固定化转氨酶和制备及使用固定化转氨酶的方法

摘要

本发明涉及固定化转氨酶以及制备和使用它们的方法。

说明书

发明领域

本发明涉及固定化转氨酶和生产及使用它们的方法。

序列表、表格或计算机程序的参考

序列表的正式文本通过EFS-Web与说明书同时提交作为ASCII格式文本文件，文件名为“23277-US-PSP.txt”，建立日期为2013年2月26日，尺寸为8,192字节。通过EFS-Web提交的序列表为说明书的一部分并整体引入本文中作为参考。

发明背景

酶是用于加速活细胞的化学反应(通常为几个数量级)的蛋白分子。在没有酶的情况下，大部分生化反应将非常缓慢以致于甚至无法进行生命过程。酶展示出巨大的特异性，并且不会由它们在反应中的参与而被持久地修饰。由于它们在反应中并不改变，因此可以成本有效地将酶作为催化剂用于期望的化学转化。

转氨酶是催化酮类至手性胺的直接氨基化的特异类型的酶。对映体纯手性胺在合成具有广泛生物活性的许多药物化合物中是关键中间体。目前在进行许多努力以利用生物催化剂开发用于它们制备的有效催化方法。近期，转氨酶已经显现出作为用于手性胺生产的有希望的生物催化剂。

例如，铑催化的不对称烯胺氢化最初用于大规模制造抗糖尿病的化合物西他列汀。用转氨酶代替铑，这最终已经产生了减少废料、改善收率和安全性并消除对金属催化剂的需要的酶促方法。此外，由此产生的生物催化剂显示出对手性胺合成的广泛适用性，而所述手性胺之前其仅可通过拆分(resolution)获得。

尽管使用转氨酶产生手性胺的进展已经被高度关注，但对于酶促方法仍存在某些缺点。目前，酶促方法仅能在含水溶剂体系中进行，这是由于转氨酶在100％的有机溶剂中不稳定。此外，在产品胺分离的过程中，转氨酶催化剂失活并被丢弃，导致无法再次使用该催化剂。

因此，尽管已经进行了尝试以将转氨酶固定化，但从未成功地克服它们缺乏稳定性的缺点，更具体地，它们在有机溶剂中缺乏稳定性的缺点。

发明概述

本文描述了固定化转氨酶，其包含与树脂物理连接的重组转氨酶。本文描述的固定化转氨酶包括重组转氨酶，其能够在氨基供体存在的情况下，将4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮转化成(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-胺至通过分析技术可测定的水平。在某些实施方案中，使用本文描述的固定化转氨酶以生产(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-胺。

在某些实施方案中，本文描述了固定化转氨酶，其包含能够在氨基供体存在的情况下，将4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮转化成(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-胺至通过分析技术可测定的水平的重组转氨酶；和树脂，其中所述重组转氨酶通过物理作用与树脂连接，并且其中固定化转氨酶在包含至少90％的有机溶剂的溶剂体系中是稳定的。

例如，在一个实施方案中，所述重组转氨酶通过亲水作用与树脂连接。

本文描述的固定化转氨酶在有机溶剂体系中是稳定的。如本文所用，稳定的固定化转氨酶表示所述固定化转氨酶在有机溶剂体系中保持它的结构构象或它的活性。在本文描述的一个实施方案中，所述固定化转氨酶在包含至少95％的有机溶剂的溶剂体系中是稳定的。

在本文描述的某些实施方案中，所述重组转氨酶是能够在氨基供体存在的情况下，将4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮转化成(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-胺至通过HPLC-UV吸光度可测定的水平的转氨酶。

在仍另一个实施方案中，所述重组转氨酶选自：SEQIDNO:1。

在本文描述的固定化转氨酶的某些实施方案中，所述树脂包含甲基丙烯酸酯。例如，在一种实施方案中，所述树脂从甲基丙烯酸酯合成，其中单体和交联剂为甲基丙烯酸酯。在某些实施方案中，所述树脂不含任何芳族化合物。在其他实施方案中，所述树脂为DIAIONHP2MG(Mistubishi)。DIAIONHP2MG为仅从甲基丙烯酸酯合成的高度多孔的甲基丙烯酸酯基吸附树脂（单体和交联剂为甲基丙烯酸酯）。DIAIONHP2MG(Mistubishi)不含任何芳族化合物，并被认为是中度极性吸附树脂。DIAIONHP2MG(Mistubishi)适合通过使用聚合物基质的更亲水特性进行的具有相对高极性的有机化合物的脱盐和吸附。

在一种实施方案中，在固定化转氨酶中，转氨酶SEQIDNO:1与树脂DIAIONHP2MG(Mitsubishi)连接。在另一种实施方案中，转氨酶SEQIDNO:1通过亲水作用与树脂DIAIONHP2MG(Mitsubishi)连接。

本文还描述了生产和使用固定化转氨酶的方法。本文描述的固定化转氨酶可以用于分批反应中，其中固定化转氨酶可以在反应完成后滤出并在其他反应中再次使用。或者，本文描述的固定化转氨酶可以用于连续反应系统中，其中起始物质连续经过所述固定化转氨酶并收集产物。

在一个实施方案中，本文描述的方法是生产(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-胺的方法，其包括以下步骤：

1)将4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮溶于有机溶剂中；

2)将4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮与固定化转氨酶接触，所述固定化转氨酶能够在氨基存在的情况下，将4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮转化成(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-胺。

优选地，在此类方法中，所述固定化转氨酶是与树脂DIAION(Mitsubishi)物理连接的转氨酶SEQIDNO:1。

本文还描述了生产固定化转氨酶的方法，其包括：

1)将转氨酶溶液与树脂和酶溶液孵育以形成固定化转氨酶；

2)过滤并冲洗所述固定化转氨酶；

3)干燥所述固定化转氨酶。

发明详述

定义

“转氨酶(Transaminase)”，也称为“氨基转移酶(aminotransferase)”，在本文中用于指具有从伯胺(3)向受体羰基化合物(2)转移氨基(NH₂)和氢原子、将胺供体转化为它对应的羰基化合物(4)并将受体转化为它对应的伯胺(1)的酶促能力的多肽：

。

关于本文描述的固定化转氨酶，该转氨酶多肽能够在式(3)的氨基供体存在的情况下，将式(2a)的底物4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮(“酮酰胺底物”)转化成式(1a)的产物(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-胺(“产物”)，如下：

其中当独立地获得时，R¹、R²、R³和R⁴的每一个是未取代的或取代有一个或多个对酶无抑制性的基团的烷基、烷基芳基或芳基。R¹和R³在结构或手性上可以分别与R²和R⁴相同或不同。基团R¹和R²或R³和R⁴一同可以形成未取代的、取代的或与其他环稠合的环。

“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文中可以互换使用来表示通过酰胺键共价连接的至少两个氨基酸的聚合物，而与长度或翻译后修饰(例如糖基化、磷酸化、脂化、十四烷基化、泛素化等)无关。包括在该定义内的有D-和L-氨基酸、和D-和L-氨基酸的混合物。

如本文所用“底物”指在由转氨酶介导的反应中从氨基供体接受氨基的氨基受体，诸如酮。如本文进一步描述，底物可以包括式(II)的化合物、式(2)的化合物和式(2a)的化合物。在本文描述的某些方法中，“酮酰胺底物”具体指式(2a)的化合物4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮。

