)。具体而言，可以实施后述实施例所记载的方法或适当改变该方法来实施。

因此，所谓“抑制滑膜蛋白的蛋白的表达和/或功能”，是指与野生型滑膜蛋白基因或蛋白的量、功能或活性相比，使其量、功能或活性降低或消失。上述“抑制”中，包含抑制功能和表达两者、和抑制任何一方中的任一种。

泛素化，具体而言，是指通过泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)等酶反复进行协同级联反应，使泛素分子枝状地结合于成为基质的蛋白而形成聚泛素链的过程。该聚泛素链经由泛素分子内的第48号的赖氨酸残基的ε‐氨基而形成，成为对26S蛋白酶体的分解信号，引导目的蛋白分解。

确认由被验物质产生的对滑膜蛋白基因表达的影响或对滑膜蛋白的蛋白活性的影响的方法，只要适当使用例如国际公开WO2006-137514号发明所公开的方法即可。

由被验物质产生的对滑膜蛋白基因表达的影响

使被检化合物与表达滑膜蛋白基因的细胞接触。此时使用的“细胞”的例子是来自于人、小鼠或大鼠的细胞。也能够利用以表达滑膜蛋白的方式转化了的大肠杆菌、酵母等微生物的细胞。“表达滑膜蛋白基因的细胞”的例子，可以利用表达内源性滑膜蛋白基因的细胞、或导入外源性滑膜蛋白基因且该基因表达了的细胞。外源性滑膜蛋白基因表达了的细胞通常可以通过将插入有滑膜蛋白基因的表达载体向宿主细胞导入来制作。该表达载体可以通过一般的基因工程技术来制作。

作为本方法所用的被检化合物，没有特别限制，可举出例如，天然化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白、肽等单一化合物、以及化合物文库、基因文库的表达产物、细胞提取物、细胞培养上清液、发酵微生物产生物、海洋生物提取物、植物提取物等。

被检化合物对表达滑膜蛋白基因的细胞的“接触”，通常通过在表达滑膜蛋白基因的细胞的培养液中附加被检化合物来进行，但不限定于该方法。在被检化合物为蛋白等的情况下，可以通过将表达该蛋白的DNA载体向该细胞导入来进行上述“接触”。

在本方法中接下来测定滑膜蛋白基因的表达量。这里“基因的表达”中，包含转录和翻译两者。基因的表达量的测定可以由本领域技术人员通过公知的方法来进行。

例如，可以按照通用方法从表达滑膜蛋白基因的细胞提取mRNA，通过实施以该mRNA作为模板的Northern杂合法、RT-PCR法、DNA阵列法等来进行该基因的转录量的测定。此外，也可以从表达滑膜蛋白基因的细胞回收蛋白级分，用SDS-PAGE等电泳法检测出滑膜蛋白的蛋白的表达，来进行基因的翻译量的测定。进一步，使用针对滑膜蛋白的蛋白的抗体，实施蛋白印迹法来检测该蛋白的表达，从而也能够进行基因的翻译量的测定。作为滑膜蛋白的蛋白的检测所用的抗体，只要是能够检测的抗体，则没有特别限制，可以利用例如单克隆抗体、或多克隆抗体两者。

在本方法中，接着，选择与不使被检化合物接触的情况(对照)相比，使该表达量降低的化合物。降低的化合物成为用于抗肥胖的药剂。

进一步选择与不使被检化合物接触的情况(对照)相比，使该蛋白的活性降低(抑制)的化合物。降低(抑制)的化合物成为用于癌治疗的药剂。对滑膜蛋白的蛋白活性的影响的例子是对滑膜蛋白的蛋白的自泛素化的影响。

对滑膜蛋白的蛋白的自泛素化的影响

例如，日本特开2008-74753号公报(日本专利第5008932号)中公开了，石苁蓉萘醌(2-甲基-5-羟基-1,4-萘醌)和槲皮素(2-(3,4-二羟基苯基)-3,5,7-三羟基-4H-1-苯并吡喃并-4-酮)抑制滑膜蛋白的蛋白的自泛素化。所谓滑膜蛋白的自泛素化，如日本特开2008-74753号公报所公开地那样，是指通过滑膜蛋白彼此的相互作用而产生的蛋白的泛素化。蛋白的泛素化通过对蛋白结合滑膜蛋白而产生。

对滑膜蛋白的蛋白的自泛素化的影响只要使用日本特开2008-74753号公报(日本专利第5008932号)所公开的方法来确认即可。例如，将被验物质附加到MBP-Syvn1ΔTM-His的体外自泛素化反应液中，在37℃进行30分钟反应。反应后，通过使用了抗HA抗体的蛋白印迹法来检测泛素化蛋白。MBP-Syvn1ΔTM-His是指在N末端侧融合了麦芽糖结合蛋白(MBP)、在C末端侧融合了His标签的跨膜区缺损了的滑膜蛋白。

