5′RACE RNA接头序列及用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA 5′末端的试剂盒

摘要

本发明提供一种用于5′RACE的高效RNA接头序列，所述接头序列如Seq？ID？No.1所示。本发明还提供含有所述接头序列的用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA？5′末端的试剂盒。本发明通过对市场上5′RACE的RNA接头序列进行优化，使其引物很大程度减少了二聚体和发夹结构的可能性，可以更高灵敏度、更高特异性的扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端序列，从而高效地验证miRNA靶基因的断裂位点，与市场上同类试剂盒产品相比，成本更低，灵敏性更高，准确性更强。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于5′RACE的高效RNA接头序列及用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端的试剂盒，所述RNA接头序列可以扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端序列，从而进行miRNA的靶基因验证。

背景技术

cDNA末端快速扩增技术(rapidamplificationofcDNAends,RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3’末端的有效方法，是根据基因已知的部分序列扩增未知片段的最佳方法。RACE技术概括地说就是通过逆转录和PCR的有机结合，扩增基因未知片段的技术。利用基因编码区3’端的已知序列，获得5’端未知序列的技术称为5’-RACE，是目前扩增5’端未知基因完整编码序列的最常用技术。

5’-RACE基本原理：首先获得包含目的基因mRNA的RNA样品，并利用基因特异的引物进行逆转录，获得目的基因相应的cDNA；在cDNA的3’末端(对应mRNA序列5’末端)加上特定的序列，通常将这段添加在cDNA上的特定序列称为接头(adaptor)，同时合成与adaptor序列相匹配的引物，称为锚定引物；然后利用基因已知序列设计基因特异性引物，与锚定引物配对进行PCR扩增，得到未知部分的片段；再将扩增得到的片段测序，即可获得目的基因未知部分的序列。

目前按接头序列的添加方法可分为3大类：末端转移酶法(terminaldeoxynucleotidyltransferasemethod，TdT方法)、接头连接法(adaptorligation)和寡核苷酸帽法(oligocappingmethod)。

寡核苷酸帽法又称RLM-RACE。真核生物mRNA具有一个3’尾巴和一个5’帽子结构，该技术正是利用5’端的帽子特性对全长分子进行富集和扩增，可以更精确的定位转录起始位点。目前基于该方法的试剂盒有TaKaRa、Clontech和Ambion等厂家都有生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种更高灵敏度、更高特异性的扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA的5′末端的5′RACERNA接头序列。

本发明的另一目的是提供含有上述5′RACERNA接头序列的用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端的试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明提供的用于5′RACE的高效RNA接头序列，所述RNA接头序列为：5'-GCGUGACCACUAGUCACGUCUGAGUUCGUCGCCAUUCCACAAA-3'(SeqIDNo.1)。

本发明还提供含有上述接头序列的用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端的试剂盒。

前述的试剂盒还包括用于巢式PCR的5′RACE外侧引物和5′RACE内侧引物，引物序列如下：

5′RACE外侧引物：5'-ACTAGTCACGTCTGAGTTCG-3'(SeqIDNo.2)

5′RACE内侧引物：5'-CGCGGATCCACGTCTGAGTTCGTCGCCATTCCAC-3'(SeqIDNo.3)

前述的试剂盒还包括T4RNA连接酶、RNA连接酶缓冲液、RNase抑制剂、反转录酶M-MLV、M-MLV缓冲液、dNTPs、Random9mers、RNaseFreedH₂O、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液等中的至少一种。

本发明还提供利用5′RACE扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端序列的方法，包括以下步骤：

1)根据目的基因已知的cDNA序列设计用于巢式PCR的上游外侧特异性引物GSP1和上游内侧特异性引物GSP2；

2)用T4RNA连接酶将5′RACE接头连接到miRNA剪切后的靶mRNA上；

3)以步骤4)的靶mRNA为模板，Random9mers为反转录引物，用反转录酶M-MLV进行反转录合成cDNA；

4)以步骤5)的cDNA为模板，进行巢式PCR反应，用上游外侧特异性引物GSP1和5′RACE外侧引物进行第一轮PCR反应，再用上游内侧特异性引物GSP2和5′RACE内侧引物进行第二轮PCR反应；

5)分析PCR产物。

其中，步骤4)中所述5′RACE接头的序列如下：5'-GCGUGACCACUAGUCACGUCUGAGUUCGUCGCCAUUCCACAAA-3'(SeqIDNo.1)。

