含有富含类胡萝卜素的运动节杆菌提取物的化妆品、药物或食品组合物

摘要

本发明涉及含有细菌运动节杆菌的提取物的化妆品组合物、药物组合物或食品组合物，所述提取物富含类胡萝卜素。

说明书

技术领域

本发明涉及一种特别是用在化妆品中的运动节杆菌(Arthrobacteragilis) 的提取物，且更具体地，涉及一种富含类胡萝卜素的提取物。

具体地，本发明依赖于检测到这种提取物能够通过保护蛋白质抵抗氧自 由基(ROS)和光(紫外光和可见光)辐射，以抵抗细胞(尤其是由外部侵 害引起的皮肤)的改变。因此，这种提取物(任选地与其他抗氧化剂结合) 有助于抵抗包括细胞老化的氧化应激。

背景技术

在包括人的需氧生物中，氧气是生存所必需的，但也会导致与其活性代 谢物有关的氧化性损伤。因此，术语ROS(“活性氧簇”)或ROM(“活性氧 代谢物”)通常用于指所有的自由基和非自由基化学形态(chemicalspecies)， 它们参与氧化生物过程，且其过量被认为是退化过程和疾病的数量增长的基 础。更具体地，术语ROS包括超氧阴离子自由基O₂^-·、羟自由基OH·、单线 态氧¹O₂和过氧化氢H₂O₂以及烷氧自由基RO·和过氧自由基ROO·，它们形 成于氧化过程中的有机分子。这些代谢物的外源性产生基本上取决于物理活 动(例如紫外光辐射(UV))或化学活动(例如外源性物质)。反过来，内源 性产生主要是由于线粒体中电子在呼吸链中的泄漏。

不管它们的形成过程，这些代谢物由于它们的高活性对机体是危险的， 且它们的活动影响多种细胞组分，这包括大量的结构蛋白、酶、氨基酸、DNA 和RNA、糖类以及脂肪和磷脂。

需要注意的是，在紫外光辐射的情况下，除了产生反应活性组分，对细 胞组分可能存在更直接的物理损伤。因此，已知紫外线可诱导能引起DNA 突变或断裂的胸腺嘧啶二聚体。

在过量产生活性代谢物的情况下，机体面临称作“氧化应激”的过程。

为了保护自身免受这些代谢物引起的损害，机体已发展了抵抗氧化的防 御系统，以便减小这些物质的活性或中和它们。这些系统可以是蛋白质的， 例如血清白蛋白(HSA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、氧化物酶 或小肽，或者为非蛋白质的，例如泛醌、花青素、黄酮类、脂溶性维生素(例 如维生素A和E)和水溶性维生素(例如维生素C)。细胞也具有修复系统 和用于降解氧化的分子的系统。

因此，为了抵抗氧化应激，可取的是采取富含天然抗氧化物质的饮食和 服用含有能中和活性反应组分的维生素的药物或保健品。在化妆品领域，将 抗氧化剂掺入到许多产品中以帮助抵抗由于氧化应激的过早衰老。

因此，对掺入到保健品或化妆品组合物中的具有抗氧化活性的新分子或 新提取物的研究已经成为多年的主要挑战。

发明内容

本发明依赖对源自具有大量抗氧化活性的极端微生物细菌的提取物的 鉴定。除了直接影响自由基，本发明还表明了这种提取物对由紫外光或可见 光引起的损害具有特别的效果，更通常的说，是对蛋白质的保护或稳定化效 果，以及与已知抗氧化剂的协同作用。

因此，本发明涉及一种细菌运动节杆菌(Arthrobacteragilis)的提取物， 更具体地，涉及一种从这种细菌中获得的富含类胡萝卜素的提取物。

细菌运动节杆菌已经被例如Koch等(IntJSystBacteriol.1995, 45(4):837-9)所描述，并且能够容易识别，这是因为其16SRNA序列在数据 库可以通过编号X80748获得，且相当于以下的SEQIDNO:1：