第1方面的优选形态是，抗肥胖作用为脂肪组织量减少作用或脂肪细胞分化诱导抑制作用。即，该形态中，可以筛选具有脂肪组织量减少作用或脂肪细胞分化诱导抑制作用的化合物。

本发明的第2方面涉及抗肥胖药。该抗肥胖药包含滑膜蛋白的siRNA、滑膜蛋白的诱捕核酸或滑膜蛋白的反义核酸作为有效成分。该抗肥胖药具有例如脂肪组织量减少作用或脂肪细胞分化诱导抑制作用。

本发明的第2方面所具有的形态是，有效成分为滑膜蛋白的siRNA。具有由RNAi效果引起的抑制作用的核酸，一般也被称为siRNA或shRNA。关于RNAi，通过将由包含与标的基因的mRNA相同序列的正义RNA和包含与其互补的序列的反义RNA形成的短链双链RNA(以下，简称为“dsRNA”)导入到细胞等中，从而与标的基因mRNA特异性并且选择性结合而诱导破坏，为通过剪切该标的基因来高效率地抑制(抑制)标的基因表达的现象。例如，如果将dsRNA导入细胞内，则与该RNA相同序列的基因的表达被抑制(knockdown)。这样RNAi由于能够抑制标的基因的表达，因此作为代替以往复杂而效率低的采用同源重组的基因破坏方法的简易基因剔除方法、或作为能够应用于基因治疗的方法而受到注目。RNAi所用的RNA不需要与滑膜蛋白基因或该基因的部分区一定完全相同，但优选具有完全的同源性。

siRNA的设计可以如下进行。

(a)只要是编码滑膜蛋白的基因，则没有特别限定，能够将任意区作为全部靶。例如，在人的情况下，可以候选GenBank登录号AB024690(序列号1)的任意区。

(b)从选择出的区选择以AA开始的序列，该序列的长度为19～25碱基，优选为19～21碱基。可以选择该序列的GC含量例如成为40～60％的序列。

(a)使被检化合物与表达滑膜蛋白基因的细胞接触的工序

(b)测定上述细胞中的滑膜蛋白基因的表达量的工序

(c)选择与不存在被检化合物的条件下测定的情况相比，使表达量降低的化合物的工序

滑膜蛋白的siRNA的例子是具有选自序列号2～6中的一碱基序列、与这些碱基序列互补的碱基序列、或从任一这些碱基序列取代、插入、缺失或附加了1个或2个碱基的碱基序列的RNA。具有序列号2～4所示的碱基序列的RNA为滑膜蛋白的siRNA，如IzumiT,etal.,ArthritisRheum.2009；60(1):63-72.，EMBO，YamasakiS,etal.,EMBOJ.2007；26(1):113-22.中使用实验而公开地那样是公知的。具有序列号5和6所示的碱基序列的RNA是滑膜蛋白的siRNA，如WO2005/074988号发明中使用实验而公开地那样是公知的。

序列号2：5’-GCUGUGACAGAUGCCAUCA-3’

序列号3：5’-GGUGUUCUUUGGGCAACUG-3’

序列号4：5’-GGUUCUGCUGUACAUGGCC-3’

序列号5：5’-CGUUCCUGGUACGCCGUCA-3’

序列号6：5’-GUUUTGGUGACUGGUGCUA-3’

“具有从任一这些碱基序列取代、插入、缺失或附加了1个或2个碱基的碱基序列的RNA”，为具有从选自序列号2～6中的一碱基序列和与这些碱基序列互补的碱基序列任一碱基序列取代、插入、缺失或附加了1个或2个碱基的碱基序列的RNA。取代、插入、缺失或附加可以发生任一1种，也可以发生2种以上。

例如，在国际公开WO2005-018675号发明、WO2005/074988号发明中公开了，针对编码滑膜蛋白的基因的siRNA和针对编码滑膜蛋白的基因的siRNA的筛选方法和评价方法。在本发明中，也可以适当使用该公报所公开的方法，评价针对编码滑膜蛋白的基因的siRNA。

本发明的第2方面所具有的形态是，有效成分为具有从序列号7所示的碱基序列或序列号7所示的碱基序列取代、插入、缺失或附加了1个或2个碱基的碱基序列的滑膜蛋白的诱捕核酸。具有序列号7所示的碱基序列的核酸为滑膜蛋白的诱捕核酸，例如，如TsuchimochiK,etal.,MolCellBiol.2005；25(16):7344-56.中使用实施例而显示地那样是公知的。

序列号7：5’-AUGGUGACUGGUGCUAAGA-3’