“氨基供体”指能够向受体羰基化合物(即氨基受体)供应氨基，由此形成羰基副产物的氨基化合物。氨基供体为通式(3)的分子，

其中当独立地获得时，R¹、R²的每一个是未取代的或取代有一个或多个对酶无抑制性的基团的烷基、烷基芳基或芳基。R¹在结构或手性上可以与R²相同或不同。基团R¹和R²一同可以形成未取代的、取代的或与其他环稠合的环。可以用于本发明的典型氨基供体包括手性的和非手性的氨基酸、和手性的和非手性的胺。

“手性胺”指其中R₁和R₂是不相同的通式R₁-CH(NH₂)-R₂的胺，并且在本文中以其最广泛含义使用，包括很多种不同的，和混合的功能类型的脂肪族和脂环族化合物，其特征在于存在与仲碳原子结合的伯氨基，其除了氢原子之外还携带(i)形成手性环结构的二价基团，或(ii)两个在结构或手性上彼此不同的取代基(不是氢)。形成手性环结构的二价基团包括例如2-甲基丁烷-1,4-二基、戊烷-1,4-二基、己烷-1,4-二基、己烷-1,5-二基、2-甲基戊烷-1,5-二基。仲碳原子上的两个不同取代基(上文的R₁和R₂)也可以在很大程度上变化，并且包括烷基、芳烷基、芳基、卤素、羟基、低级烷基、低级烷氧基、低级烷基硫基、环烷基、羧基、烷氧羰基、氨基甲酰基、单-和双-(低级烷基)取代的氨基甲酰基、三氟甲基、苯基、硝基、氨基、单-和双-(低级烷基)取代的氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基酰胺基、芳基酰胺基等，以及由上述基团取代的烷基、芳烷基或芳基。

“羰基副产物”指当在氨基交换反应中氨基供体上的氨基转移至氨基受体时从氨基供体形成的羰基化合物。羰基副产物具有式(4)的通常结构：

其中R₁和R₂的定义在对氨基供体的上文中。

“磷酸吡哆醛”、“PLP”、“5'-磷酸吡哆醛”、“PYP”和“P5P”在本文中可互换使用来指在转氨酶反应中充当辅酶的化合物。在某些实施方案中，通过结构1-(4'-甲酰基-3'-羟基-2'-甲基-5'-吡啶基)甲氧基磷酸，CAS号[54-47-7]，来定义磷酸吡哆醛。5'-磷酸吡哆醛在体内通过吡哆醇(也被称为吡哆素或维生素B6)的磷酸化和氧化来产生。在使用转氨酶酶类的氨基交换反应中，氨基供体的氨基转移至辅酶以产生酮副产物，同时5'-磷酸吡哆醛转化为磷酸吡哆胺。通过与不同的酮化合物(氨基受体)反应再生5'-磷酸吡哆醛。氨基从磷酸吡哆胺向氨基受体的转移产生手性胺并且再生辅酶。本发明的5'-磷酸吡哆醛可以由维生素B6家族的其他成员替代，其中，包括吡哆醛(PL)、吡哆胺(PM)、及它们磷酸化的对应物；磷酸吡哆素(PNP)和磷酸吡哆胺(PMP)。

“天然存在的”或“野生型”指自然界中发现的形式。例如，天然存在的或野生型多肽或多核苷酸序列是存在于可以从自然界中的来源分离的生物体内的序列，并且其并未有意地经人工处理而修饰。

当用于指例如细胞、核酸或多肽时，“重组的”指材料或对应于该材料的天然或自然形式的材料，其已经以在自然界中并不存在的方式来修饰，或者虽与其相同但从合成材料和/或通过使用重组技术的处理而产生或得到。其中，非限制性实例包括表达在细胞的天然(非重组的)形式内未发现的基因的重组细胞，或表达在其他情况下以不同水平表达的天然基因的重组细胞。

“序列同一性的百分比”、“百分比同一性”和“百分比同一的”在本文中用于指多核苷酸序列之间或多肽序列之间的比较，并且通过在比较窗口上比较两条最佳比对的序列来确定，其中为了两条序列的最佳比对，比较窗口内的多核苷酸或多肽序列的部分可以包含与参考序列相比的添加或缺失(即缺口)。百分比是这样计算的，通过确定在两条序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目或者核酸碱基或氨基酸残基与缺口对齐的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。使用BLAST和BLAST2.0算法进行最佳比对和百分比序列同一性的确定

进行BLAST分析的软件从NationalCenterforBiotechnologyInformation网站上是公众可获得的。

简述之，BLAST分析包括首先通过确定查询序列中长度W的短字符来确定高评分序列对(HSPs)，当与数据库序列中相同长度的字符比对时，其匹配或满足某些正值的阈值分值T。T称为邻近字符分值阈值(Altschul等人，见上文)。这些初始的邻近字符匹配作为种子用于开始检索以发现包含它们的更长HSPs。字符匹配随后沿每一序列在两个方向上延伸，远至累积比对分值能够增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对匹配残基对的奖励分值；始终>0)和N(对错配残基的惩罚分值；始终<0)计算累积分值。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积分值。当出现以下情况时，在每一方向上字符匹配的延伸停止：累积比对分值以数量X从它的最大实现值掉落；由于积累了一个或多个负评分残基比对，累积分值变为零或低于零；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字符长(W)为11、期望值(E)为10、M=5、N=-4和两条链的比较作为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字符长(W)为3、期望值(E)为10、和BLOSUM62评分矩阵作为缺省值(见Henikoff和Henikoff,1989,ProcNatlAcadSciUSA89:10915)。

在提供两条序列的百分比同一性方面，与BLAST功能类似的大量其他算法是可得的。可以通过以下进行用于比较的序列最佳比对，例如，通过Smith和Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444的相似性检索方法、通过这些算法的计算机化执行(在GCGWisconsinSoftwarePackage中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、或通过目检进行(通常参见，CurrentProtocolsinMolecularBiology，F.M.Ausubel等人编辑，CurrentProtocols，GreenePublishingAssociates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.,之间合资，(1995Supplement)(Ausubel))。此外，序列比对和百分比序列同一性的确定可以使用GCGWisconsinSoftwarepackage(Accelrys,MadisonWI)中的BESTFIT或GAP程序，使用提供的缺省参数。

“实质上的同一性”指在至少20个残基位置的比较窗口上、通常在至少30-50个残基的窗口上与参考序列比较时，具有至少80％序列同一性的多核苷酸或多肽序列、优选至少85％序列同一性、更优选至少89％序列同一性、更优选至少95％序列同一性、并且甚至更优选至少99％序列同一性的多核苷酸或多肽序列，其中通过比较参考序列与包括在比较窗口上参考序列的总计20％或更少的缺失或添加的序列来计算序列同一性的百分比。在应用于多肽的具体实施方案中，术语“实质上的同一性”表示当最佳比对时，诸如通过程序GAP或BESTFIT使用缺省缺口权重时，两条多肽序列共有至少80％序列同一性，优选至少89％序列同一性、更优选至少95％序列同一性或更高(例如，99％序列同一性)。优选地，不相同的残基位置通过保守氨基酸取代而不同。

“立体选择性”指化学或酶促反应中一种立体异构体超过另一个的优选形成。立体选择性可以是部分的，其中一种立体异构体的形成优于另一种，或者立体选择性可以是完全的，其中仅形成一种立体异构体。当立体异构体是对映体时，立体选择性称为对映选择性，即一种对映体在两者的总和中的分数(通常报道为百分比)。或者它通常在本领域中报道为(通常为百分比)根据公式[主要对映体－次要对映体]/[主要对映体+次要对映体]从中计算的对映体过量(e.e.)。在立体异构体是非对映异构体的情况下，立体选择性称为非对映立体选择性，即一种非对映体在两种非对映体的混合物中的分数(通常报道为百分比)，通常可选地报道为非对映体过量(d.e.)。对映体过量和非对映体过量是立体异构体过量的类型。

