自噬在雌激素缺乏骨质疏松小鼠骨髓间充质干细胞分化平衡中的作用研究

摘要

骨质疏松是一种常见的骨代谢性疾病，其中因雌激素缺乏导致的骨量下降常见于绝经后妇女，称为雌激素缺乏性骨质疏松。临床表现为骨脆性增加，易发生骨折；组织学表现为骨密度降低，骨小梁数目减少，骨髓腔内脂肪增多。目前，有关雌激素缺乏所致骨质疏松的治疗以抑制破骨细胞活性，减少骨吸收为主，并没有真正恢复成骨能力，因此不能完全解决骨量下降的问题。骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs）来源于中胚层，是一类具有自我更新能力和多分化潜能的成纤维样、贴壁生长的细胞。在研究成骨异常的骨质疏松中具有重要意义。自噬（Autophagy）是细胞利用自身细胞器来源的膜结构进行组装、延长，吞噬胞浆内底物如错误折叠、衰老蛋白及受损的细胞器，再与溶酶体结合将吞噬物降解并循环再利用的过程。自噬水平受多因素的影响，包括营养缺乏、应激、激素水平变化、炎性环境等。雌激素缺乏条件下，小鼠骨髓间充质干细胞的自噬水平有何变化，自噬水平的变化是否影响其分化平衡尚不清楚。因此本实验检测了雌激素缺乏性骨质疏松小鼠中BMMSCs自噬水平的变化，并进一步探索自噬对骨髓间充质干细胞分化功能的影响。旨在进一步探索雌激素缺乏性骨质疏松症的发病机制，并为该病的治疗方法提供新的理论基础。
　　第一部分雌激素缺乏性骨质疏松小鼠骨髓间充质干细胞自噬水平的变化
　　研究目的：
　　（1）通过卵巢摘除术（Ovariectomy，OVX）和假手术（Sham）构建雌激素缺乏性骨质疏松及对照组小鼠模型。
　　（2）明确雌激素缺乏性骨质疏松小鼠的BMMSCs的自噬水平与假手术组BMMSCs的自噬水平之间是否存在差异。
　　研究方法：
　　（1）通过OVX和Sham手术构建小鼠雌激素缺乏性骨质疏松模型和对照模型，2月后使用显微计算机断层扫描术(Micro computed tomography,microCT)分析小鼠骨密度（Bone mineral density,BMD）、骨量/组织量（Bone volume/tissue volume,BV/TV）鉴定模型是否构建成功。
　　（2）全骨髓培养法分离、纯化OVX BMMSCs和Sham BMMSCs，用Western Blot检测各组Beclin1、LC3蛋白表达量；RT-PCR检测各组Beclin1、LC3 mRNA表达量；细胞免疫荧光染色检测细胞中 LC3荧光强度；透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）检测胞浆内自噬体数量。
　　研究结果：
　　（1）microCT结果表明：OVX组小鼠BMD、BV/TV明显小于Sham组小鼠。
　　（2）Western Blot结果显示：OVX BMMSCs的Beclin1、LC3蛋白表达量低于Sham BMMSCs；RT-PCR结果显示：OVX BMMSCs的Beclin1、LC3 mRNA表达量低于Sham BMMSCs；细胞免疫荧光显示：OVX BMMSCs LC3荧光强度弱于 Sham BMMSCs；TEM结果显示：OVX BMMSCs中自噬体数量少于Sham BMMSCs。
　　结论：
　　（1）通过OVX术成功构建雌激素缺乏性骨质疏松小鼠模型。
　　（2）雌激素缺乏性骨质疏松小鼠BMMSCs自噬水平较假手术组BMMSCs下降。
　　第二部分体外调节小鼠骨髓间充质干细胞自噬水平对其分化功能的影响
　　实验目的：
　　（1）探讨体外激活OVX小鼠BMMSCs自噬水平对其分化功能的影响。
　　（2）探讨体外抑制Sham小鼠BMMSCs自噬水平对其分化功能的影响。
　　实验方法：
　　（1）建立Sham BMMSCs组、OVX BMMSCs组、OVX BMMSCs经自噬激活剂雷帕霉素（Rapamycin）刺激组，即 OVX+Rapamycin组，用 Western Blot检测各组BMMSCs中成骨蛋白Runx2、Osteorix，成脂蛋白PPAR-γ的表达量。用茜素红染色检测各组BMMSCs矿化能力，用油红O染色检测各组BMMSCs脂滴形成能力。（2）建立 Sham BMMSCs组，Sham BMMSCs经自噬抑制剂3甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）刺激组，即Sham+3-MA组，实验方法和检测指标同上。
　　实验结果：