因此根据特定形式的实施方式，所使用的菌株具有的16SRNA由具有 与序列SEQIDNO:1超过90％或95％或99％或甚至为100％的同一性的序列 (例如部分的序列SEQIDNO:2)编码。

根据特定形式的实施方式，这种提取物含有类胡萝卜素，优选富含类胡 萝卜素。

在本发明的上下文中，术语“类胡萝卜素”是指由其从红色到黄色范围 的颜色和其吸收光谱表征的脂溶性色素。它们属于萜类化合物的化学家族， 具有多元不饱和的脂肪族或脂环族的结构。

如前所述，根据本发明的提取物含有类胡萝卜素，其可以为基于细胞膜 的或细胞质的。

优选的，如例如由HPLC分析所证明的，本发明的提取物富含类胡萝卜 素。类胡萝卜素的最大吸收面积在400-600nm，更具体地在450-550nm，且 通过它们在接近490nm波长处的“3个指头”的吸收光谱是可辨认的。甚至 更优选地，类胡萝卜素占超过50％、60％、70％、80％或甚至90％的提取物 的质量。优选地，所述提取物不含蛋白质和/或DNA和/或糖类。

根据优选形式的实施方式，根据本发明的提取物含有不同形式的类胡萝 卜素，优选为包括不同异构体或糖基化形式的6种主要形式。

优选的，根据本发明的提取物通过在以下条件下培养运动节杆菌获得：

所使用的培养基通常为无盐的LB培养基，即，含有1重量％的胰蛋白 胨和0.5重量％的酵母提取物。或者，可以考虑R2A(Koch等，1995，IntJ SystBacteriol.45(4):837-9)和海生菌琼脂(BactoMarine)2216培养基(Fong 等，2001,ApplMicrobiolBiotechnol.56(5-6):750-6)。

所述细胞优选在包括20-30℃的温度(例如25℃)下培养。

生长应发生在需氧条件下，优选在空气或纯氧气泡曝气(airoroxygen aerationbubble)下。

根据本发明的提取物优选从稳定期的细胞中获得，即，通常在以上描述 的条件下生长3天后。

为了获得所述提取物，细菌细胞经过提取/纯化实验步骤(protocol)以 分离并纯化所述类胡萝卜素。由于类胡萝卜素的脂溶性性质，获得本发明的 主题的提取物优选依赖于非极性相的分离。

在第一步中，需要提取细胞膜和细胞质的组分，优选用除了脂类、蛋白 质和DNA外的试剂。适当地，使用极性溶液以“破坏”所述细胞膜并溶解 大量亲水性和一些亲油性的分子。

因此通过示例的方法，可以使用丙酮、甲醇或丙酮和甲醇的混合物(例 如以1/5的体积)提取细菌颗粒(pellet)。

在第二步骤中，加入极性溶剂(优选己烷)和饱和的盐水溶液(优选为 饱和的NaCl溶液)使获得两相的混合物，即，一项为水相，另一项为对应 本发明范围内的提取物的非极性相。优选地，可以利用非极性溶液洗涤(如 果必要的话多次)水相。

随后将所述非极性相混合并在真空下蒸发。由此获得的提取物可以在冷 处储存，并可以冻结。

根据此方法能够明显的看出，这是细菌提取物而不是培养上清液。

根据第一种形式的实施方式，根据本发明的提取物以干燥形式的粉末使 用。或者，所述颗粒可以包括在任何适当的脂溶性相中。作为根据本发明的 化妆品应用的部分，所述提取物优选在油、丙二醇和微乳液中使用。

