黄等中小分子化合物对雌激素缺乏骨质疏松的预防和治疗作用的研究

摘要

研究背景：　　骨质疏松是一种全身代谢性的骨骼疾病，表现为骨量减少、骨小梁丧失、骨皮质变薄、骨的微观结构遭到破坏，从而导致骨脆性增加，骨折发生率增高[1]。目前，全球已有超过2亿人口被骨质疏松疾病所困扰。骨质疏松分为原发性和继发性两种，原发性所占比例较高，高达85％-90%，又可以分为女性绝经后由雌激素缺乏所导致的骨质疏松，以及年龄相关性的骨质疏松；而继发性骨质疏松是由一些内分泌性疾病和肝肾疾病等所导致的[2]。总体来说骨质疏松更易发生在绝经之后雌激素分泌减少的妇女[3]。骨质疏松会随着病程表现出一系列临床症状如疼痛、骨长度的减少、骨折、呼吸功能的减低等等。以往临床上常用来治疗骨质疏松的药物主要是雌激素替代物、二磷酸盐、甲状旁腺素片段、降钙素、钙制剂和维生素D，而前四种药物不同程度地存在副作用，比如引起乳腺肿瘤、骨坏死、心血管疾病等，后两种药物必须同时运用，而且药效有限[4]。因此，目前亟需一种安全、有效的骨质疏松治疗方法[5]。中医文化博大精深，人们也一直在探索尝试用中药来治疗骨质疏松，因其更强调一个整体的概念，能够调动内因，而作用于机体相关联的多个环节。已有研究表明，中药治疗骨质疏松的核心在于其中所含的天然多糖成分[6]。黄芩是一种在中国运用历史已久的传统中药，含有丰富的黄酮类化合物，研究较多的有黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等等[7]，以往关于黄芩药理的研究主要集中在抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗氧化以及心血管保护等活性上，而对于抗骨质疏松方面的相关研究较少。　　研究目的：　　在大鼠去势骨质疏松模型中，探索黄芩提取物腹腔注射能否预防骨质疏松的发生，能否减缓/逆转骨质疏松中的骨丧失，并进一步探索黄芩提取物对BMMSCs的影响　　研究方法：　　1.黄芩小分子化合物的分离提取。从干燥的黄芩根茎中依次用95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯萃取，冷冻干燥后过筛得到80目细粉。　　2.黄芩提取物中黄酮类化合物含量测定。以芦丁标准品绘制标准曲线，估算黄酮类含量的百分比。　　3.黄芩提取物稳定性测试。采用色谱分析法，将黄芩提取物溶液在80℃条件下加热，检测其在2小时内的热稳定性；将黄芩提取物溶液在3个月内的间隔时间节点加热，检测其在3个月内的加速稳定性。　　4.黄芩提取物眼及皮肤刺激性测试。以新西兰白兔为受试对象，以一定浓度的黄芩提取物的丁二醇溶液滴眼，对侧眼为自身空白对照，按照眼损害的评分标准计分后评估其眼刺激性。以一定浓度的黄芩提取物的丁二醇溶液涂抹皮肤，按皮肤刺激反应的评分标准计分后评估其皮肤刺激性。　　5.黄芩提取物毒性测试。以小鼠为受试对象，将一定剂量黄芩提取物予以灌胃。观察动物的中毒表现和死亡情况，按照经口毒性分级评价其毒性。　　6.黄芩提取物对大鼠雌激素缺乏骨质疏松的预防和治疗作用。筛选适宜的浓度后，在雌性大鼠去势骨质疏松模型中，预防组从去势后1周内开始给予腹腔注射，治疗组从去势2月后开始腹腔注射。频率为2次/周，周期共计12周，分别在第6和12周末Micro CT扫描一侧股骨，比较骨量和骨小梁数目差异，评价黄芩提取物对骨质疏松的预防和治疗作用。　　7.黄芩提取物对BMMSCs的作用。培养各组大鼠的BMMSCs,比较其增殖和分化能力的不同：向培养液中加入一定浓度黄芩提取物，检测其对BMMSCs增殖和成骨分化的影响。　　研究结果：　　1.黄芩提取物是一种黄色有特殊气味的固体粉末，可溶于丙二醇、丁二醇等有机溶剂，易溶于二甲基亚砜。　　2.黄芩提取物中黄酮类化合物含量较丰富，约为10%。　　3.黄芩提取物稳定性较好，可承受80℃高温达2h，并在3个月内相对稳定。　　4.黄芩提取物250mg/mr浓度滴眼后lh个别动物出现轻微充血，但在24h、48h和72h，未见分泌物及水肿等现象，角结膜无异常，其无眼刺激性。以25mg/ml多次涂抹皮肤刺激后，有轻微红斑，无水肿，其无皮肤刺激性。　　5.将黄芩提取物以5000mg/kg剂量灌胃之后24 h内死亡一只动物，死亡率为10%,在安全范围内；其余存活动物精神状态较好、行为无异常，且体重正常增长，表明其安全无毒性。　　6.黄芩提取物腹腔注射后，Micro CT结果显示预防和治疗组的给药动物骨量和骨小梁数目相比对照组都有所增加，但只是一定程度上减缓骨丧失、部分恢复骨量。　　7.以黄芩提取物刺激BMMSCs后MTT曲线和克隆形成率均显示其对BMMSCs的增殖有促进作用，成骨诱导后ALP染色和茜素红染色显示SGB-E刺激后ALP含量增加，矿化结节形成也较多，同时成骨相关基因表达增多，其对BMMSCs的成骨分化也有促进作用。　　研究结论：　　本研究从传统中药黄芩的根茎中通过浸提、萃取、浓缩的方法提取了黄酮含量较高的小分子化合物，将其用于预防和治疗大鼠去势所致的骨质疏松，可以一定程度减缓骨流失并部分恢复骨量，同时在体外可以促进BMMSCs的增殖和成骨分化。本实验为进一步开发黄芩的药用价值提供了一定的动物实验和细胞实验基础，并为利用黄芩开发出安全高效的预防和治疗骨质疏松的新药奠定了基础。

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前言

文献回顾

1. 骨髓间充质干细胞在治疗骨质疏松方面的作用

2. 中药在治疗骨质疏松方面的作用

3. 中药黄芩的研究现状

4.展望

第一部分黄芩小分子化合物的提取及相关稳定性、安全性、毒性的测试

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分黄芩小分子提取物对大鼠雌激素缺乏所致骨质疏松的预防和治疗作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分黄芩中的小分子提取物对骨髓间充质干细胞的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