此外，滑膜蛋白的诱捕核酸及其确认方法，如例如国际公开WO2005-093067号发明和国际公开WO2005-074988号发明所公开地那样是公知的。

本发明的第2方面所具有的形态是，有效成分为滑膜蛋白的反义核酸。筛选滑膜蛋白的反义核酸和滑膜蛋白的反义核酸的方法，例如，在日本特开2009-155204号公报、日本再表2006-137514号和日本再表2005-074988号中公开了。所谓滑膜蛋白的反义核酸，是指具有与滑膜蛋白基因互补的序列，通过与该基因杂合可以抑制滑膜蛋白基因的表达的核酸。反义核酸可以通过合成化学的方法等来调制与编码滑膜蛋白的基因的部分碱基序列互补的核酸化合物。为了评价该核酸化合物是否有效率地抑制滑膜蛋白的产生，只要进行以基因的表达量作为指标的筛选试验即可。作为上述反义核酸化合物，可以将例如滑膜蛋白的表达与对照相比抑制到至少50％以下。

作为抑制特定内源性基因的表达的方法，利用反义技术的方法对本领域技术人员而言是众所周知的。作为反义核酸抑制标的基因表达的作用，存在以下那样的多个因素。即，由三链形成引起的转录起始抑制、由与通过RNA聚合酶而局部制作开状Loop结构的部位的杂合形成引起的转录抑制、由与合成正在进行的RNA的杂合形成引起的转录抑制、由内含子与外显子的接合点的杂合形成引起的剪接抑制、由与剪接体形成部位的杂合形成引起的剪接抑制、由与mRNA的杂合形成引起的从核向细胞质的移动抑制、由与加帽部位、聚(A)加成部位的杂合形成引起的剪接抑制、由与翻译起始因子结合部位的杂合形成引起的翻译起始抑制、由与起始密码子附近的核糖体结合部位的杂合形成引起的翻译抑制、由与mRNA的密码子、多核糖体结合部位的杂合形成引起的肽链的伸长抑制、和由与核酸和蛋白的相互作用部位的杂合形成引起的基因表达抑制等。这样反义核酸通过抑制转录、剪接或翻译等各种过程来抑制标的基因的表达(平岛和井上，新生化学实验讲座2核酸IV基因的复制和表达,日本生化学会编,东京化学同人,1993,319-347.)。

本发明中使用的反义核酸可以通过上述的任一作用来抑制滑膜蛋白基因的表达和/或功能。作为一个形态，只要设计与滑膜蛋白基因的mRNA的5'端附近的非密码子互补的反义序列，则可以认为对基因的翻译抑制有效果。此外，也可以使用与编码区或3'侧的非密码子互补的序列。这样，不仅包含滑膜蛋白基因的密码子，而且包含非密码子的序列的反义序列的核酸也包含在本发明中利用的反义核酸中。使用的反义核酸与适当的启动子的下游连接，优选在3'侧连接包含转录终止信号的序列。这样调制的核酸可以通过使用公知的方法来转化为所希望的动物(细胞)。反义核酸的序列优选为与进行转化的动物(细胞)所具有的内源性滑膜蛋白基因或其一部分互补的序列，但只要可以有效地抑制基因的表达，则可以不是完全地互补。转录后的RNA对标的基因的转录产物优选具有90％以上，最优选为95％以上的互补性。为了使用反义核酸有效果地抑制标的基因(滑膜蛋白)的表达，反义核酸的长度优选为至少15碱基以上且小于25碱基，但本发明的反义核酸不一定限定于该长度，可以为例如100碱基以上、或500碱基以上。

此外，滑膜蛋白基因的表达的抑制也能够利用核酶、或编码核酶的DNA来进行。所谓核酶，是指具有催化活性的RNA分子。核酶中存在具有各种活性的核酶，通过将焦点放在其中作为剪切RNA的酶的核酶的研究，能够设计部位特异性剪切RNA的核酶。核酶中，也有如I型内含子、RNaseP所包含的M1RNA那样为400核苷酸以上大小的核酶，也有被称为锤头型、发夹型的具有40核苷酸左右的活性结构域的核酶(小泉诚和大冢荣子,蛋白核酸酶,1990,35,2191.)。

显示出例如，锤头型核酶的自剪切结构域虽然剪切G13U14C15这样的序列的C15的3'侧，但该活性中U14与A9的碱基对形成是重要的，代替C15而用A15或U15也能够剪切(Koizumi,M.etal.,FEBSLett,1988,228,228.)。如果设计基质结合部位与目的部位附近的RNA序列互补的核酶，则可以制作出识别目的RNA中的UC、UU或UA这样的序列的限制性酶的RNA剪切核酶(Koizumi,M.etal.,FEBSLett,1988,239,285.，小泉诚和大塚荣子,蛋白核酸酶,1990,35,2191.，Koizumi,M.etal.,NuclAcidsRes,1989,17,7059.)。

此外，发夹型核酶对本发明的目的也是有用的。该核酶在例如烟草环斑病毒的卫星RNA的负链中被发现(Buzayan,JM.,Nature,1986,323,349.)。显示出从发夹型核酶也可以制作出目的特异性的RNA剪切核酶(Kikuchi,Y.&Sasaki,N.,NuclAcidsRes,1991,19,6751.，菊池洋,化学与生物,1992,30,112.)。这样，通过使用核酶特异性剪切本发明中的滑膜蛋白基因的转录产物，可以抑制该基因的表达。