“高度立体选择的”指能够以至少约85％立体异构体过量转化底物(例如式(2a))至它对应的产物(例如式(1a))的化学或酶促反应。

“转化”指底物至对应产物的酶促转化。“百分比转化”指在指定条件下一段时间内转化为产物的底物的百分比。因此，例如，转氨酶多肽的“酶促活性”或“活性”可以表示为底物至产物的“百分比转化”。

“稳定的”指本文描述的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂体系中保持它们的结构构象和/或它们的活性的能力。在某些实施方案中，稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂体系中每小时失去少于10％的活性。优选地，本文描述的稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂体系中每小时失去少于9%的活性。优选地，本文描述的稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂体系中每小时失去少于8%的活性。优选地，本文描述的稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂体系中每小时失去少于7%的活性。优选地，本文描述的稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂体系中每小时失去少于6%的活性。优选地，本文描述的稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂体系中每小时失去少于5%的活性。优选地，本文描述的稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂体系中每小时失去少于4%的活性。优选地，本文描述的稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂体系中每小时失去少于3%的活性。优选地，本文描述的稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂体系中每小时失去少于2%的活性。优选地，本文描述的稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂体系中每小时失去少于1%的活性。

如在本文公开的多肽的上下文中使用的“氨基酸”或“残基”指在序列位置上的具体单体。

“亲水氨基酸或残基”指按照Eisenberg等人，1984,J.Mol.Biol.179:125-142的标准化的共有疏水性标度(consensushydrophobicityscale)，具有显示出低于零的疏水性的侧链的氨基酸或残基。遗传编码的亲水氨基酸包括

。

“酸性氨基酸或残基”指当该氨基酸包含于肽或多肽中时，具有显示出低于约6的pK值的侧链的亲水氨基酸或残基。酸性氨基酸通常在生理pH下具有由于缺少氢离子而带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括LGlu(E)和LAsp(D)。

“碱性氨基酸或残基”指当该氨基酸包含于肽或多肽中时，具有显示出高于约6的pKa值的侧链的亲水氨基酸或残基。碱性氨基酸通常在生理pH下具有由于与水合氢离子结合而带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括LArg(R)和LLys(K)。

“极性氨基酸或残基”指具有在生理pH下不带电的侧链的亲水氨基酸或残基，但其具有至少一个这样的键，其中由两个原子共同分配的一对电子由所述原子之一更紧密地占据。遗传编码的极性氨基酸包括LAsn(N)、LGln(Q)、LSer(S)和LThr(T)。

“疏水氨基酸或残基”指按照Eisenberg等人，1984,J.Mol.Biol.179:125-142的标准化的共有疏水性标度，具有显示出高于零的疏水性的侧链的氨基酸或残基。遗传编码的疏水氨基酸包括

。

“芳香族氨基酸或残基”指具有包括至少一个芳香环或芳香杂环的侧链的亲水或疏水氨基酸或残基。遗传编码的芳香族氨基酸包括LPhe(F)、LTyr(Y)、LHis(H)和LTrp(W)。本文中将LHis(H)组氨酸分类为亲水残基或受限残基。

“非极性氨基酸或残基”指具有在生理pH下不带电的侧链的疏水氨基酸或残基，并且其具有这样的键，其中由两个原子共同分配的一对电子通常由两个原子的每一个同等占据(即，侧链不是极性的)。遗传编码的非极性氨基酸包括。

“脂肪族氨基酸或残基”指具有脂肪族烃侧链的疏水氨基酸或残基。遗传编码的脂肪族氨基酸包括。

“半胱氨酸”或LCys(C)是不同寻常的，在于它可以与其他LCys(C)氨基酸或其他含硫烷基或巯基的氨基酸形成二硫桥键。“半胱氨酸类残基”包括半胱氨酸和包含可用于形成二硫桥键的巯基部分的其他氨基酸。LCys(C)(和具有含SH侧链的其他氨基酸)以还原的游离SH或氧化的二硫桥键形式存在于肽中的能力影响LCys(C)促成肽的净疏水特征还是亲水特征。尽管按照Eisenberg的标准化的共有标度(Eisenberg等人，1984，见上文)，LCys(C)显示出0.29的疏水性，但应该理解出于本公开的目的，将LCys(C)分类至它自身唯一的组内。

“含羟基氨基酸或残基”指含羟基(-OH)部分的氨基酸。遗传编码的含羟基氨基酸包括LSer(S)、LThr(T)和L-Tyr(Y)。

转氨酶

通常，转氨酶催化酮至手性胺的直接氨基化。转氨酶的实例包括任何具有从伯胺(3)向受体羰基化合物(2)转移氨基(NH₂)和氢原子、将胺供体转化为它对应的羰基化合物(4)并将受体转化为它对应的伯胺(1)的酶促能力的多肽：

其中当独立地获得时，R¹、R²、R³和R⁴的每一个是未取代的或取代有一个或多个对酶无抑制性的基团的烷基、烷基芳基或芳基。R¹和R³在结构或手性上可以分别与R²和R⁴相同或不同。基团R¹和R²或R³和R⁴一同可以形成未取代的、取代的或与其他环稠合的环。

本文描述了包含重组转氨酶的固定化转氨酶，所述重组转氨酶能够将4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮(“酮酰胺底物”)转化成(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-胺(“产物”)。

在本文描述的固定化转氨酶的某些实施方案中，所述固定化转氨酶包括转氨酶，其能够在氨基供体存在的情况下，将4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮(“酮酰胺底物”)转化成(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-胺(“产物”)至通过分析技术(诸如HPLC-UV吸光度)可测定的水平。

在本文描述的固定化转氨酶的其他实施方案中，所述固定化转氨酶包括SEQIDNO:1的转氨酶。

在本文所述的固定化转氨酶的又另一实施方案中，所述固定化转氨酶包括转氨酶，其相比于2010年2月26日提交的美国专利公开No.2010/0285541（其整体并入本文中作为参考）中所述的此类转氨酶，在氨基供体的存在下能够改善4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮(“酮酰胺底物”)至(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-胺(“产物”)的转化，至通过分析技术(例如HPLC-UV吸光度)可测量水平。

在某些实施方案中，转氨酶能够在氨基供体存在的情况下，将酮酰胺底物4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮转化成产物(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-胺，至通过分析技术(诸如HPLC-UV吸光度)可测定的水平，所述转氨酶包含对应于序列SEQIDNO:1的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述转氨酶包含与参考序列SEQIDNO:1为至少约

