一种可视化检测汞离子的碳点-金纳米团簇双发射比率型荧光探针及制备方法

摘要

本发明涉及一种可视化检测汞离子的碳点-金纳米团簇双发射比率型荧光探针及制备方法；双发射复合二氧化硅纳米粒子是以包覆碳点的二氧化硅粒子为内核、其表面氨基化后共价偶联金纳米团簇所形成的复合二氧化硅纳米粒子。位于二氧化硅纳米粒子核内部的碳点作为参比荧光信号，外层的金纳米团簇作为响应荧光信号，用于Hg2+的选择性识别。作为响应荧光信号的金纳米团簇通过共价键连接的方式连接到硅层的表面，形成了一个稳定的纳米荧光探针。当该双荧光复合纳米粒子作为比率型荧光探针时，核内的碳点荧光信号强度基本保持不变，而外层的金纳米团簇会选择性地与Hg2+结合，从而导致外层金纳米团簇的荧光猝灭。

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光探针及其制备方法，特别涉及一种用于重金属离子汞离子的可视化分析检测荧光探针及其制备方法，具体地说是一种基于碳点—金纳米团簇双发射荧光信号检测汞离子的荧光探针及其制备方法。

背景技术

重金属离子的污染一直以来是一个很严重的环境及生态问题。尤其是以汞离子(Hg²⁺)为代表的污染物一旦进入环境后，不会快速分解，而是长期残留在土壤、水、空气中，产生经久不衰的污染。进入人体的汞离子对人体的健康也存在着巨大危害，如，汞离子对人的神经系统、造血系统、呼吸系统和肾脏等具有严重的破坏能力。因此，开发一种简便、快速、高效的Hg²⁺含量测定技术十分必要。近年来，原子吸收光谱、X-射线光谱、诱导耦合等离子质谱电子超顺磁共振等仪器分析技术已经被普遍用于重金属离子的探测，但这些技术十分耗时，测试费用高，且需要对样品进行复杂的前处理。

荧光分析法由于灵敏度高、选择性好、操作简便快捷等特点而具有明显的检测优势，在环境监测和食品安全等领域得到广泛关注。近年来，基于人工合成有机染料的荧光探针已经被设计并用于Hg²⁺检测，但此类探针存在合成与修饰过程复杂，量子产率低，水溶性和光稳定性差等问题，限制了它们的实际应用。先前报道的汞离子荧光探针普遍采用单一荧光猝灭模式，测量结果易受检测物浓度、外部环境和仪器条件变化等因素影响，引起数据失真，从而降低了测量结果的准确性。针对上述存在问题，本发明旨在提供一种用于检测汞离子的比率荧光法。

比率荧光法是通过测量两个不同波长处的荧光强度，以其比值为信号参量来测定目标物的分析方法。相比基于单一荧光信号的传统荧光探针而言，它可减少或消除检测底物浓度、外部环境和仪器条件变化等因素引起的数据失真，提高测定结果的准确性。同时，两种不同波长发射光线强度的变化会引起检测体系颜色的变化，使检测过程更加可靠、容易分辨。

本发明旨在提供一种用于真实样品中汞离子快速可视化检测的碳点-金纳米团簇双发射比率型汞离子荧光探针及其制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于可视化检测汞离子的双发射比率型荧光探针及其制备方法。

本发明所述的双发射比率型荧光探针，是由双发射复合二氧化硅纳米粒子构成的。所述的双发射复合二氧化硅纳米粒子是以包覆碳点的二氧化硅粒子为内核、其表面氨基化后共价偶联金纳米团簇所形成的复合二氧化硅纳米粒子。在该结构中，位于二氧化硅纳米粒子核内部的碳点作为参比荧光信号，而外层的金纳米团簇作为响应荧光信号，用于Hg²⁺的选择性识别。其中，碳点作为参比信号，由于其被包埋于核内，可有效避免泄漏问题，因此提供了一个可靠参比信号；而作为响应荧光信号的金纳米团簇通过共价键连接的方式连接到硅层的表面，形成了一个稳定的纳米荧光探针。当该双荧光复合纳米粒子作为比率型荧光探针时，核内的碳点荧光信号强度基本保持不变，而外层的金纳米团簇会选择性地与Hg²⁺结合，从而导致外层金纳米团簇的荧光猝灭。该复合纳米粒子可发展为Hg²⁺含量定量测定的比率型荧光探针。