内源性基因的表达的抑制进一步也可以通过使用了与标的基因序列具有相同或类似序列的双链RNA的RNA干扰(RNAinterference，以下简称为“RNAi”)来进行。

本发明的治疗剂也能够为经口、非经口的任一种。在非经口的情况下，可举出经肺剂型(例如使用了雾化器等的剂型)、经鼻投与剂型、经皮投与剂型(例如软膏、乳膏剂)、注射剂型等。在注射剂型的情况下，可以通过例如点滴等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等来全身或局部地投与。

投与方法根据患者的年龄、症状而适当选择。有效投与量每一次每1kg体重为0.1μg～100mg，优选为1～10μg。但是，上述治疗剂不受这些投与量限制。在混合siRNA等核酸的情况下，该核酸的用量例为0.01～10μg/ml，优选为0.1～1μg/ml。

本发明的治疗剂可以按照常规方法来制剂化，可以包含药物可容许的载体、附加物。作为这样的载体和附加物，可举出水、药物可容许的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧基甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧基甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原酸胶、阿拉伯树胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、作为药物附加物被容许的表面活性剂等。

上述附加物根据本发明的治疗剂的剂型而从上述中单独或适当组合选择。例如，在作为注射用制剂使用的情况下，可以使用将精制的ER压力诱导物质溶解于溶剂(例如生理盐水、缓冲液、葡萄糖溶液等)，在其中加入Tween80、Tween20、明胶、人血清白蛋白等而得的附加物。或者，为了制成在使用前溶解的剂型，可以为进行了冷冻干燥的附加物。作为冷冻干燥用赋形剂，可以使用例如，甘露糖醇、葡萄糖等糖醇、糖类。

本发明发现，通过产生滑膜蛋白基因的剔除小鼠，由此抑制滑膜蛋白的表达或抑制滑膜蛋白的活性，对肥胖症的治疗有效。所谓滑膜蛋白基因的剔除小鼠，是指通过人为改变滑膜蛋白基因区的序列，从而其正常表达被抑制，其结果，在生物体中滑膜蛋白未正常起作用。

此外，滑膜蛋白基因可以改变或缺损一部分或全部。这里，所谓“全部”，是指从滑膜蛋白基因组DNA的外显子1的5'端到最后的外显子的3'端的区域。此外，所谓“一部分”，是指该区域的一部分，抑制滑膜蛋白基因的正常表达所需的长度的区域。进一步，所谓“改变”，是指通过使单一或多个核苷酸取代、缺失、插入和/或重排，从而将基因组DNA中的对象区域的碱基序列改变为其它碱基序列。

改变或缺损滑膜蛋白基因的一部分或全部的剔除动物可以通过公知的方法来制作。例如，如下述实施例的记载那样可以使用基因标靶法来制作。在该方法中，将滑膜蛋白基因的外显子1的至少包含起始密码子的区域通过同源重组来取代成其它碱基序列，可以抑制滑膜蛋白的正常表达。此外，本发明的筛选方法所用的剔除动物不仅包含通过该方法制作的剔除动物，而且还包含其子孙。

成为本发明的剔除动物的对象的动物为非人动物，没有特别限定。可例示例如，牛、猪、绵羊、山羊、兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠、小鼠、大鼠等哺乳动物。其中，作为实验动物使用时，优选为兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠、小鼠、大鼠，其中进一步优选为啮齿目，制造出许多近交系，如果考虑受精卵的培养、体外受精等的技术则特别优选为小鼠和大鼠。

为了构建标靶载体，离析成为对象的动物的滑膜蛋白基因的一部分。例如，在制作基因剔除小鼠的情况下，从小鼠的基因组DNA文库筛选滑膜蛋白基因。使用所得的基因组DNA克隆，构建用于同源重组的标靶载体。基因组DNA克隆不需要为基因全长，只要破坏滑膜蛋白基因，而且仅将抑制滑膜蛋白的表达所需的领域克隆化即可。此外，标靶载体可以通过公知的方法来制作，例如可以通过将市售的质粒作为主链，将上述基因组DNA克隆、正选择用的标志物和负选择用的标志物等的各片段适当连接来制作。

通过电穿孔法等将通过上述方法制作的标靶载体导入到受精卵、早期胚或胚胎干细胞(ES细胞)等具有个体形成能力(分化全能性)的细胞，然后，挑选出发生了目的的同源重组的细胞。挑选可以通过正-负选择法使用药剂来选择。选择后，通过DNA印迹、PCR法等确认发生了目的的同源重组的细胞。最终将确认到所希望的同源重组的细胞导入到从妊娠中的输卵管或子宫采集的8细胞期胚或胚泡(blastocyst)。