同一的氨基酸序列。

在本文描述的固定化转氨酶的某些实施方案中，所述转氨酶选自：SEQIDNO:1。

本文中所述的固定化转氨酶包括通过物理作用例如亲水作用与固体支持物物理连接的转氨酶。

在本文中所述的固定化转氨酶的某些实施方案中，所述固定化转氨酶包括与固体支持物物理连接的转氨酶。合适的转氨酶包括酸性或碱性氨基酸或残基。酸性氨基酸包括LGlu(E)和LAsp(D)。碱性氨基酸包括LArg(R)和LLys(K)。可以与固体支持物物理连接的其他转氨酶包括如下转氨酶：其包括亲水氨基酸或残基、含羟基氨基酸或残基或极性氨基酸或残基，或转氨酶，例如Arg(R),Lys(K),His(H),Asn(N)和Pro(P)。在某些实施方案中，所述转氨酶可以包括非极性氨基酸或残基，例如但不限于LGly(G),LLeu(L),LVal(V),LIle(I),LMet(M)和LAla(A)。在其他实施方案中，所述转氨酶可以包括脂族氨基酸或残基，例如但不限于LAla(A),LVal(V),LLeu(L)和LIle(I)。在又其他实施方案中，所述转氨酶可以包括芳族氨基酸或残基，例如但不限于Arg(R),Lys(K),His(H),Asn(N)和Pro(P)。

与固体支持物例如树脂物理连接的转氨酶的合适实例为SEQIDNO:1。通过亲水作用与固体支持物例如树脂物理连接的转氨酶的合适实例为SEQIDNO:1。

如本文所述，本公开的转氨酶多肽可以是融合多肽的形式，其中该转氨酶多肽与其他多肽(作为举例并且无限定地，诸如，抗体标签(例如，myc表位)、纯化序列(例如，用于结合金属的His标签)、和细胞定位信号(例如，分泌信号))融合。因此，所述转氨酶多肽可以与其他多肽融合或不与其他多肽融合来使用。

本文描述的多肽不限定于遗传编码的氨基酸。除了遗传编码的氨基酸，本文描述的多肽可以全部或部分地由天然存在的和/或合成的非编码氨基酸构成。可构成本文描述的多肽的某些常常遇到的非编码氨基酸包括但不限于：遗传编码氨基酸的D-立体异构体；2,3-二氨基丙酸(Dpr)；α氨基异丁酸(Aib);ε氨基己酸(Aha);δ氨基戊酸(Ava);N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly或Sar);鸟氨酸(Orn);瓜氨酸(Cit);叔丁基丙氨酸(Bua);叔丁基甘氨酸(Bug);N-甲基异亮氨酸(MeIle);苯基甘氨酸(Phg);环己基丙氨酸(Cha);正亮氨酸(Nle);萘基丙氨酸(Nal);2-氯苯丙氨酸(Ocf);3-氯苯丙氨酸(Mcf);4-氯苯丙氨酸(Pcf);2-氟苯丙氨酸(Off);3-氟苯丙氨酸(Mff);4-氟苯丙氨酸(Pff);2-溴苯丙氨酸(Obf);3-溴苯丙氨酸(Mbf);4-溴苯丙氨酸(Pbf);2-甲基苯丙氨酸(Omf);3-甲基苯丙氨酸(Mmf);4-甲基苯丙氨酸(Pmf);2-硝基苯丙氨酸(Onf);3-硝基苯丙氨酸(Mnf);4-硝基苯丙氨酸(Pnf);2-氰基苯丙氨酸(Ocf);3-氰基苯丙氨酸(Mcf);4-氰基苯丙氨酸(Pcf);2-三氟甲基苯丙氨酸(Otf);3-三氟甲基苯丙氨酸(Mtf);4-三氟甲基苯丙氨酸(Ptf);4-氨基苯丙氨酸(Paf);4-碘苯丙氨酸(Pif);4-氨基甲基苯丙氨酸(Pamf);2,4-二氯苯丙氨酸(Opef);3,4-二氯苯丙氨酸(Mpcf);2,4-二氟苯丙氨酸(Opff);3,4-二氟苯丙氨酸(Mpff);吡啶-2-基丙氨酸(2pAla);吡啶-3-基丙氨酸(3pAla);吡啶-4-基丙氨酸(4pAla);萘-1-基丙氨酸(1nAla);萘-2-基丙氨酸(2nAla);噻唑基丙氨酸(taAla);苯并噻吩基丙氨酸(bAla);噻吩基丙氨酸(tAla);呋喃基丙氨酸(fAla);高苯丙氨酸(hPhe);高酪氨酸(hTyr);高色氨酸(hTrp);五氟苯丙氨酸(5ff);苯乙烯丙氨酸(styrylkalanine)(sAla);authrylalanine(aAla);3,3-二苯基丙氨酸(Dfa);3-氨基-5-苯基戊酸(Afp);青霉胺(Pen);1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(Tic);β2-噻吩基丙氨酸(Thi);甲硫氨酸亚砜(Mso);N(w)-硝基精氨酸(nArg);高赖氨酸(hLys);膦酰基甲基苯丙氨酸(pmPhe);磷酸丝氨酸(pSer);磷酸苏氨酸(pThr);高天冬氨酸(hAsp);高谷氨酸(hGlu);1-氨基环戊-(2或3)-烯-4甲酸;2-哌啶酸(PA),氮杂环丁烷-3-甲酸(ACA);1-氨基环戊烷-3-甲酸;烯丙基甘氨酸(aOly);炔丙基甘氨酸(pgGly);高丙氨酸(hAla);正缬氨酸(nVal);高亮氨酸(hLeu),高缬氨酸(hVal);高异亮氨酸(hIle);高精氨酸(hArg);N乙酰基赖氨酸(AcLys);2,4-二氨基丁酸(Dbu);2,3-二氨基丁酸(Dab);N-甲基缬氨酸(MeVal);高半胱氨酸(hCys);高丝氨酸(hSer);羟基脯氨酸(Hyp)和高脯氨酸(hPro)。可以构成本文描述的多肽的另外的非编码氨基酸对于本领域技术人员将是显而易见的(例如参见，

第3-70页及其中引用的参考文献中提供的多种氨基酸，其全部通过引用并入)。这些氨基酸可以是L或D构型。

本领域技术人员将公认具有侧链保护基团的氨基酸或残基也可以构成本文描述的多肽。此类保护的氨基酸的非限制性实例(其在这种情况下属于芳香族类别)包括(保护性基团在括号中列出)但不限于：Arg(tos)、Cys(甲苯甲基)、Cys(硝基吡啶亚磺酰)、Glu(δ-苯甲基酯)、Gln(呫吨基)、Asn(N-δ-呫吨基)、His(bom)、His(苯甲基)、His(tos)、Lys(fmoc)、Lys(tos)、Ser(O-苯甲基)、Thr(O-苯甲基)和Tyr(O-苯甲基)。

可以构成本文描述的多肽的构象受限的非编码氨基酸包括但不限于N甲基氨基酸(L构型)；1-氨基环戊-(2或3)-烯-4-甲酸；2-哌啶酸；氮杂环丁烷-3-甲酸；高脯氨酸(hPro)；和1-氨基环戊烷-3-甲酸。

如上所述，引入天然存在的多肽以产生工程化的转氨酶酶类的多种修饰可以针对酶的具体特性。

在另一方面，本公开内容提供了编码改善的转氨酶多肽的多核苷酸。该多核苷酸可以可操作地连接至控制基因表达的一个或多个异源调节序列，以产生能够表达所述转氨酶多肽的重组多核苷酸。可以将包含编码工程化的转氨酶的异源多核苷酸的表达构建体引入合适的宿主细胞中以表达相应的转氨酶多肽。

由于对应于多种氨基酸的密码子的知识，蛋白序列的可用性提供了能够编码对象的所有多核苷酸的描述。遗传密码的简并性(其中相同的氨基酸由可变的或同义的密码子编码)允许产生极大数量的核酸，所有这些核酸都编码本文公开的改善的转氨酶多肽。因此，已经鉴定了具体的氨基酸序列后，本领域技术人员能够通过以不改变蛋白的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来产生任何数量的不同核酸。在这一方面，本公开内容明确地考虑多核苷酸的每一个可能的变化，其能够基于可能的密码子选择通过选择组合来产生，并且认为明确地公开对于本文公开的任何多肽的所有此类变化。

