一种检测芝麻中芝麻素酚三糖苷的样品前处理方法及检测方法

摘要

本发明公开了一种检测芝麻中芝麻素酚三糖苷的样品前处理方法，具体为：在粉碎过的芝麻样品中按料液比1g：40－60ml加入60－80%的乙醇溶液，称重计为m，然后于30－50℃超声10－20min，冷却至室温，再次称重并用60－80%的乙醇溶液补足至m，摇匀，静置，上清液经过滤后，装入进样瓶中，待测。本发明还提供了一种使用该前处理方法的检测方法。本发明方法省去了脱脂步骤，直接采用溶液萃取，操作简便，成本低，稳定性好；且该高效液相色谱仪检测方法准确、可靠，适用于芝麻中芝麻素酚三糖苷含量的测定。

说明书

技术领域

本发明属于芝麻有效成分测定技术领域，具体涉及一种检测芝麻中芝麻素酚三糖苷的样品前处理方法及检测方法。

背景技术

芝麻，原称胡麻，是世界上主要的优质油料之一，具有悠久的种植历史。我国是世界上保存芝麻种质资源最多的国家之一，现有芝麻种质资源5200余份。芝麻含有多种人体必需的营养成分，如矿物质、蛋白质、必需氨基酸、脂肪酸、碳水化合物、木酚素、生育酚、卵磷脂等，因其含有多种活性物质，而被广泛用于保健食品、医药、美容化妆品等。

芝麻木酚素是芝麻中的一种重要活性物质，不仅安全无毒，而且具有良好的营养及药用价值，近年来受到科学家们的广泛关注和赞誉。芝麻木酚素按照其溶解性可以分为两大类，即脂溶性木酚素和含有配糖体的水溶性木酚素。芝麻种子中的脂溶性木酚素主要包括芝麻素和芝麻林素，在焙炒及油脂精炼过程中，芝麻素和芝麻林素会产生转化和降解，形成细辛素、芝麻酚、芝麻林素酚及它们的同分异构体、低聚物等；木酚素类也以配糖体形式存在，为水溶性组分，芝麻种子中主要有芝麻素酚糖苷、松脂醇糖苷、芝麻林酚糖苷等，其中含量最多的为芝麻素酚三糖苷。

芝麻素酚三糖苷是芝麻中最主要的水溶性木酚素，具有一定的抗氧化性，能抑制DNA氧化损伤、消炎等。例如，芝麻素酚三糖苷在肠内微生物作用下可转化为哺乳类木脂素：肠二醇和肠内酯，它们可以预防激素类疾病；芝麻素酚三糖苷能够通过它的抗氧化性保护神经元细胞不受损伤，对于治愈氧化导致的神经元变性疾病是有效的，例如阿尔茨海默氏病。

发明内容

本发明目的在于提供一种检测芝麻中芝麻素酚三糖苷的样品前处理方法，同时提供了一种使用该前处理方法的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测芝麻中芝麻素酚三糖苷的样品前处理方法，具体为：在粉碎过的芝麻样品中按料液比1g：40－60ml加入60－80%的乙醇溶液，称重计为m，然后于30－50℃超声10－20min，冷却至室温，再次称重并用60－80%的乙醇溶液补足至m，摇匀，静置，上清液经过滤后，装入进样瓶中，待测。

上述的样品前处理方法，优选为：在粉碎、过30目筛的芝麻样品中按料液比1g：40ml加入70%的乙醇溶液，称重计为m，然后在超声波清洗仪中于40℃超声20min，冷却至室温，再次称重并用70%的乙醇溶液补足至m，摇匀，静置，上清液用孔径0.45μm的有机滤膜过滤后，装入进样瓶中，待测。