　　（1）Western Blot结果可见：OVX+Rapamycin BMMSCs成骨蛋白Runx2、Osteorix表达量高于，成脂蛋白 PPAR-γ表达量低于 OVX BMMSCs；茜素红染色表明：OVX+Rapamycin BMMSCs矿化能力强于OVX BMMSCs；油红O染色结果提示：OVX+Rapamycin BMMSCs脂滴形成能力弱于OVX BMMSC。
　　（2）Western Blot结果表明:Sham+3-MA成骨蛋白Runx2、Osteorix表达量低于，成脂蛋白PPAR-γ表达量高于Sham BMMSCs；茜素红染色表明：Sham+3-MA BMMSCs矿化能力较Sham BMMSCs低；油红O染色结果提示：Sham+3-MA BMMSCs脂滴形成能力较Sham BMMSC高。
　　实验结论：
　　（1）体外激活OVX BMMSCs自噬能够促进其成骨分化，降低其成脂分化，
　　（2）体外抑制Sham BMMSCs自噬水平会抑制其成骨分化，促进其成脂分化。以上结论说明自噬影响BMMSCs的分化平衡。
　　第三部分改变小鼠体内自噬水平对骨量及骨髓间充质干细胞分化功能的影响
　　实验目的：
　　（1）探讨提高OVX小鼠体内自噬水平对骨量及骨髓间充质干细胞分化功能的影响。
　　（2）探讨抑制Sham小鼠体内自噬水平对骨量及骨髓间充质干细胞分化功能的影响。
　　实验方法：
　　（1）建立Sham组、OVX组及OVX腹腔注射Rapamycin组（OVX+Rapamycin）小鼠，一月后用microCT检测并分析各组胫骨骨密度（BMD）、骨量/组织量（BV/TV）；用钙黄绿素标记对比各组新骨形成速率；用油红O染色对比各组骨髓腔内脂滴数量；用RT-PCR检测并对比各组骨髓组织PPAR-γmRNA表达量；用茜素红染色检测对比各组小鼠取材来源的BMMSCs的矿化能力；用油红O染色对比各组小鼠取材来源的BMMSCs脂滴形成能力。
　　（2）建立Sham组、Sham腹腔注射3-MA组（Sham+3-MA）小鼠，一月后，用上述相同实验技术检测并对比BMD、BV/TV、新骨形成速率、骨髓内PPAR-γ mRNA表达水平、两组动物取材来源的BMMSCs的矿化能力及脂滴形成能力。
　　实验结果：
　　（1）microCT结果表明：OVX+Rapamycin组小鼠胫骨BMD、BV/TV均高于OVX组小鼠；钙黄绿素标记结果说明：OVX+Rapamycin组小鼠骨形成速率高于OVX组小鼠；油红O染色结果表明：OVX+Rapamycin组小鼠髓腔内脂滴数量少于OVX组小鼠；RT-PCR检测提示：OVX+Rapamycin组小鼠骨髓组织PPAR-γ mRNA表达量低于OVX组小鼠；茜素红染色结果提示：OVX+Rapamycin组小鼠来源的BMMSCs矿化能力在成骨诱导前后均高于OVX组小鼠来源的BMMSCs；油红O染色结果表明：OVX+Rapamycin组小鼠来源的BMMSCs脂滴能力在成脂诱导前后均低于OVX组小鼠来源的BMMSCs。
　　（2）Sham+3-MA组小鼠胫骨BMD、BV/TV较Sham组小鼠低；钙黄绿素标记结果为：Sham+3-MA组小鼠骨皮质中钙黄绿素沉积线间距较Sham组小鼠间距窄；油红O染色结果表明：Sham+3-MA组小鼠髓腔内脂滴数量较 Sham组小鼠多；RT-PCR检测结果可见：Sham+3-MA组小鼠骨髓组织内PPAR-γmRNA表达量较Sham组小鼠高；茜素红染色结果提示：Sham+3-MA组小鼠来源的BMMSCs矿化能力在成骨诱导前后均低于Sham组小鼠来源的BMMSCs；油红O染色结果表明：Sham+3-MA组小鼠来源的 BMMSCs脂滴形成能力在成脂诱导前后均高于 Sham组小鼠来源的BMMSCs。
　　实验结论：
　　（1）激活 OVX小鼠全身自噬水平，能够增加骨量，减少骨髓腔内脂肪组织形成，同时BMMSCs成骨分化增强而成脂分化减弱；
　　（2）抑制Sham小鼠全身自噬水平，出现骨量减少，骨髓腔内脂肪组织形成增多，同时BMMSCs成骨分化减弱而成脂分化增强。

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前言

文献回顾

1. 骨质疏松的概述

2. 骨髓间充质干细胞

3．细胞自噬

总结

第一部分 雌激素缺乏性骨质疏松小鼠骨髓间充质干细胞自噬水平的变化

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分 体外调节小鼠骨髓间充质干细胞自噬水平对其分化功能的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第三部分 调节小鼠体内自噬水平对骨量及骨髓间充质干细胞分化功能影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