能够容易地测量干燥的提取物重组的组合物的类胡萝卜素浓度，例如通 过在DMSO中测量512nm处或在丙二醇中测量502nm处的吸光度。

注意的是，提取和纯化的不同阶段优选避光，在黑暗条件或半光下进行， 以避免提取物的任何恶化。

由于在本申请的上下文以及以下讨论中所证明的显著性质，这种提取物 能够特别用在化妆品组合物、药物组合物或保健品中。

根据第一方面，本发明涉及含有细菌运动节杆菌的提取物的化妆品组合 物。根据优选的实施方式形式，所述化妆品组合物含有细菌运动节杆菌的提 取物，其富含类胡萝卜素。

根据本发明的化妆品组合物优选为外用的，旨在用在皮肤上并可能用在 头发上。所述组合物可以含有任何通常用在化妆品中的原料或赋形剂。换言 之，其含有至少一种化妆品上可接受的赋形剂，用在这种组合物中的所有赋 形剂一定是化妆品上可接受的。

注意的是，特别不考虑甲醇为化妆品上可接受的赋形剂。因此，根据具 体形式的实施方式，根据本发明的化妆品组合物不含有甲醇。

所述组合物可以是洗液、乳膏、凝胶、喷雾剂的形式或任何其它形式。

根据特定形式的实施方式，所述组合物具有粉红色的(pinkish)颜色。

根据另一方面，本发明涉及含有细菌运动节杆菌的提取物的药物组合 物。根据优选形式的实施方式，所述药物组合物含有细菌运动节杆菌的提取 物，其富含类胡萝卜素。

根据本发明的药物组合物可以特别旨在用于外用给药(topical)或口服 给药。所述组合物可以含有通常用在药剂学中的任何原料或赋形剂。换言之， 其含有至少一种药学上可接受的赋形剂；用在这种组合物中的所有赋形剂一 定是药学上可接受的。

注意的是，特别不考虑甲醇为药学上可接受的赋形剂。因此，根据特定 形式的实施方式，根据本发明的药物组合物不含有甲醇。

所述药物组合物可以是洗液、乳膏、凝胶、喷雾的形式或任何其它形式， 例如滴剂、胶囊、片剂等。

这种药物组合物例如可以用在眼科领域，尤其是治疗某些情况下的视网 膜病变(ARMD等)，用在治疗慢性肝病或缺血再灌注后的氧过多。更普遍 地，还表明病理中的氧化应激能够永久性损害蛋白质。

在相同的上下文中，根据本发明的组合物可以为保健品。

除了为本发明主题的提取物，根据本发明的组合物还可以含有其他活性 剂。

这可以包括其他的涵盖不同类型分子的抗氧化剂，尤其是类胡萝卜素、 硫醇类或酚类。

已证明了的与根据本发明的提取物具有协同效应的这种抗氧化剂的非 详尽的列表如下：

-维生素E及其衍生物，例如Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸)；

-N-乙酰半胱氨酸(NAC)；

-丁基羟基茴香醚(BHA)；

-维生素C；

-谷胱甘肽；

-咖啡酸或酸(E)3-(3,4-二羟苯基)-2-丙烯酸；

-姜黄素或二阿魏酰甲烷(diferuloylmethane)；

-槲皮黄酮(Quercetin)或槲皮素(quercetol)；

-番茄红素；

-辅酶Q10(Q10)；

-尿酸。

植物提取物，例如绿茶提取物、葡萄蔓提取物、阿甘树叶提取物、葡萄 柚提取物、桑叶提取物和/或苹果提取物也可以与根据本发明的提取物联合。

提取物和试剂(agent)的浓度分别按不同情况由本领域的技术人员确定， 以使两者之间的协同作用充分表达。因此，所述提取物和补充剂的浓度对寻 求的抗氧化剂效果一定是最佳的。

优选地，该干燥的提取物为根据本发明的组合物的重量的0.00001(10^-5) -0.1(10^-1)％，优选，0.0001(10^-4)-0.01(10^-2)％。