本发明的的双发射比率型荧光探针的制备方法，步骤如下：

(1)制备包覆碳点的氨基化荧光二氧化硅纳米粒子

将环己烷、曲拉通X-100、正己醇和水的混合溶液搅拌均匀后，向其中加入正硅酸乙酯，搅拌均匀后向其中加入硅氧烷功能化碳点和氨水；反应18～24h后，加入异丙醇进行破乳，离心醇洗，直至离心上清液经荧光光谱仪检测无荧光信号为止，得到包覆碳点的荧光二氧化硅纳米粒子，将其超声分散在无水乙醇中；加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌加热至回流，回流装置的上端用装有干燥剂的干燥管密封，反应12～24h后，离心分离产物，得到包覆碳点的氨基化二氧化硅纳米粒子的固体粉末；

(2)双发射复合二氧化硅纳米粒子的构建

将包覆碳点的氨基化二氧化硅纳米粒子的固体粉末分散于磷酸盐缓冲液中；向金纳米团簇溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温下搅拌0.5～1h，向其中加入包覆碳点的氨基化二氧化硅纳米粒子的磷酸盐缓冲液；反应12-24h后，离心分离产物，得到双发射复合二氧化硅纳米粒子，并分散在超纯水中；

(3)双发射复合二氧化硅纳米粒子检测汞离子

将含有汞离子的标准溶液和待测溶液加入到步骤(2)所得的双发射复合二氧化硅纳米粒子的水溶液中，利用荧光光谱仪测定荧光发射光谱，记录不同汞离子含量下双发射复合二氧化硅纳米粒子的荧光照片，并根据双发射峰的荧光强度之比建立标准曲线，对比标准曲线得到待测溶液中汞离子的浓度。

在步骤(1)中，所述环己烷、曲拉通X-100、正己醇、水、正硅酸乙酯、碳量子点和氨水的体积比优选为152：35.4：35.4：7.6：1：0.5：4；每毫克包覆碳点的荧光二氧化硅纳米粒子需添加3-10μL3-氨丙基三乙氧基硅烷。

在步骤(2)中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的浓度为50～100mmol/L，N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度为100～500mmol/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比优选为1:4。

在步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.5～7.0，磷酸盐缓冲液的浓度为10～50mmol/L。

碳点的最大荧光发射波长为350-550nm。

金纳米团簇的最大荧光发射波长为580-670nm。

本发明的优点和积极效果：本发明构建了单一激发波长下可发射双荧光的复合粒子比率型荧光探针。具体地说是发明了一种用于真实样品中汞离子快速可视化检测的碳点-金纳米团簇双发射比率型汞离子荧光探针及其制备方法。制备的荧光探针能够用于可视化检测汞离子，能够可视化检测到6.35μmol/L汞离子残留。

附图说明

图1是碳点(a)、金纳米团簇(b)和双发射复合二氧化硅纳米粒子(c)的荧光光谱图(激发波长为380nm)。

图2为本发明所述双发射复合二氧化硅纳米粒子形貌图。

图3为双发射复合二氧化硅纳米粒子对不同浓度Hg²⁺的荧光响应曲线。图中460nm为碳点的荧光发射峰，650nm为金纳米簇的荧光发射峰。图中表明：随着汞离子含量的增加，碳点在460nm的荧光强度基本保持不变，而金纳米簇红色荧光强度(650nm)渐渐降低；从图上体现为而金纳米簇在650nm的荧光强度渐渐降低。

图4为本发明所述双发射复合二氧化硅纳米粒子在不同浓度汞离子存在下的荧光照片。由图可见，随着汞离子含量的增加，双发射复合二氧化硅纳米粒子的溶液的荧光颜色由红色逐渐变为蓝色，可实现可视化检测，能够可视化检测到6.35μmol/L汞离子残留。