将上述8细胞期胚或胚泡按照常规方法移植到养亲。通过使将由养亲生出的生殖谱系嵌合动物(优选为雄性)、和以纯合子具有野生型synv1基因的野生型动物(优选为雌性)交配，从而作为第1代(F1)，可以获得相同染色体上的一方的synv1基因通过同源重组被破坏、或能够在一定条件下或部位特异性地缺失的异型合子。进一步，通过使这些异型合子彼此交配，作为第2代(F2)，可以获得相同染色体上的双方的synv1基因被破坏的、或能够在一定条件下或部位特异性地缺失的纯合子，即本发明的synv1剔除动物。纯合子的鉴定只要切断身体的一部分(例如尾巴)，提取DNA并通过DNA印迹、PCR法等研究基因型即可。

通过以下的实施例进一步具体地说明本发明，但本发明不受实施例限定。

实施例

＜制作例1：滑膜蛋白基因剔除小鼠的制作＞

将本实施例的滑膜蛋白基因剔除小鼠(syvn1cKO小鼠)的制作所使用的基因标靶载体的设计图示于图1A。图中，从上方按顺序，分别示意性示出正常的滑膜蛋白基因(Wildallele)、用于滑膜蛋白基因剔除小鼠制作的标靶载体(TargetingVector)、发生了同源重组的等位基因(Targetedallele)、导入了loxP序列的等位基因(FloxAllele)、除去了loxP-Exon2～14-loxP的等位基因(DeletedAllele)的结构。

为了构建标靶载体，使用了作为从小鼠滑膜蛋白基因的外显子1的上游到外显子16的下游的区域的14.8kb的基因区。将由FRT序列夹着的Neo抗性基因插入到外显子1与外显子2之间。此外，在外显子2的上游和外显子14的下游导入loxP序列。

将上述标靶载体导入到ES细胞。通过用PCR产物的长度来确认采用Cre处理的loxP-外显子-loxP序列的除去和采用FLP处理的FRT-新霉素-FRT的除去，从而筛选具有发生了目的的同源重组的等位基因的克隆。

如公知的方法(例如，EMBOJ16:1850-1857)那样，通过将发生了同源重组的上述ES细胞的克隆导入到小鼠胚，从而获得了嵌合小鼠。进一步，使该嵌合小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配，获得了除去了新霉素序列的小鼠。此外，并入到标靶载体的外显子-Longarm间的loxP序列，由于具有在同源重组时缺损的可能性，因此用PCR确认其存在。

使所得的新霉素除去小鼠与CAG-Cre-ER小鼠交配，获得了CAG-Cre-ER；syvn1^flox/flox小鼠。

(实施例1：新生后的滑膜蛋白基因剔除的表现型)

为了阐明新生后的滑膜蛋白的功能，通过对能够用他莫昔芬(Tam)诱导的滑膜蛋白基因剔除小鼠(CAG-Cre-ER；syvn1^flox/flox小鼠)投与他莫昔芬，来诱导loxP-外显子-loxP的除去(CAG-CreER(+)syvn1^flox/flox)。此外，作为对照，设置了C57BL/6J(溶剂对照，他莫昔芬投与)和(CAG-CreER(-)syvn1^flox/flox)(溶剂对照，他莫昔芬投与)的各组。

具体而言，在出生后7-8周后，在C57BL/6J小鼠、缺少Cre导入基因的纯合型的syvn1^flox/flox小鼠(syvn1WT)和CAG-Cre-ER；syvn1^flox/flox小鼠(syvn1cKO)的腹腔内，每一天投与125mg/kg的他莫昔芬溶液连续投与5天。通过他莫昔芬投与来剔除滑膜蛋白，这通过基因组上的滑膜蛋白的PCR、滑膜蛋白mRNA的实时PCR和滑膜蛋白的蛋白的蛋白印迹而确认了(图1B～D)。syvn1^flox/flox小鼠为对照。

制成显示他莫昔芬投与后的C57BL/6J小鼠(n＝3)、syvn1WT小鼠(n＝10)和syvn1cKO小鼠(n＝10)的相对于日龄的生存比例的Kaplan-Meier曲线。将结果示于图1E。

syvn1cKO小鼠无法生存，Tam投与后到21天后为止全部死亡。另一方面，C57BL/6J小鼠和syvn1WT小鼠生存(图1E)。

(实施例2-1：由滑膜蛋白基因剔除引起的体重变化)

在出生后7-8周后，在C57BL/6J小鼠、纯合型的syvn1^flox/flox小鼠(syvn1WT)和CAG-Cre；syvn1^flox/flox小鼠(syvn1cKO)的腹腔内，每一天投与125mg/kg的他莫昔芬(Tam)溶液或作为对照的溶剂连续投与5天。将结果示于图2A。

根据图2A，在syvn1cKO小鼠的组中，在Tam投与后1周观察到体重的显著减少，确认了syvn1WT小鼠组的体重到大约一半为止的饲养天数依存性的体重减少。另一方面，在任一对照组中，都未确认到体重的减少。