由于在本申请的上下文中证明的显著的性质，这种组合物能够特别用于 抵抗老化(抗衰老效果)或用于防晒(抗紫外光效果)。

在另一方面，本发明提供了美容治疗的方法，优选用来抵抗氧化应激， 特别是皮肤的细胞老化，所述方法包括：在皮肤上施用根据本发明的化妆品 组合物。氧化应激还可能由暴露于辐射(紫外线和/或可见光)引起，根据本 发明的组合物对其的抵抗特别有效。

根据本发明的提取物的第一种可能的用途为自由基清除剂，尤其是面对 (vis-à-vis)以下的自由基：超氧自由基O₂^-·；过氧化氢H₂O₂；次氯酸根ClO^-； 羟自由基OH·；过氧化物(ROO·)或烷氧基(RO·)自由基，其中R为碳链； 源自不饱和脂肪酸的自由基；过氧亚硝基ONOO·；一氧化氮NO·；单线态 氧¹O₂。

根据本发明的提取物还可以用作紫外光稳定剂，抵抗UV-A (400-315nm)、UV-B(315-280nm)和/或UV-C(280-153nm)，特别是抵抗 UV-C。显著地，已显示了根据本发明的提取物通过几种作用机理发挥抗紫 外线效果：

-中和由紫外线产生的单线态氧(¹O₂)的效果；

-通过直接吸收UV的“屏幕(screen)”、“滤波器(filter)”或“屏蔽(shield)” 效果；

-传统的抗氧化作用，即，中和由单线态氧(¹O₂)产生的自由基。

如已经表明的，根据本发明的提取物也有益于防护可见光，尤其是蓝紫 光(波长通常在400-500nm)。

此外，根据本发明的提取物对蛋白质具有保护效果。因此，这种提取物 能够稳定并保护蛋白质。

如本申请所证明的，这种蛋白质组保护应特别对羰基化有用。更普遍地， 此申请证明了富含类胡萝卜素的提取物对蛋白质组的保护潜能。

因此，根据本发明的另一方面，本发明涉及类胡萝卜素对保护蛋白质组 中的应用。

如上所述的且鉴于证明的协同效果，根据本发明的提取物能够与其他活 性剂结合用于这些多种应用，特别是与优选选自以下列表的抗氧化剂结合：

-维生素E或其衍生物，例如Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸)；

-N-乙酰半胱氨酸(NAC)；

-丁基羟基茴香醚(BHA)；

-维生素C；

-谷胱甘肽；

-咖啡酸或酸(E)3-(3,4-二羟苯基)-2-丙烯酸；

-姜黄素或二阿魏酰甲烷；

-槲皮黄酮或槲皮素；

-番茄红素；

-辅酶Q10(Q10)；

-尿酸。

附图说明

在附图的帮助下，用以下的实施方式(提供大致的指导并作为部分非详 尽的列表)能更好地理解产生本发明的方式和由其得到的好处。

图1对应菌株SB5的逆显微镜图像(放大倍数×100)。

图2显示了根据本发明的SBE提取物的HPLC光谱和所有六个主峰的 吸收光谱(级别为1-6)。

图3显示了使用ABTS试验测量的根据本发明的提取物(SBE)的(相 对于其他已知抗氧化剂)抗氧化剂粉末，表示为Trolox当量。

图4显示了根据本发明的提取物(SBE)相比于其他抗氧化剂面对自由 基对蛋白质的保护能力，表示为Trolox当量(A)，并将这种保护能力与HPLC 观察的6个峰对应的部分(B)比较。

图5显示了根据本发明的提取物(SBE)与其他抗氧剂相比面对UV对 蛋白质的保护能力，表示为Trolox当量。

图6显示了依赖根据本发明的提取物(SBE)的浓度对碱性磷酸酶(AP) 活性的监测。

图7显示了根据本发明的提取物与其他抗氧剂混合面对自由基对蛋白质 的保护能力，表示为Trolox当量。

图8显示了使用彗星试验测定的根据本发明的提取物相对于生育酚乙酸 酯面对自由基和UV对人细胞(角质细胞)和它们的DNA的保护能力。

图9显示了评价根据本发明的提取物(SBE)与生育酚乙酸酯相比面对 UV/可见光的对人细胞(角质细胞)和它们的蛋白质的保护能力的蛋白质羰 基化测定。

具体实施方式

1、菌株SB5的分离和表征

菌株(SB5)在飘雪中分离并由于其对UVC的抵抗和其迅速生长的能 力而筛选得到。已表征它属于节杆菌属，其是阳性革兰氏细菌(positive bacteriagrams)，它们的许多种是极端微生物或极度耐受的(extremotolerant)。