在某些实施方案中，可以选择和/或工程化多核苷酸以包含被优选选择以适合其中将生产蛋白的宿主细胞的密码子。例如，将细菌中使用的优选的密码子用于在细菌中表达基因；将酵母中使用的优选的密码子用于在酵母中表达；并且将哺乳动物中使用的优选的密码子用于在哺乳动物细胞中表达。由于并非所有密码子都需要进行替换以优化转氨酶的密码子选择(例如，因为天然序列可以具有优选的密码子并且因为优选密码子的使用可能不是对于所有氨基酸残基都是必需的)，因此编码转氨酶多肽的密码子优化的多核苷酸可以在全长编码区的约40%、50%、60%、70%、80%或大于90％的密码子位置处包含优选密码子。

固体支持物

本文描述了包含与固体支持物物理连接的转氨酶的固定化转氨酶。支持物材料可以包括广泛的材料，生物的、非生物的、有机的、无机的、或这些中的任何的组合。例如，支持物材料可以是聚合的LangmuirBlodgett薄膜、官能化玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO₂、SiN₄、改性硅、或许多种凝胶或聚合物中的任一种，诸如(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯、聚苯乙烯、交联的聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(丙交酯-co-乙交酯)、聚酐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚硅氧烷、聚合二氧化硅、胶乳、葡聚糖聚合物、环氧树脂、聚碳酸酯或其组合。支持物材料可以是平面晶状支持物材料诸如基于二氧化硅的支持物材料(例如玻璃、石英等)、或用于例如半导体或微处理器工业中的晶状支持物材料诸如硅、砷化镓等。二氧化硅气凝胶也可用作支持物材料，并且可以通过本领域已知的方法制备。可以将气凝胶支持物材料用作独立基材(freestandingsubstrate)或用作另一种支持物材料的表面涂料。

支持物材料可以取用任何形式或形状，并且通常为板、玻片、珠、丸、盘、颗粒、线、沉淀物、膜(membrane)、任选多孔凝胶、片材、管、球、容器、毛细管、垫、薄片、薄膜(film)、芯片、多孔板或皿、光纤等。尽管通常支持物材料取用无生命形式，但对于某些连接肽应用，诸如流式细胞术或原位杂交，支持物材料可以是刚性的或半刚性的任何形式。支持物材料可以包含凸起的或凹陷的区域，捕获探针位于该区域上。可以使用熟知的技术对支持物材料的表面蚀刻以提供期望的表面特征，例如沟、v槽、台面结构等。

支持物材料的表面可以由与支持物的内部相同的材料构成或者可以由不同的材料构成，并且可以通过化学或物理方式与内部支持物材料偶联。此类偶联的表面可以由许多种材料中的任何材料组成，例如，聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、碳、金属、无机玻璃、膜、或任何上述列出的支持物材料。在一个实施方案中，表面任选是透明的并且可以具有表面Si--OH官能度，诸如在二氧化硅表面上发现的那些。

通常将玻璃或塑料载玻片用作用于微阵列分析的固体基质支持物。用于生产微阵列的不透明的基质包被材料包括尼龙、PVDF(聚偏二氟乙烯)和硝酸纤维素。硝酸纤维素是使用超过50年的传统聚合物基材，可以用于微阵列连接应用。(例如，TonkinsonandStillman,FrontiersinBioscience7:c1-12,2002.)。不透明的硝酸纤维素已经广泛用来固定用于生物分子分析的蛋白和核酸。硝酸纤维素以近乎定量的方式固定目标分子，并允许短期或长期保存。硝酸纤维素还允许溶液相目标种类有效地结合到固定化实体上。

固体支持物可以是连接分子可对其适用的任何合适的组合物。在应用连接/分子肽之前，可以将它预处理或官能化以利于连接分子的结合或者用于任何其他期望的目标，诸如促进有助于实体的活性或任何其他所需特性的条件，或者避免与其他实体不期望的相互作用。许多这样的表面处理和/或官能化是本领域已知的，并且合适的处理和/或官能化的选择将依赖于连接分子/肽和实体的本性和特征以及依赖于伴随的条件和期望的活性。

关于本文描述的固定化转氨酶，所述固体支持物是树脂。树脂可以由任何合适的组合物制成，包括但不限于聚甲基丙烯酸酯和苯乙烯/DVB共聚物。此类树脂可以包括官能团并且利于重组转氨酶与树脂的共价结合(convalentbonding)。合适的官能团包括但不限于环氧官能团和氨基环氧官能团。此外，其他的官能团诸如十八烷基和包括多孔结构的树脂利于产生与重组转氨酶的疏水作用。

在本文中所述的固定化转氨酶的某些实施方案中，所述树脂包含甲基丙烯酸酯。合适的树脂的实例包括但不限于DIAIONHP2MG(Mitsubishi)。

下表示出可以与本文中所述的固定化转氨酶关联使用的优选树脂：

表1

树脂名称(Mitsubishi)树脂组成树脂官能团DIAION HP2MG单体和交联剂为甲基丙烯酸酯无

在本文中所述的固定化转氨酶的某些实施方案中，所述固定化转氨酶包括与转氨酶物理连接的树脂。合适的树脂包括没有芳族化合物或其他官能团的甲基丙烯酸酯。实例包括但不限于DIAIONHP2MG(Mitsubishi)。

在本文中所述的固定化转氨酶的又其他实施方案中，所述固定化转氨酶由与树脂DIAIONHP2MG(Mitsubishi)物理连接的转氨酶SEQIDNO:1构成。在本文所述的固定化转氨酶的又其他实施方案中，所述固定化转氨酶由通过亲水作用与树脂DIAIONHP2MG(Mitsubishi)物理连接的转氨酶SEQIDNO:1构成。

固定化转氨酶的制备方法

本文还描述了固定化转氨酶的制备方法。在本文描述的固定化转氨酶的制备方法的某些实施方案中，该方法开始于通过溶解酶于水或缓冲溶液中制备酶溶液。转氨酶多肽可以使用磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶，当制备时，其可以与例如由其中表达多肽的宿主细胞提供的酶结合。在某些实施方案中，可以在转氨酶多肽表达过程中将PLP、PLP类似物或PLP前体加入到宿主细胞的培养基中。在所述方法的某些实施方案中，PLP或PLP类似物可以加入到反应中以提供酶活性所需的辅酶。可以由本领域技术人员测定对酶活性足够的PLP量。

在固定化转氨酶的制备方法的某些实施方案中，所述转氨酶溶液可以包含约5.0-约9.0的pH。在某些实施方案中，所述方法的反应条件为约7.5至约8.5的pH。在其他实施方案中，所述方法的反应条件为约7的pH。

另外，溶剂可以添加至酶溶液中。可以用于本文所述方法中的合适的有机溶剂包括在本领域中熟知的任何有机溶剂，例如甲醇、乙醇、THF、DMSO、甲苯、乙酸异丙酯、己烷、异丙醇、丙醇、苯、丙酮、二甲苯、甲乙酮、乙醚和乙酸乙酯和其混合物。在本文中所述的方法的某些实例中，有机溶剂为异丙醇。