为了研究syvn1cKO小鼠在吸收阶段是否具有摄食障碍和/或营养障碍，因此进行了下面三个试验。

(实施例2-2：由滑膜蛋白基因剔除引起的对食物摄取量的影响)

为了研究上述syvn1cKO小鼠的体重减少是否由食物摄取的减少引起，测定每天的食物摄取量。在图2B中，显示在他莫昔芬处理后1天后和11天后每一天的平均食物摄取量。

从图2B可知，在syvn1cKO小鼠与对照小鼠中食物摄取量没有差异。根据该结果，暗示出syvn1cKO小鼠的体重减少不是由摄食障碍或仅是单纯四肢无力所引起。

(实施例2-3：由滑膜蛋白基因剔除引起的对营养、肝脏和肾脏功能的影响)

进一步，通过血清的生物化学实验，对包含总蛋白、白蛋白、血糖、甘油三酯、总胆固醇、AST、ALT、BUN和Cr在内的营养、肝脏和肾脏功能的若干生物标志物进行了研究。结果，如下述表1所示，在二个组中没有显著变化。

[表1]

(实施例2-4：由滑膜蛋白基因剔除引起的对脂肪组织的影响)

接下来，在syvn1cKO小鼠中进行了肉眼和显微镜下的脂肪组织的解析。对他莫昔芬投与后16天后的syvn1WT小鼠(左侧)和syvn1cKO小鼠(右侧)实施开腹手术，进行了脂肪组织的观察。将结果示于图2C和D。

由图2C可知，在syvn1cKO小鼠的肠中有相当量的食物残渣，组织学上未见异常。此外，在syvn1cKO小鼠中，皮下脂肪减少了。

此外，由图2D可知，syvn1cKO小鼠中白色脂肪组织(WAT)显著减少了。特别是未观察到附睾的白色脂肪组织。

(实施例2-5：由滑膜蛋白基因剔除引起的对脂肪滴的影响)

为了研究由滑膜蛋白基因剔除引起的对脂肪组织内的影响，将syvn1WT小鼠和syvn1cKO小鼠的内脏脂肪组织进行苏木精·伊红染色来观察。使用在上述syvn1cKO小鼠中勉强残留的脂肪组织进行了组织学的解析。将结果示于图2E。

由图2E可知，在syvn1cKO中，脂肪滴减少了。此外，该脂肪滴的减少仅在syvn1cKO小鼠中观察到，syvn1WT小鼠中观察不到。

接下来对syvn1WT小鼠和syvn1cKO小鼠的附睾和皮下脂肪也同样地进行了观察。将该结果示于图2F。图2F是显示新生后的滑膜蛋白条件性基因剔除小鼠的附睾(上图)和皮下脂肪(下图)的脂肪滴的状态的显微镜照片。黑色箭头表示脂肪滴。倍率为400倍。

根据脂肪细胞的尺寸的增大和由前脂肪细胞的分化引起的脂肪细胞数的增加，在肥胖的进行中最初观察到的现象(Faustetal。，1978；Joetal.，2009)，以及在脂肪组织中无法蓄积过量的能量，从与胰岛素耐性或代谢性的并发症有关(TanandVidal-Puig,2008；VirtueandVidal-Puig,2008)来看，强烈暗示出由滑膜蛋白的表达抑制或功能抑制带来的抗肥胖作用。

(实施例3：ob/ob小鼠和db/db小鼠中的滑膜蛋白基因剔除的效果)

使用肥胖小鼠，验证在经常使其摄取高脂肪食物的条件下滑膜蛋白的剔除是否诱导这些小鼠的体重减少。

首先，使用作为代表性肥胖小鼠的ob/ob(瘦素基因的异常)、db/db(瘦素受体基因的异常)小鼠(都是中枢性摄食无效而过饱而作为肥胖、糖尿病、代谢综合征等的模型通用)，将这些小鼠与滑膜蛋白的条件性基因剔除小鼠交配，分别制作出ob或db基因纯合、并且滑膜蛋白基因也纯合，即完全地剔除的小鼠。作为这些小鼠的基因型，如下所述。CAG-Cre-ER；syvn1^flox/flox:ob/ob小鼠(syvn1cKO:ob/ob小鼠)，syvn1^flox/flox:ob/ob小鼠(syvn1WT:ob/ob小鼠)，CAG-Cre-ER；syvn1^flox/flox:db/db小鼠(syvn1cKO:db/db小鼠)，和syvn1^flox/flox:db/db小鼠(syvn1WT:db/db小鼠)。

作为具体的步骤，首先为了制作CAG-Cre-ER；syvn1^flox/flox:ob/ob小鼠和CAG-Cre-ER；syvn1^flox/flox:db/db小鼠，使CAG-Cre-ER；syvn1^flox/flox小鼠与ob/+和db/+小鼠交配。