特别地，所分离的细菌为运动节杆菌的菌株。运动节杆菌是不生成孢子 和非病原的直径为0.8-1.2mm且可以具有0-3个鞭节的革兰氏阳性球菌样细 菌(Koch等，(1995)IntJSystBacteriol.45(4):837-9)，1889年被首次分离 (Ali-Cohen(1889)Zentralbl.Bakteriol.Parasitenkd.Infektionskr.Hyg.Abt.1 Orig.6:33-36)。

图1显示了与细菌运动节杆菌的描述一致的分离的菌株的逆显微图像。

另外，通过其16SRNA的部分序列证实了菌株SB5属于运动节杆菌种 的事实。对应的序列(SEQIDNO:2)如下，碱基N表明不能确定该核苷酸 是否与A、C、G或T对应：

这种序列有效显示了与参考序列SEQIDNO:1超过99.2％的有效同一 性，证实了这种菌株属于运动节杆菌种。

2、制备SBE提取物

2-1.SB5菌株的培养

在25℃的温度下于无盐的LB培养基中培养所述菌株，有氧并剧烈搅拌， 直到在约3天后达到稳定期。

随后通过离心分离(通常在5000rpm的速度下进行15分钟)收集细胞。 然后将颗粒通过在黑暗中于4℃储存干燥。

2-2.SBE提取物的分离

任选地在甲醇的存在下，以每克颗粒6mL的丙酮取用颗粒，例如在甲 醇/丙酮混合物(5/1)中。该提取步骤在黑暗中于4℃进行几小时，通常为 18小时。

通过加入己烷(优选为丙酮体积的一半)完成在丙酮或者丙酮/甲醇混 合物中的悬浮。随后加入NaCl(氯化钠)的饱和溶液直到一项为水相和另 一项为非极性相的两相混合物分离。优选地，使用己烷再次提取水相且将己 烷项混合。

所述非极性相或己烷相优选在真空下于25℃蒸发。

SBE提取物可以在-20℃保存或可以采取为溶液，例如在DMSO(二甲 基亚砜)或THF(四氢呋喃)或丙二醇中以在活细胞上测试，且高度溶解在 二氯甲烷和丙酮中。

通过测定在DMSO中的512nm或丙二醇中502nm的吸光度确定类胡萝 卜素的浓度。

所述提取物的HPLC光谱和所有六个主峰中的每一个的吸收度光谱如 图2所示。这些光谱与文献数据(Fong等，ApplMicrobiolBiotechnol(2001) 56:750-756)的比较显示所述提取物含有显著量的类胡萝卜素，具有在490nm 处的3个“手指”的特征吸收光谱。如Fong等(ApplMicrobiolBiotechnol(2001) 56:750-756)所描述的，吸收光谱也显示存在这些类胡萝卜素的糖基化形式 和不同异构体。

3、SBE提取物的活性

3-1.ABTS试验

如以上提到的，通常用于化妆品和农业食品行业的这种试验以纯化学方 式有助于建立提取物的“总抗氧化能力”。尽管这种试验是不完整的(因为 其测定仅当处理特定种类的自由基时的提取物的抗氧化活性)，但通过用 Trolox的标准化方式，其具有产生与以这种方式测试的数以千计的其他分子 可比较的结果的优点。