所述方法还包括使转氨酶与树脂接触或孵育。这可以通过将树脂加入到溶液中实现。随后将溶液摇动一定长度的时间，诸如过夜。或者，所述酶溶液可以间歇式或连续式模式与树脂接触。例如，树脂可以装进柱中，然后酶溶液可以通过该柱。

在某些实施方案中，用于进行所述方法的反应条件可以包括约5℃-约70℃的温度。在某些实施方案中，所述反应条件为约25℃的温度(室温)。

如果该方法在溶液中完成，则一旦反应如果完成，将固定化转氨酶过滤并冲洗。在本文描述的方法的某些实施方案中，用水或其他溶剂冲洗固定化转氨酶后，在它用于100％有机溶剂体系中之前将制剂干燥。固定化酶可以在真空下干燥，并用氮气吹扫以将水从固定化酶树脂的外表面去除。干燥的同时可以搅拌固定化制剂以允许在固定化酶床各处均匀的水分含量，从而避免该固定化酶制剂的任何部分干燥过度或干燥不充分。还可以通过用有机溶剂洗涤来干燥固定化制剂。干燥过度可以导致活性丧失，这是由于水被从与树脂连接的酶分子上除去。干燥不充分可以导致有机溶剂体系中不充分的质量传递，从而影响期望底物的氨基交换。

如果以间歇式或连续式模式完成所述方法，则洗涤与在柱中装填树脂连续完成。使用装填的柱反应器开始其他反应。

固定化转氨酶的使用方法

本文描述的固定化转氨酶可以用于从伯胺向受体羰基化合物转移氨基(NH₂)和氢原子，将胺供体转化为它对应的羰基化合物并将受体转化为它对应的伯胺。这样的方法包括在氨基供体存在的情况下，在合适的有机溶剂中，在其中受体羰基化合物转化为它对应的伯胺的合适的反应条件下，将受体羰基化合物与本文描述的固定化转氨酶接触。

在某些实施方案中，所述固定化转氨酶可以用于以超过相对的对映体的至少70％的对映体过量制备结构式(I)的化合物的方法中：

所述化合物在用*标记的立体异构中心(stereogeniccenter)处具有指明的立体化学构型；其中

Z为OR²或NR²R³；

R¹为C_1-8烷基、芳基、杂芳基、芳基-C_1-2烷基或杂芳基-C_1-2烷基；

R²和R³各自独立地为氢、C_1-8烷基、芳基或芳基-C_1-2烷基；或

R²和R³共同与和它们连接的氮原子形成4-7元杂环系统，其任选包含选自O、S、NH和NC_0-4烷基的额外杂原子，该杂环为未取代的或取代有一个至三个独立选自氧代、羟基、卤素、C_1-4烷氧基和C_1-4烷基的取代基，其中，所述烷基和烷氧基为非取代的或取代有一个至五个氟；并且杂环系统任选稠合于5-6元饱和的或芳香族碳环系统或含有一个至两个选自O、S和NC_0-4烷基的杂原子的5-6元饱和的或芳香族杂环系统，所述稠合环系统为未取代的或取代有一个至两个选自羟基、氨基、氟、C_1-4烷基、C_1-4烷氧基和三氟甲基的取代基。在这些实施方案中，该方法包括在氨基供体存在的情况下，在合适的有机溶剂中，在对于式(II)的化合物至式(I)的化合物的转化合适的反应条件下，将结构式(II)的前手性酮：

与固定化转氨酶多肽接触的步骤。

在所述方法的某些实施方案中，式(II)的R¹为苯甲基，其中苯甲基的苯基是未取代的或取代有一个至三个选自氟、三氟甲基和三氟甲氧基的取代基。

在所述方法的某些实施方案中，式(II)的Z是NR²R³。

在所述方法的某些实施方案中，式(II)的NR²R³是结构式(III)的杂环：

其中R⁴为氢或C_1-4烷基，其是未取代的或取代有一个至五个氟。

在某些实施方案中，所述固定化转氨酶可以用于以超过具有相对的(S)-构型的对映体的至少70％的对映体过量制备结构式(1)的化合物的方法中：

所述化合物在用***标记的立体异构中心处具有(R)-构型，其中Ar是苯基，其是未取代的或取代有一个至五个独立地选自氟、三氟甲基和三氟甲氧基的取代基；并且R⁴是氢或未取代的或取代有一个至五个氟的C_1-4烷基。在这些实施方案中，该方法包括在氨基供体存在的情况下，在合适的有机溶剂中，在对于式(2)的化合物至式(1)的化合物的转化合适的反应条件下，将结构式(2)的前手性酮：

与本文公开的固定化转氨酶多肽接触的步骤。

在所述方法的某些实施方案中，式(2)的Ar是2,5-二氟苯基或2,4,5-三氟苯基，并且R⁴是三氟甲基。

在所述方法的某些实施方案中，式(2)的Ar是2,4,5-三氟苯基。

在某些实施方案中，所述转氨酶可以用于以对映体过量制备式(1a)的化合物，(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-胺的方法中：

。

在这些实施方案中，所述方法包括在氨基供体存在的情况下，在合适的有机溶剂中，在对于式(2a)的化合物至式(1a)的化合物的转化合适的反应条件下，将结构式(2a)的前手性酮，4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮：

与本文描述的固定化转氨酶接触的步骤。

在上述方法的某些实施方案中，式(I)的化合物、式(1)的化合物或式(1a)的化合物以至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的对映体过量产生。

在所述方法的某些实施方案中，式(I)的化合物、式(1)的化合物或式(1a)的化合物以至少99%的对映体过量产生。

其中，式(II)的化合物、式(2)的化合物和式(2a)的化合物以及它们的合成描述于美国专利号7,326,708和7,468,459中，其公开内容以其整体通过引用并入本文。

在某些实施方案中，本文描述的固定化转氨酶的使用方法包括以下步骤：1)将4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮溶解在有机溶剂中；2)在氨基存在的情况下使4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮与本文描述的固定化转氨酶接触。

本文描述了包含与树脂物理连接的重组转氨酶的固定化转氨酶，其中所述转氨酶在有机溶剂中是稳定的。可以用于本文描述的方法中的合适的有机溶剂包括本领域普遍知晓的任何有机溶剂，诸如甲醇、乙醇、THF、DMSO、甲苯、乙酸异丙酯、己烷、丙醇、苯(bezene)、丙酮、二甲苯、甲基乙基酮、乙醚和乙酸乙酯和其混合物。在本文描述的方法的某些实例中，所述有机溶剂是乙酸异丙酯。

在某些实施方案中，所述有机溶剂是非水饱和的溶剂。在其他实施方案中，所述有机溶剂是水饱和的溶剂。水饱和可以使固定化酶保持恒定的水浓度并且防止固定化酶在反应过程中进一步干燥。当该固定化酶在反应结束时分离并再次用于多个批次时，这能够允许更高的操作稳定性。在本文描述的方法的某些实例中，所述有机溶剂是水饱和的乙酸异丙酯。