通过二次交配使CAG-Cre-ER；syvn1^flox/+:ob/+小鼠交配而制作CAG-Cre-ER；syvn1^flox/flox:ob/ob小鼠(syvn1cKO:ob/ob)和syvn1^flox/flox:ob/ob小鼠(syvn1WT:ob/ob)。同样地操作，通过二次交配使CAG-Cre-ER；syvn1^flox/+:db/+小鼠交配而制作CAG-Cre-ER；syvn1^flox/flox:db/db小鼠(syvn1cKO:db/db)和syvn1^flox/flox:db/db小鼠(syvn1WT:db/db)。

在出生后7-8周后的上述小鼠(syvn1cKO:ob/ob，syvn1WT:ob/ob，syvn1cKO:db/db和syvn1WT:db/db)的腹腔内，每一天投与125mg/kg的他莫昔芬(Tam)溶液连续投与5天。每天进行他莫昔芬投与后的体重测定，求出体重变化率。将结果示于图3A和C。此外，通过解剖来观察他莫昔芬投与后第25天的syvn1WT:ob/ob小鼠和syvn1WT:db/db小鼠、和syvn1cKO:ob/ob小鼠和syvn1cKO:db/db小鼠的脂肪组织。将结果示于图3B和D。

由图3A和C可知，在他莫昔芬投与后，syvn1WT:ob/ob小鼠和syvn1WT:db/db小鼠的体重增加到约130％为止。另一方面，syvn1cKO:ob/ob小鼠和syvn1cKO:db/db小鼠的体重显著减少到试验开始时的体重的约一半为止。即，新生后的滑膜蛋白基因剔除使ob/ob小鼠和db/db小鼠的体重减少。

由图3B和D可知，与syvn1cKO:ob/ob小鼠和syvn1WT:db/db小鼠相比，显然syvn1cKO:ob/ob小鼠和syvn1cKO:db/db小鼠中脂肪的体积减少了。即，新生后的滑膜蛋白基因剔除使ob/ob小鼠和db/db小鼠的白色脂肪细胞减少。

如果一并考虑上述摄食量没有变化这样的数据(图2B)，则这些结果暗示出，对于由于中枢神经系统水平下的瘦素信号的失活化和/或高能量摄取而被诱导的肥胖，由滑膜蛋白缺失引起的体重的减少为优势耐性。即可以认为，滑膜蛋白的缺失，不是对中枢神经系统的作用，而是作用于末梢的脂肪细胞中的能量消耗。

(实施例4：由滑膜蛋白的表达抑制和泛素化活性抑制引起的对肥胖症的效果)

将作为小鼠的脂肪前体细胞的3T3-L1细胞用含有10％FBS(胎牛血清)的DMEM(达尔伯克氏变法伊格尔培养基；HighGlucose)达到汇合长满后培养3天。附加500μMIBMX(异丁基-甲基黄嘌呤)、1μM地塞米松、5μg/mL胰岛素并诱导分化。同时附加10μMLS-102(滑膜蛋白的泛素化活性抑制剂)或DMSO。培养3天后，取代成包含4μg/mL胰岛素的培养基并附加10μMLS-102或DMSO。培养3天后，取代成含有10％FBS的DMEM(高糖)并培养3天。关于siRNA，在分化诱导2天前将200pmol的siRNASyvn1770(正义链包含下述序列号2的序列)通过Lipofectamine2000导入。

序列号2：5’-GCUGUGACAGAUGCCAUCA-3’

将培养后的3T3-L1细胞用PBS(-)(从磷酸盐缓冲生理盐水溶液中除去镁和钙后的)洗涤后，用10％福尔马林固定。用PBS(-)洗涤并取代成60％异丙醇。用18mg/mL油红O(溶剂为异丙醇)进行20分钟染色，用60％异丙醇和PBS(-)洗涤并用显微镜观察。将结果示于图4。

由图4暗示出，用siRNA抑制了滑膜蛋白基因活性的细胞中，与对照相比，分化了的脂肪细胞少，分化被抑制。此外，确认到并非轮环状的正常脂肪细胞的脂肪滴。由以上的结果显示出，滑膜蛋白基因的表达抑制和滑膜蛋白的蛋白的自泛素化抑制对肥胖症的预防和治疗有效。

(实施例5：脂肪特异性地剔除了滑膜蛋白的小鼠中的脂肪减少)

为了确认滑膜蛋白基因(SYVN1)的剔除是否以白色脂肪组织为直接标的，制作脂肪特异性滑膜蛋白基因剔除小鼠(aP2-Cre；Syvn1^flox/flox小鼠：adiposeKO)。