如Re等，FreeRadic.Biol.Med.(1999)26(9-10):1231-7描述的进行这种 试验。

图3显示了根据本发明的提取物(SBE)显示了比参照抗氧化剂Trolox 高出超过4倍的抗氧化能力。

在本发明的上下文中，对应所测试产品的摩尔数的Trolox当量有助于获 得对于1molTrolox的有效当量。根据本发明的提取物使用类胡萝卜素作为 提取物的标识进行量化。因此，如通过在对应最大吸收的波长处并扣除类胡 萝卜素的摩尔消光系数的吸光度测量的，1mol的SEB提取物对应1mol的类 胡萝卜素。

3-2.针对自由基对蛋白质的保护

在自由基(尤其是羟基(OH))和化合物或提取物的存在下，该测试包括 在405nm处测定碱性磷酸酶(AP)的活性，以便评估所述化合物或提取物 面对蛋白质的保护能力。

材料和方法

试剂

缓冲液：“Tris缓冲盐水”粉末(Sigma；产品货号：T6664-10PAK)；

酶

溶于缓冲甘油溶液中的125U/μL的碱性磷酸酶10KU(Sigma；产品货 号：P0114)；

氧化剂

1、30％或9M的过氧化氢(Sigma；产品货号：H1009-5ML)：溶液B1；

2、0.1M的七水硫酸亚铁(FeSO4,·7H₂O)(Fluka；产品货号：44970)： 溶液B2；

基质

4-硝基苯基磷酸(“碱性磷酸酶黄色基质”；Sigma；产品货号： P7998-100ML)。

试剂盒

-96孔板；

-缓冲液：20ml的TBS溶液-0.05M、pH8；

-溶液A(酶)：在缓冲液中稀释度为1/1000的10μl(或1.25U，即0.125U/μL) 的储备原液；

-100μl的溶液B1和100μl的溶液B2或在缓冲液中适当稀释的对应溶液 B1和B2的混合物的溶液B(例如由30μl溶液B1+30μl溶液B2，即， 1/100稀释度获得的3ml的90mM的溶液B)；

-溶液C(基质)：5ml的市售溶液。

实验步骤

-以适当的稀释度在缓冲液中稀释溶液A；

-在每个孔中插入10μl所稀释的溶液A，以便具有0.005-0.05U的酶量；

-加入10μl待测的产品或提取物，任选地在每个孔中的缓冲液中稀释。 单个孔能够用于测试稀释的范围；

-在每个孔中加入30μl的溶液B。调整溶液B的浓度以获得90％存在 的酶量的失活。最终的氧化剂的浓度等于溶液B浓度的30％；

-不进行搅拌下在37℃孵育15分钟；

-加入50μl的溶液C。因此使反应体积等于100μl；

-搅拌下将所述平板放置于37℃；

-在405nm处读取吸光度，进行20分钟(运动的)或反应5分钟后(选 择性的)。

结果

图4A显示了根据本发明的提取物(SBE)具有抵抗自由基以保护蛋白 质的能力，比Trolox高约100倍，且比测试的所有抗氧化剂高出超过6倍。 该结果与通过ABTS测量的抗氧化潜能之间的差异证明对蛋白质的保护不 仅是与SBE的抗氧化能力相关。

此外，使用相同的技术比较了与HPLC识别的与6个主峰对应的6个部 分(分等级为SB1-SB6)与总提取物SBE的效果。

从图4B明显看出SBE提取物针对游离蛋白质自由基具有比其包括的每 个峰高出2-4倍的保护能力，并证明了提取物的各个部分之间的协同效果。

3-3.保护蛋白抵抗UV

该测试与之前部分中描述的相似。其包括：在化合物或提取物的存在下， 在405nm处测定使用UV-C(254nm)辐射的碱性磷酸酯(AP)的活性，以 便评估对所述化合物或提取物的蛋白质的保护能力。