具体实施方式

实施例1

(1)制备包覆碳点的氨基化荧光二氧化硅纳米粒子

采用已公开中国专利(公开号：CN103421495A)的方法，制得硅氧烷功能化碳点；不限制其他的制备方法。

本实验通过反相微乳液方法制备包覆碳点的二氧化硅纳米粒子。具体实验步骤如下：向25mL圆底烧瓶中分别加入7.7mL环己烷、1.77mL曲拉通X-100和1.77mL正己醇，随后加入380μL水，将该体系剧烈搅拌约10min，以形成稳定均匀的反相微乳液体系；待反相微乳液体系形成后，向烧瓶中加入50μL正硅酸乙酯，搅拌均匀后向其中加入25μL新制碳量子点和200μL氨水(25wt％)，将反应体系置于室温反应；反应18h后，向反应体系中加入三倍反应液体积的异丙醇进行破乳，得到絮状沉淀。将反应液离心醇洗，反复5次，直至离心上清液经荧光光谱仪检测无荧光信号为止，得到包覆碳点的荧光二氧化硅纳米粒子，取5mg超声分散在20mL无水乙醇中；加入50μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌加热至回流，回流装置的上端用装有干燥剂的干燥管密封，反应24h后，离心分离产物，得到包覆碳点的氨基化二氧化硅纳米粒子的固体粉末。

(2)制备金纳米团簇

采用已公开中国专利(授权公告号：CN102866139B)的方法，制得金纳米团簇的水溶液；不限制其他的制备方法。

(3)双发射复合二氧化硅纳米粒子的构建

取5mg包覆碳点的氨基化二氧化硅纳米粒子的固体粉末分散于10mL10mMpH7.0磷酸盐缓冲液中；取0.1mL金纳米团簇溶液，以10mMpH7.0磷酸盐缓冲液稀释至1mL，向其中加入0.5mL100mM1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和0.4mL500mMN-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温下搅拌0.5h；向其中加入1mL包覆碳点的氨基化二氧化硅纳米粒子的磷酸盐缓冲液，置于4℃下搅拌12h；反应结束后，离心分离产物，分散于5mL超纯水中。双发射复合二氧化硅纳米粒子的荧光发射光谱和形貌见图1和图2。

(4)双发射复合二氧化硅纳米粒子检测汞离子

向双发射复合二氧化硅纳米粒子的水溶液中分别加入浓度为0～40μM的汞离子标准溶液和待测溶液，混合均匀后室温反应10min后测定体系荧光发射光谱，结果见图3。碳点在460nm的荧光强度基本保持不变，而金纳米簇红色荧光强度(650nm)渐渐降低；从图上体现为而金纳米簇在650nm的荧光强度渐渐降低。由荧光照片可看出，随着汞离子含量的增加，双发射复合二氧化硅纳米粒子的溶液的荧光由明亮的红色逐渐变为蓝色，荧光颜色变化过程明显，可实现可视化检测。

实施例2

(1)制备包覆碳点的氨基化荧光二氧化硅纳米粒子

采用已公开中国专利(公开号：CN103421495A)的方法，制得硅氧烷功能化碳点。

本实验通过反相微乳液方法制备包覆碳点的二氧化硅纳米粒子。具体实验步骤如下：向25mL圆底烧瓶中分别加入7.7mL环己烷、1.77mL曲拉通X-100和1.77mL正己醇，随后加入380μL水，将该体系剧烈搅拌约10min，以形成稳定均匀的反相微乳液体系；待反相微乳液体系形成后，向烧瓶中加入50μL正硅酸乙酯，搅拌均匀后向其中加入25μL新制碳量子点和200μL氨水(25wt％)，将反应体系置于室温反应；反应20h后，向反应体系中加入三倍反应液体积的异丙醇进行破乳，得到絮状沉淀。将反应液离心醇洗，反复5次，直至离心上清液经荧光光谱仪检测无荧光信号为止，得到包覆碳点的荧光二氧化硅纳米粒子，取5mg超声分散在20mL无水乙醇中；加入15μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌加热至回流，回流装置的上端用装有干燥剂的干燥管密封，反应12h后，离心分离产物，得到包覆碳点的氨基化二氧化硅纳米粒子的固体粉末。