为了制作脂肪特异性滑膜蛋白基因剔除小鼠，首先使Syvn1^flox/flox小鼠与脂肪酸结合蛋白4(aP2)-Cre小鼠(JacksonImmunoresearchLaboratories)交配而获得包含aP2-Cre-ER；Syvn1^flox/+小鼠等的复合异型合子。接下来作为二次交配，使aP2-Cre；Syvn1^flox/+小鼠与Syvn1^flox/flox小鼠交配，获得了aP2-Cre；Syvn1^flox/flox小鼠。另外，将具有Syvn1^flox/flox或Syvn1^flox/+的基因型的、缺乏Cre转移基因的小鼠称为对照小鼠。

在所得的aP2-Cre；Syvn1^flox/flox小鼠的WAT(白色脂肪组织)和BAT(褐色脂肪组织)中发生了经由Cre重组酶的Syvn1剔除通过PCR确认(图5A)。

确认aP2-Cre；Syvn1^flox/flox小鼠的生存率，结果在超过200的同窝出生中，几乎全部的aP2-Cre；Syvn1^flox/flox小鼠到出生后24日为止死亡了(图5B)。

此外，观察aP2-Cre；Syvn1^flox/flox小鼠的体重变化，结果可知，与对照小鼠(Syvn1^flox/flox和Syvn1^flox/+小鼠)和aP2-Cre；Syvn1^flox/+小鼠(Syvn1异型合子)相比，aP2-Cre；Syvn1^flox/flox小鼠中，体重基本上减半(图5C和D)。

进一步，观察aP2-Cre；Syvn1^flox/flox小鼠的脂肪组织，结果观察到WAT的显著减少(图5E和F)。另一方面，在aP2-Cre；Syvn1^flox/flox小鼠中未见BAT的减少(图5G)。

此外，为了观察aP2-Cre；Syvn1^flox/flox小鼠的组织切片，进行了苏木精·曙红(HE)染色，结果与对照小鼠相比在aP2-Cre；Syvn1^flox/flox小鼠中显示出多数的脂肪滴减少(图5H)。

这些结果暗示出，在体重调节中滑膜蛋白以WAT为直接的目的。

(实施例6：由滑膜蛋白的选择性抑制剂LS-102引起的体重增加和脂肪量减少)

迄今为止显示出LS-102为滑膜蛋白(SYVN1)的E3泛素连接酶活性的选择性抑制剂(Yagishita,N.,etal.Int.J.Mol.Med.30,1281-1286(2012).)。因此，研究了SYVN1的药理学的抑制是否改善肥胖。

首先，对C57BL/6J小鼠投与作为对照的溶剂(DMSO)或50mg/kg体重的LS-102，在约2个月中测定体重(图6A)。其结果是，用LS-102处理了的小鼠中通过食物摄取而发生的体重增加被抑制。另外，LS-102对食物摄取没有影响(图6B)。

此外，解剖用LS-102处理了的小鼠，观察附睾的WAT中的脂肪，进行了计量，结果确认到脂肪量的减少(图6C)。

进一步，观察了小鼠的组织切片，结果与对照小鼠相比进行了LS-102处理的小鼠中脂肪滴也减少了(图6D)。

由这些结果强烈暗示出，LS-102通过SYVN1的抑制而抑制肥胖。

(实施例7：作为滑膜蛋白的生物标志物的可利用性)

由实施例3可知，通过在作为肥胖小鼠的ob/ob小鼠中使滑膜蛋白基因剔除来减少体重或白色脂肪细胞。因此，接下来确认了是否可以将滑膜蛋白用作肥胖的生物标志物。准备由syvn1WT小鼠、syvn1cKO小鼠、ob/+小鼠、ob/ob小鼠的位于皮下脂肪的白色脂肪组织(WAT)获得的细胞提取液。使用抗滑膜蛋白(SYVN1)抗体和抗-beta-actin抗体(内标用)进行了蛋白印迹。将其结果示于图7。图7是显示ob/+和ob/ob小鼠的皮下脂肪白色脂肪组织中的滑膜蛋白的蛋白的表达的蛋白印迹(左图)和显示基于图像解析的表达量的程度的图(右图)。

syvn1cKO小鼠中未确认到滑膜蛋白的蛋白的表达。另一方面，ob/ob小鼠比syvn1WT小鼠在滑膜蛋白的蛋白的表达量上更增多了。由于肥胖小鼠中滑膜蛋白的表达量增加了，因此发现了可以将滑膜蛋白作为生物标志物的利用的可能性。

产业可利用性

本发明的筛选方法，通过将抑制滑膜蛋白功能作为指标，可以选择对肥胖症的预防或治疗有效的药物组合物。

此外，本发明的抗肥胖药，通过抑制滑膜蛋白的表达或滑膜蛋白的蛋白的自泛素化，可以没有摄食限制地抑制脂肪细胞的分化，调整脂肪组织量和体重，作为与以往的食欲抑制剂、消化吸收抑制剂不同的新种类的抗肥胖药是有用的。

独立文本的序列表

序列号2：合成RNA

序列号3：合成RNA

序列号4：合成RNA

序列号5：合成RNA

序列号6：合成RNA

序列号7：合成RNA。