超声处理结束后，再次称重并用乙醇溶液补足差值至m，目的在于将两次芝麻浓度控制在同一水平，以减少后续色谱测量时产生的偏差。

一种芝麻中芝麻素酚三糖苷含量的检测方法，其采用上述方法对芝麻进行前处理，然后用高效液相色谱仪采用内标法进行定量检测，检测条件具体为：

色谱柱：Sunfire-C18（250mm×4.6mm，5μm）；检测波长：290nm；柱温：30℃；进样量：10μL；以甲醇(A)和水(B)为流动相进行梯度洗脱。

以甲醇(A)和水(B)为流动相进行梯度洗脱：0min(1ml/min,A,40%)→10min(1ml/min,A,40%)→15min(0.8ml/min,A,40%)→35min(0.8ml/min,A,40%)→40min(1ml/min,A,80%)→50min(1ml/min,A,80%)→55min(1ml/min,A,40%)。

由于检测芝麻中芝麻素酚三糖苷含量的前处理采用超声波辅助，乙醇溶液萃取的方法，其提取条件受到乙醇浓度、料液比、超声温度和超声时间的影响。本发明采用四因素三水平的正交试验考察了乙醇浓度、料液比、超声温度和超声时间，表1为因素水平表，表2为正交试验结果，表3为正交试验方差分析结果。

表1提取芝麻素酚三糖苷的因素水平表

表2正交试验与结果

表3正交试验方差分析表

由极差大小可知：各因素对芝麻素酚三糖苷得率的影响主次顺序为：B＞A＞C＞D，即料液比＞乙醇浓度＞超声波温度＞超声波时间。

由方差分析可知：四个因素对芝麻素酚三糖苷得率均有显著性影响。

由正交试验均值结果可知：最佳提取工艺组合为A2B1C2D3，优化得出芝麻素提取的最佳实验条件为：乙醇浓度70%、料液比1:40g/mL、超声波温度40℃、超声波时间20min。

标准品溶液的配制：精确称取一定量的芝麻素酚三糖苷标准品，加色谱甲醇配制成184.6μg/ml的溶液，作为母液。

标准曲线的建立：吸取1mL的母液于25mL的容量瓶中，另外再分别吸取1mL、3mL、5mL、7mL、9mL的母液于10mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，稀释成浓度分别为7.38μg/mL、18.46μg/mL、55.38μg/mL、92.30μg/mL、129.22μg/mL、166.14μg/mL的标准液。将不同浓度的标准品液用孔径0.45μm的有机滤膜过滤后，进样10μL，进行检测。

以芝麻素酚三糖苷标准液的质量浓度作为横坐标、对应的峰面积作为纵坐标利用Excel软件绘制出标准曲线，得到回归方程。标准曲线为Y=6116X-1170.1；线性相关系数为R²=0.9999，线性范围：7.38μg/mL～166.14μg/mL（见图1）。表明：芝麻素酚三糖苷在7.38μg/mL～166.14μg/mL范围内定量线性关系良好。

有关物质含量计算：按照上述方法测定样品溶液，将得到的峰面积带入标准曲线中，经过换算，即可得出检测样品中芝麻素酚三糖苷的含量。

有关物质检测方法验证研究：本发明检测方法的最低检出限为0.1μg/mL，重复率RSD=1.83%（n=6），平均回收率为94.1%，标准偏差在0.5～1.2%之间。

本发明芝麻中芝麻素酚三糖苷含量的检测方法实现了目标峰与杂质峰的完全分离，且基线平稳。经验证该方法准确、可靠，适用于芝麻中芝麻素酚三糖苷含量的测定。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

为了充分了解和利用芝麻种子中的活性物质，并为充分开发利用芝麻中芝麻素酚三糖苷提供理论基础和技术支持，本发明公开了一种利用超声波辅助萃取，以乙醇溶液作为提取液的检测芝麻中芝麻素酚三糖苷含量的前处理方法，并公开了一种利用高效液相法定量分析芝麻中芝麻素酚三糖苷含量的方法。常规的前处理方法采用磁力搅拌器来促进提取液与原料的充分接触，提高提取速率，但其耗时较长；而本研究采用超声波辅助提取，具有速度快、效率高、条件温和、不损坏提取物结构等优点，萃取时间仅需20min。常规前处理方法均采用先脱脂后提取的方法，步骤繁琐，且损失率高，本研究省去了脱脂步骤，直接采用溶液萃取，操作简便，成本低，稳定性好。且该高效液相色谱仪检测方法准确、可靠，适用于芝麻中芝麻素酚三糖苷含量的测定。