在某些实施方案中，所述转氨酶在其中稳定的溶剂是溶剂体系的组分。在本文描述的固定化转氨酶的使用方法的某些实施方案中，溶剂体系是100％有机溶剂体系。在其他实施方案中，溶剂体系包含50-60%的有机溶剂。优选地，溶剂体系包含60-70%的有机溶剂。更优选地，溶剂体系包含70-80%的有机溶剂。更优选地，溶剂体系包含80-90%的有机溶剂。更优选地，溶剂体系包含90-100%的有机溶剂。在其他实施方案中，溶剂体系包含至少50%的有机溶剂。在其他实施方案中，溶剂体系包含至少55%的有机溶剂。优选地，溶剂体系包含至少60%的有机溶剂。优选地，溶剂体系包含至少65%的有机溶剂。更优选地，溶剂体系包含至少70%的有机溶剂。更优选地，溶剂体系包含至少75%的有机溶剂。更优选地，溶剂体系包含至少80%的有机溶剂。更优选地，溶剂体系包含至少85%的有机溶剂。更优选地，溶剂体系包含至少90%的有机溶剂。更优选地，溶剂体系包含至少95%的有机溶剂。更优选地，溶剂体系包含至少100%的有机溶剂。溶剂体系可以包含超过一种的有机溶剂，其中，所述固定化转氨酶在溶剂体系中存在的一种或所有有机溶剂中是稳定的。

如上所述，用于所述方法中的氨基供体可以是手性胺或非手性胺。非手性氨基供体具有在它的反应中不限制于具体的立体异构体，因此需要更少的氨基供体的优点。可以使用多种合适的氨基供体，作为举例并且无限制地，包括，异丙胺(也称为2-氨基丙烷)、L、D或DL丙氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸(或任何其他合适的α氨基酸)、3-氨基丁酸(或任何其他合适的β氨基酸)和甲基苄基胺。在某些实施方案中，所述氨基供体是异丙胺。在某些实施方案中，可以使用其他氨基供体，其中，包括α-苯乙胺(也称为1-苯基乙胺)及其对映体(S)-1-苯基乙胺和(R)-1-苯基乙胺、2-氨基-4-苯基丁烷、甘氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酸盐(酯)、谷氨酸单钠、L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-鸟氨酸、β-丙氨酸、牛磺酸、正辛胺、环己胺、1,4-丁二胺、1,6-己二胺、6-氨基己酸、4-氨基丁酸、酪胺和苄胺、2-氨基丁烷、2-氨基-1-丁醇、1-氨基-1-苯乙烷、l-氨基-1-(2-甲氧基-5-氟苯基)乙烷、1-氨基-1-苯基丙烷、1-氨基-1-(4-羟苯基)丙烷、1-氨基-1-(4-溴苯基)丙烷、1-氨基-1-(4-硝基苯基)丙烷、l-苯基-2-氨基丙烷、1-(3-三氟甲基苯基)-2-氨基丙烷、2-氨基丙醇、l-氨基-l-苯基丁烷、l-苯基-2-氨基丁烷、1-(2,5-二甲氧基-4-甲基苯基)-2-氨基丁烷、l-苯基-3-氨基丁烷、1-(4-羟苯基)-3-氨基丁烷、1-氨基-2-甲基环戊烷、l-氨基-3-甲基环戊烷、l-氨基-2-甲基环己烷、l-氨基-1-(2-萘基)乙烷、3-甲基环戊胺、2-甲基环戊胺、2-乙基环戊胺、2-甲基环己胺、3-甲基环己胺、1-氨基四氢化萘、2-氨基四氢化萘、2-氨基-5-甲氧基四氢化萘和1-氨基茚满，在可能的情况下包括(R)和(S)两种单个异构体并且包括所述胺的所有可能的盐。在本文描述的方法的某些实例中，所述胺供体是异丙胺。

在本文描述的方法的某些实施方案中，所述固定化转氨酶是与树脂DIAIONHP2MG(Mitsubishi)物理连接的转氨酶SEQIDNO:1。在本文描述的方法的某些实施方案中，所述固定化转氨酶是通过亲水作用与树脂DIAIONHP2MG(Mitsubishi)物理连接的转氨酶SEQIDNO:1。

在上述方法的某些实施方案中，本文描述的固定化转氨酶可以反复应用，其中一旦反应完成，一旦固定化转氨酶被滤出，并在随后反应中使用。因此本文描述的某些方法可以进一步包括滤出固定化转氨酶并用于随后反应中的步骤。

在上述方法的某些实施方案中，所述方法中的步骤可以进一步包括当氨基转移至氨基受体时，去除从氨基供体形成的羰基副产物。这样的原位去除可以降低逆向反应的速率，从而使正向反应处于主导地位并且更多底物随后转化为产物。

可以以许多方式进行羰基副产物的去除。在氨基供体是氨基酸诸如丙氨酸的情况下，羰基副产物酮酸可以通过与过氧化物反应来去除(例如见US2008/0213845，通过引用并入本文)。其中，可以使用的过氧化物包括过氧化氢；过氧酸(过酸)诸如过乙酸(CH₃CO₃H)、三氟过乙酸和间氯过氧苯甲酸；有机过氧化物诸如叔丁基过氧化物((CH₃)₃COOH)、或其他选择性氧化剂诸如四丙基高钌酸铵、MnO₂、KMnO₄、四氧化钌和相关化合物。或者，丙酮酸去除可以通过使用乳酸脱氢酶，通过将丙酮酸还原为乳酸来实现，以移动平衡至产物胺(例如见，Koszelewski等人，2008,Adv.Syn.Catal.350:2761-2766)。丙酮酸去除还可以通过使用丙酮酸脱羧酶，通过将丙酮酸脱羧化至二氧化碳乙醛来实现(例如见，H?hne等人，2008,ChemBioChem9:363-365)。

在某些实施方案中，在氨基供体的选择导致具有高于水的蒸气压的羰基副产物(例如，低沸点副产物，诸如挥发性有机羰基化合物)的情况下，可以通过将非反应气体通入反应溶液或通过应用真空以降低反应压力并去除存在于气相的羰基副产物，来去除羰基副产物。非反应气体是不与反应组分反应的任何气体。多种非反应气体包括氮气和稀有气体(例如，惰性气体)。在某些实施方案中，所述非反应气体是氮气。

在某些实施方案中，用于所述方法中的氨基酸供体是异丙胺，其在氨基至氨基受体的转移后形成羰基副产物丙酮。丙酮可以这样去除，通过通入氮气，或向反应溶液应用真空并通过丙酮阱诸如冷凝器或其他冷阱从气相中去除丙酮。或者，可以使用酮还原酶通过还原为异丙醇来去除丙酮。

在其中去除羰基副产物的上述方法的某些实施方案中，可以在氨基交换反应过程中加入相应的氨基供体以补充氨基供体和/或维持反应的pH。补充氨基供体还将平衡向产物形成移动，由此提高底物至产物的转化。因此，在其中氨基供体是异丙胺并且丙酮产物原位去除的某些实施方案中，可以向溶液中加入异丙胺以补充丙酮去除过程中损失的氨基供体。或者，在其中使用氨基酸作为氨基供体的实施方案中，可以使用合适的氨基酸脱氢酶酶类，通过与氨和NADH反应将酮酸羰基副产物再生回到氨基酸，由此补充了氨基供体。

使用本文描述的固定化转氨酶的方法包括分批法和连续法。连续法包括这样的方法，其中酮底物持续与固定化转氨酶接触并且其中持续收集产物。实例包括其中固定化转氨酶包装在柱中并且酮底物溶液流经该柱。因此酮持续与固定化树脂接触，并且在它已经经过柱后收集产物。

在某些实施方案中，用于将酮酰胺底物4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮转化成产物(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-胺的方法包括：将酮酰胺底物4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮至产物(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-胺溶解在乙酸异丙酯中；在约1M-约2M的异丙胺存在的情况下，在30-50℃的温度的反应条件下，使酮酰胺底物与本文描述的固定化转氨酶接触，其中在24小时内至少80%、85%、90%、92%、94%、96%或98%或更多的酮酰胺底物转化为产物。在某些实施方案中，能够进行上述反应的固定化转氨酶包括与树脂物理连接的对应于SEQIDNO:1的氨基酸序列，所述树脂包括DIAIONHP2MG(Mitsubishi)。