(2)制备金纳米团簇

采用已公开中国专利(授权公告号：CN102866139B)的方法，制得金纳米团簇的水溶液。

(3)双发射复合二氧化硅纳米粒子的构建

取5mg包覆碳点的氨基化二氧化硅纳米粒子的固体粉末分散于10mL50mMpH6.5磷酸盐缓冲液中；取0.1mL金纳米团簇溶液，以50mMpH6.5磷酸盐缓冲液稀释至1mL，向其中加入1.5mL50mM1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1mL300mMN-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温下搅拌0.8h；向其中加入1mL包覆碳点的氨基化二氧化硅纳米粒子的磷酸盐缓冲液，置于4℃下搅拌24h；反应结束后，离心分离产物，分散于5mL超纯水中。双发射复合二氧化硅纳米粒子的荧光发射光谱和形貌见图1和图2。

(4)双发射复合二氧化硅纳米粒子检测汞离子

向双发射复合二氧化硅纳米粒子的水溶液中分别加入浓度为0～40μM的汞离子标准溶液和待测溶液，混合均匀后室温反应10min后测定体系荧光发射光谱，结果见图3。碳点在460nm的荧光强度基本保持不变，而金纳米簇红色荧光强度(650nm)渐渐降低；从图上体现为而金纳米簇在650nm的荧光强度渐渐降低。由荧光照片可看出，随着汞离子含量的增加，双发射复合二氧化硅纳米粒子的溶液的荧光由明亮的红色逐渐变为蓝色，荧光颜色变化过程明显，可实现可视化检测。

实施例3

(1)制备包覆碳点的氨基化荧光二氧化硅纳米粒子

采用已公开中国专利(公开号：CN103421495A)的方法，制得硅氧烷功能化碳点。

本实验通过反相微乳液方法制备包覆碳点的二氧化硅纳米粒子。具体实验步骤如下：向25mL圆底烧瓶中分别加入7.7mL环己烷、1.77mL曲拉通X-100和1.77mL正己醇，随后加入380μL水，将该体系剧烈搅拌约10min，以形成稳定均匀的反相微乳液体系；待反相微乳液体系形成后，向烧瓶中加入50μL正硅酸乙酯，搅拌均匀后向其中加入25μL新制碳量子点和200μL氨水(25wt％)，将反应体系置于室温反应；反应24h后，向反应体系中加入三倍反应液体积的异丙醇进行破乳，得到絮状沉淀。将反应液离心醇洗，反复5次，直至离心上清液经荧光光谱仪检测无荧光信号为止，得到包覆碳点的荧光二氧化硅纳米粒子，取5mg超声分散在20mL无水乙醇中；加入30μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌加热至回流，回流装置的上端用装有干燥剂的干燥管密封，反应20h后，离心分离产物，得到包覆碳点的氨基化二氧化硅纳米粒子的固体粉末。

(2)制备金纳米团簇

采用已公开中国专利(授权公告号：CN102866139B)的方法，制得金纳米团簇的水溶液。

(3)双发射复合二氧化硅纳米粒子的构建

取5mg包覆碳点的氨基化二氧化硅纳米粒子的固体粉末分散于10mL10mMpH7.0磷酸盐缓冲液中；取0.1mL金纳米团簇溶液，以30mMpH7.0磷酸盐缓冲液稀释至1mL，向其中加入1mL75mM1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和3mL100mMN-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温下搅拌1h；向其中加入1mL包覆碳点的氨基化二氧化硅纳米粒子的磷酸盐缓冲液，置于4℃下搅拌18h；反应结束后，离心分离产物，分散于5mL超纯水中。双发射复合二氧化硅纳米粒子的荧光发射光谱和形貌见图1和图2。

(4)双发射复合二氧化硅纳米粒子检测汞离子

向双发射复合二氧化硅纳米粒子的水溶液中分别加入浓度为0～40μM的汞离子标准溶液和待测溶液，混合均匀后室温反应10min后测定体系荧光发射光谱，结果见图3。碳点在460nm的荧光强度基本保持不变，而金纳米簇红色荧光强度(650nm)渐渐降低；从图上体现为而金纳米簇在650nm的荧光强度渐渐降低。由荧光照片可看出，随着汞离子含量的增加，双发射复合二氧化硅纳米粒子的溶液的荧光由明亮的红色逐渐变为蓝色，荧光颜色变化过程明显，可实现可视化检测。

本发明公开和提出的一种可视化检测汞离子的碳点-金纳米团簇双发射比率型荧光探针及制备方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变原料和工艺路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。