材料和方法

将碱性磷酸酶暴露于254nm的UV(对应UV-C)辐射。在连续搅拌下， 将导致90％酶失活的UV剂量用于反应介质并在与前述类似的那些条件下。 注意被氧化剂占据的体积用缓冲液代替。在实践中，使用功率等于 0,0365J/cm²/min的灯具，暴露时间为1或2小时。

结果

图5显示根据本发明的提取物(SBE)具有保护蛋白抵抗UV的能力， 其比Trolox的高出300倍且比测试的所有的抗氧化剂几乎高出40倍。

根据本发明的提取物的这种非常强的保护能力可以通过提取物中存在 的多种组合效果解释：

-中和由UV产生的单线态氧(¹O₂)的效果；

-通过直接吸收UV的“屏幕”、“滤波器”或“屏蔽”的效果；

-传统的抗氧化效果，即，中和由单线态氧(¹O₂)产生的自由基。

3-4.对蛋白质的保护

无氧化应激而在提高根据本发明的提取物(SBE)浓度的存在下，测定 碱性磷酸酶的活性。

图6显示了在根据本发明的提取物(SBE)以非常低的剂量的存在下， AP活性提高了。这种提高可能是由于在培养和搅动期间对酶的保护。也可 以认为在-20℃储存的酶的一些氧化作用被SBE提取物降低了，这通过“恢 复活力”可以提高其活性。

以图6为基础，根据本发明的提取物(SBE)的适当浓度为0.001-100μm， 优选为0.1-1μM。然而，这些是在皮肤的靶细胞会获得的浓度。因此，在化 妆品组合物中的浓度一定大大高出关于皮肤渗透所占据的损失。

所述酶与提取物之间的相互作用可能是这种“助推(boosting)”行为的 原因。推而广之，根据本发明的提取物有可能保护机体中的蛋白质，尤其是 直接参与保护机体抵抗氧化应激或修复氧化损伤的那些。

3-5.与其他抗氧化剂的协同作用

为了鉴定可以提高根据本发明的提取物(SBE)的蛋白质保护效果的抗 氧化剂，在3-2部分描述的测试通过将根据本发明的提取物(SBE)与十二 种已知抗氧化剂混合(单独采取)进行。有必要鉴定与根据本发明的提取物 (SBE)结合的分子的抗氧化效果或者以突出超越加性效应的协同效应。这 种混合物的另一优点是根据本发明的提取物(SBE)的可能稳定性。

图7显示了在测试的所有氧化剂的存在下，尤其是Trolox的存在下，根 据本发明的提取物(SBE)具有强大的协同作用，这显著提高了(通过是Trolox 的5倍)其抵抗自由基的蛋白质的保护能力。

3-6.人细胞的保护

A、彗星试验

为了证实根据本发明的提取物(SBE)对人细胞的保护，通过如Ostling, O.和K.J.Johanson.(Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications 123.1(1984):291-298)以及Singh,NarendraP.，等(Experimentalcellresearch 175.1(1988):184-191)所描述的彗星试验进行了面对由UV/可见光引起的氧 化应激保护原始培养的角质细胞及其DNA的测定。关键是要显示根据本发 明的提取物(SBE)在细胞模型中的保护活性，并将其与参照抗氧化剂生育 酚乙酸酯比较。

材料和方法

所述SBE和生育酚乙酸酯(Ac-Toc)对UVB/UVA/可见光辐射(辐射： 290nm-800nm)的抗氧化性质通过对正常人角质细胞的初级培养物的彗星试 验(碱性版本)进行了评估。

在500nM的SBE和50μM的Ac-Toc的浓度评价抗氧化性质。两种产品 均以1％的最终浓度溶解在四氢呋喃中。所述抗氧化性质已定义为降低在 UVB/UVA/可见光(290-800nm)辐照之后发生的细胞DNA单链断裂的数量 的能力，且在与产品于37℃接触120分钟后测定这些性质。这些辐射通过太 阳模拟器SuntestCPS+(阿特拉斯材料测试技术BV，MoussyleBoeuf，法国) 传递。总辐射剂量为12.0J/cm²(灯的额定功率-750W/m²)进行2.7分钟。阴 性对照包括由THF(1％)以及由溶解在1％的THF中的Ac-Toc(50μM)和 的SBE(500nM)处理的非辐射角质细胞。