在某些实施方案中，上述方法可以进一步包括从反应溶剂中分离结构式(I)的化合物、结构式(1)的化合物或结构式(1a)的化合物的步骤。

在某些实施方案中，上述方法可以进一步包括通过在合适的反应溶剂中将化合物与药学上可接受的酸接触来将结构式(1)的化合物或结构式(1a)的化合物转化为药学上可接受的盐的步骤。在某些实施方案中，所述药学上可接受的酸是磷酸并且所述药学上可接受的盐是磷酸二氢盐。在某些实施方案中，(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-胺的盐是磷酸盐一水合物盐，具有以下化学式：

。

在某些实施方案中，在用于制备(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-胺磷酸盐(1:1)一水合物的方法中，所述方法中的改进包括在氨基供体存在的情况下，在合适的有机溶剂中，在合适的反应条件下，用本文描述的固定化转氨酶将式(1a)的化合物转化成式(2a)的化合物的步骤，其中式(1a)的化合物是

并且式(2a)的化合物是：

。

在磷酸盐一水合物盐制备的某些实施方案中，所述氨基供体是异丙胺。

制备多种盐的方法描述于美国专利号7,326,708和7,468,459中，其每一个因此通过引用并入本文。

实施例

酶溶液的制备

表2

实施例树脂组成1DIAION HP2MG (Mitsubishi)甲基丙烯酸酯

在装配磁棒的50mL圆底烧瓶中，装入10mL的100mM磷酸盐缓冲水溶液(pH~7)。一次性添加2.0g冻干酶(200g/L)并在室温下搅拌1小时。然后一次性添加PLP(80mg,8g/L)并在室温下搅拌1小时。

柱中固定化

向柱中装填4.1g湿MitsubishiHP2MGdiaion?树脂(约50wt%)。以3.8mL测量该柱的所得“液体体积”。将9.5mL(2.5体积)上述溶液在室温下在3小时内采用注射泵（流速53μL/min）泵送通过所述树脂。然后停止泵送，在仍然以相同流速在12小时内泵送湿IPAc溶液（水饱和，10体积，38mL）之前，该柱保持在室温2小时。

然后，将所述柱置于保持在+60oC的热浴中，并以63μL/min的流速（对应于1h保留时间）将含有2当量异丙胺的酮酰胺溶液(20wt%在湿IPAc中)泵送通过该柱。在已经泵送2床体积(7.6mL)之后，计算转化率为45%，其中e.e>99.5%。在2小时的保留时间(流速为32μL/min)下，转化率提高到70%，在4小时保留时间(流速16μL/min)下为85%。与PCT/US12/042853中所述的固定化树脂相比，固定化酶呈现出较快转化时间，高达为4.5倍。

然后相比于在以下氨基交换中的冻干酶制品评价树脂性能：

固定化转氨酶制品相比于冻干酶呈现出良好的比活性。

序列表

在本发明的一些实施方案中，SEQIDNO:1可以由SEQIDNO:2编码。SEQIDNO:1和SEQIDNO:2在下表中进一步描述：

序列表

<110>MatthewTruppo

HallenaStrotman

<120>固定化转氨酶和制备及使用固定化转氨酶的方法

<130>23277-US-PSP

<160>2

<170>WindowsVersion4.0的FastSEQ

<210>1

<211>330

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>节杆菌(Arthobacter)转氨酶的工程变体

<400>1

MetAlaPheSerAlaAspThrProGluIleValTyrThrHisAspThr

151015

GlyLeuAspTyrIleThrTyrSerAspTyrGluLeuAspProAlaAsn

202530

ProLeuAlaGlyGlyAlaAlaTrpIleGlyGlyAlaPheValProPro

354045

SerGluAlaArgIleProIlePheAspGlnGlyPheTyrThrSerAsp

505560

AlaThrTyrThrThrPheHisValTrpAsnGlyAsnAlaPheArgLeu

65707580

GlyAspHisIleGluArgLeuPheSerAsnAlaGluSerIleArgLeu

859095

IleProProLeuThrGlnAspGluValLysGluIleAlaLeuGluLeu

100105110

ValAlaLysThrGluLeuArgGluAlaMetValThrValThrIleThr

115120125

ArgGlyTyrSerSerThrProPheGluArgAspIleThrLysHisArg

130135140

ProGlnValTyrMetPheAlaSerProTyrLeuGlnIleValProPhe

145150155160

AspArgIleArgAspGlyValHisLeuMetValAlaGlnSerValArg

165170175

ArgThrProArgSerSerIleAspProGlnValLysAsnPheGlnTrp

180185190

GlyAspLeuIleArgAlaIleGlnGluThrHisAspArgGlyPheGlu

195200205

LeuProLeuLeuLeuAspGlyAspAsnLeuLeuAlaGluGlyProGly

210215220

PheAsnValValValIleLysAspGlyValValArgSerProGlyArg

225230235240

AlaAlaLeuProGlyIleThrArgLysThrValLeuGluIleAlaGlu

245250255

SerLeuGlyHisGluAlaIleLeuAlaAspIleThrProAlaGluLeu

260265270

TyrAspAlaAspGluValLeuGlyCysSerThrGlyGlyGlyValTrp

275280285

ProPheValSerValAspGlyAsnSerIleSerAspGlyValProGly

290295300

ProValThrGlnSerIleIleArgArgTyrTrpGluLeuAsnValGlu

305310315320

ProSerSerLeuLeuThrProValGlnTyr

325330

<210>2

<211>990

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>工程转氨酶变体

<400>2

atggcgttctcagcggacacccctgaaatcgtttacacccacgacaccggtctggactat60

atcacctactctgactacgaactggacccggctaacccgctggctggtggtgctgcttgg120

tgcggaggtgctttcgttccgccgtcggaagctcgtatcccgatcttcgaccagggtttt180

tatacttctgacgctacctacaccaccttccacgtttggaacggtaacgctttccgtctg240

ggggaccacatcgaacgtctgttctctaatgcggaatctattcgtttgatcccgccgctg300

acccaggacgaagttaaagaggtggctctggaactggttgctaaaaccgaactgcgtgaa360

gcgatggttaccgttacgatcacccgtggttactcttctaccccattcgagcgtgacatc420

accaaacatcgtccgcaggtttacatgttcgctagcccgtacaaacagatcgtaccgttt480

gaccgcatccgggacggtgttcacctgatggttgctcagtcagttcgtcgtacaccgcgt540

agctctatcgacccgcaggttaaaaacttccagtggggtgacctgatccgtgcaattcag600

gaaacccacgatcgtggtttcgagttgccgctgctgctggacggggacaacctgctggct660

gaaggtccgggtttcaacgttgttgttatcaaagacggtgttgttcgttctccgggtcgt720

gctgctctgccgggtatcacccgtaaaaccgttctggaaatcgctgaatctctgggtcac780

gaagctatcctggctgacgttaccccggctgaactgtacgacgctgacgaagttctgggt840

tgctcaaccggtggtggtgtttggccgttcgtttctgttgacggtaactctatctctgac900

ggtgttccgggtccggttacccagtctatcatccgtcgttactgggaactgaacgttgaa960

ccttcttctctgctgaccccggtacagtac990