附图说明

图1为芝麻素酚三糖苷的标准曲线。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1

一种检测芝麻中样品前处理方法，具体为：

1）将经过清理除去杂质的干净芝麻种子，用粉碎机粉碎，过30目筛网，取0.2008g粉碎过的芝麻装入具塞锥形瓶中，加入8mL70V%的乙醇水溶液，并称重计为m；

2）在数控超声波清洗仪于40℃超声20min，取出，冷却至室温，再次称重并用70V%的乙醇水溶液补足至m，摇匀，静置；

3）用干净的一次性针管吸取上清液，上清液经孔径0.45μm的有机滤膜过滤后，装入进样瓶中，待测。

一种芝麻中芝麻素酚三糖苷含量的检测方法，其采用上述方法对芝麻进行前处理，然后用高效液相色谱仪采用内标法进行定量检测，检测条件具体为：

色谱柱：Sunfire-C18（规格：250mm×4.6mm，5μm）；检测波长：290nm；柱温：30℃；进样量：10μL；以甲醇(A)和水(B)为流动相进行梯度洗脱：0min(1ml/min,A,40%)→10min(1ml/min,A,40%)→15min(0.8ml/min,A,40%)→35min(0.8ml/min,A,40%)→40min(1ml/min,A,80%)→50min(1ml/min,A,80%)→55min(1ml/min,A,40%)。

记录样品的峰面积，峰面积为519234。将峰面积代入标准曲线中计算芝麻素酚三糖苷的含量（mg/g），具体计算如下：

Y₁=（A+1170.1）/6116

Y（mg/g）=Y₁×V×10^-3/M

其中：A—谱图中峰面积；

V—萃取液定容后的体积（ml）；

M—取样量（g）；

Y₁—芝麻素酚三糖苷含量（μg/ml）；

Y—芝麻素酚三糖苷含量（mg/g）；

即Y₁=（519234+1170.1）/6116=85.09（μg/ml）；

Y（mg/g）=Y1*V*10^-3/M×100%=85.09*8*10^-3/0.2008=3.39（mg/g）。

实施例2

一种检测芝麻中样品前处理方法，具体为：

1）将经过清理除去杂质的干净芝麻种子，用粉碎机粉碎，过30目筛网，取0.4003g粉碎过的芝麻装入具塞锥形瓶中，加入16mL70V%的乙醇水溶液，并称重计为m；

2）在数控超声波清洗仪于40℃超声20min，取出，冷却至室温，再次称重并用70V%的乙醇水溶液补足至m，摇匀，静置；

3）用干净的一次性针管吸取上清液，上清液经孔径0.45μm的有机滤膜过滤后，装入进样瓶中，待测。

一种芝麻中芝麻素酚三糖苷含量的检测方法，其采用上述方法对芝麻进行前处理，然后用高效液相色谱仪采用内标法进行定量检测，检测条件具体为：

色谱柱：Sunfire-C18（规格：250mm×4.6mm，5μm）；检测波长：290nm；柱温：30℃；进样量：10μL；以甲醇(A)和水(B)为流动相进行梯度洗脱：0min(1ml/min,A,40%)→10min(1ml/min,A,40%)→15min(0.8ml/min,A,40%)→35min(0.8ml/min,A,40%)→40min(1ml/min,A,80%)→50min(1ml/min,A,80%)→55min(1ml/min,A,40%)。

记录样品的峰面积，峰面积为514489。将峰面积代入标准曲线中，计算得到的芝麻素酚三糖苷含量为3.37mg/g。