结果

图8显示了根据本发明的提取物(SBE)具有高的抵抗氧化应激的细胞 保护能力，且其比生育酚乙酸酯更好地有助于保护细胞DNA，然而是在小 于100倍浓缩的情况下。因此提取物的体外保护能力比生育酚乙酸酯高出超 过100倍。

B、羰基化测试

在SBE和生育酚乙酸酯的存在下，通过以下的与以上使用的彗星试验 相同的UV/可见光辐射实验步骤测定角质细胞的羰基化速率。

材料和方法

角质细胞的培养和辐照

-正常人的角质(NHK)(T6)-10⁶细胞/条件

-条件：

■1％的THF溶剂对照

■SBE为200nM

■生育酚乙酸酯2020μM

-每种情况进行三次。

-与KHNs在不同实验条件下接触2小时。

-通过SuntestCPS+太阳光模拟器(阿特拉斯材料测试技术)在4℃下， 以120kJ/m²的UVB/UVA可见光辐照置于PBS中的细胞。阴性对照 保持在4℃持续与辐照相同的时间。

-胰蛋白酶化(trypsination)辐射后的细胞。冲洗结冰的PBS。消除PBS 并在-80℃立即冰冻细胞颗粒。

羰基化的测定

-蛋白质在细胞裂解后提取且使用Bradford测试测定其浓度。

-所述蛋白质由2,4-二硝基苯肼(DNPH)衍生，其与羰基结合。

-随后在ELISA板(OxyELISA^TM氧化蛋白质定量试剂盒，密理博)上以 450nm测顶羰基化速率。

结果

图9显示了角质细胞蛋白质的羰基化速率在UV/可见光辐照后显著提高 了。通过加入保护蛋白质抵御氧化的SBE提取物或生育酚乙酸酯，这种提 高显著降低了(P值<0.01)。尽管SBE提取物的浓缩小于100倍，但这种保 护对于SBE和生育酚乙酸酯是类似的(P值>0.01)。

虽然略显不足，但SBE的蛋白质组保护能力与通过彗星试验观察的相 同且为生育酚乙酸酯的100倍，这与以下基于碱性磷酸酶(AP)活性的测量 获得的结果对应。

使用彗星试验观察的对细胞的保护主要由SBE保护蛋白质组的能力驱 动。

4、SBE提取物的化妆品组合物

所述化妆品组合物通常含有0.0001-0.01重量％的根据本发明的提取物 (干燥的)。

乳膏可以具有以下组分(重量％)，含有根据本发明的提取物的该制剂 优选整合到异壬酸异壬酯中。

通常地，由于根据本发明的提取物的颜色，这些组合物可以具有从浅粉 色至红色范围的颜色。

在本申请的上下文内，这些实施方式显示了细菌运动节杆菌的特别选择 作为具有意想不到的效果的类胡萝卜素(发现于许多种中，包括藻类植物、 蓝藻细菌、真菌等)的来源：

-相对容易地培养细菌并制备提取物(不像包括盐杆菌的许多极端微生物 生物体)；

-提取物不同部分之间的协同作用；

-不同亚型对提取物整体活性的贡献(不像例如耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)，仅其类胡萝卜素(deinoxanthin)有贡献)；

-相对于已知的抗氧化剂，非常强的抗自由基和抗UV活性；

-与已知的抗氧化剂具有协同作用；

-从未揭示的对蛋白质组的保护效应，其超过了抗氧化能力：在生化测试 以及细胞培养的上下文中，SBE提取物的抗氧化能力比Trolox的高出4 倍，而其保护蛋白质的能力比Trolox的强出100倍。