步骤4)中所述5′RACE外侧引物和5′RACE内侧引物的序列分别如下：

5′RACE外侧引物：5'-ACTAGTCACGTCTGAGTTCG-3'(SeqIDNo.2)

5′RACE内侧引物：5'-CGCGGATCCACGTCTGAGTTCGTCGCCATTCCAC-3'(SeqIDNo.3)

前述的方法，步骤1)中引物设计原则如下：

①引物长度为20-28nt；

②引物中GC含量为45％-55％，GC、AT分布均匀，避免局部富含GC或AT；

③引物不形成二级结构，与5′RACE外侧引物和5′RACE内侧引物不形成复杂结构；

④引物3′端的3-4个碱基不与配对引物形成互补序列。

前述的方法，步骤2)的具体操作如下：

a)配制反应液I：miRNA剪切后的靶mRNA5μl，15μM5′RACE接头1μl，RNaseFreedH₂O4μl；

b)反应液I于65℃保温5分钟后冰上放置2分钟，然后向反应液I中加入40U/μlRNase抑制剂1μl，5×RNA连接酶缓冲液8μl，40％PEG600020μl，40U/μlT4RNA连接酶1μl，即得反应液II：

c)将反应液II于16℃反应1小时；

d)向c)的反应液中加入20μlpH5.2的3MCH₃COONa，140μl的RNaseFreedH₂O后混匀；

e)向d)的反应液中加入200μl体积比为25：24：1的苯酚/氯仿/异戊醇，混匀后13000g室温离心5分钟，将上层水相转移至新的Microtube中；

f)向e)的反应液中加入200μl的氯仿，混匀后13000g室温离心5分钟，将上层水相转移至新的Microtube中；

g)向f)的反应液中加入2μl的NACarrier后混匀；

h)向g)的反应液中加入200μl的异丙醇，混匀后冰上冷却10分钟；

i)13000g4℃离心20分钟，弃上清；加入500μl的70％冷乙醇漂洗，13000g4℃离心5分钟，弃上清后干燥；

j)加入6μl的RNaseFreedH₂O溶解沉淀，得到LigatedRNA。

前述的方法，步骤3)的具体操作如下：

k)配制反转录反应液：LigatedRNA6μl，50μMRandom9mers0.5μl，5×M-MLV缓冲液2μl，10mMdNTPs1μl，40U/μlRNase抑制剂0.25μl，200U/μl反转录酶M-MLV0.25μl；

l)按如下条件进行反转录反应：30℃10分钟；42℃1小时；70℃15分钟。

前述的方法，步骤4)的具体操作如下：

m)配制第一轮PCR反应液：反转录反应液2-5μl，1×cDNA稀释缓冲液5-8μl，10×PCR反应缓冲液4μl，25mMMgCl₂3μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.25μl，10μM上游外侧特异性引物GSP12μl，10μM5′RACE外侧引物2μl，用dH₂O补足至50μl；

n)按如下条件进行第一轮PCR反应：94℃3分钟；94℃30秒，58℃30秒；72℃1分钟，共28个循环；72℃10分钟；

o)配制第二轮PCR反应液：第一轮PCR反应液1μl，10×PCR反应缓冲液5μl，25mMMgCl₂5μl，2.5mMdNTPs8μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.5μl，10μM上游内侧特异性引物GSP22μl，10μM5′RACE内侧引物2μl，用dH₂O补足至50μl；

p)按如下条件进行第二轮PCR反应：94℃3分钟；94℃30秒，60℃30秒；72℃1分钟，共28个循环；72℃10分钟。

本发明进一步提供所述用于5′RACE的高效RNA接头序列或所述试剂盒在研究miRNA与靶基因相互作用中的应用。

本发明具有以下优点：

(一)本发明通过对5′RACE的高效RNA接头序列进行优化，使其引物很大程度减少了二聚体和发夹结构的可能性，可以更高灵敏度、更高特异性的扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA的5′末端序列。

(二)本发明可以高特异性、高效的验证miRNA靶基因的断裂位点，与市场上同类试剂盒产品相比，灵敏性更高，准确性更强。

附图说明

图1为利用本发明实施例1的试剂盒进行5′RACE的扩增原理图。

图2为植物中miRNA的形成过程与作用方式原理图。

图3为本发明实施例3中利用5′RACERNA接头序列验证miR396d与靶基因isotig01346相互作用的琼脂糖凝胶电泳图。

图4为本发明实施例3中利用5′RACERNA接头序列验证miR408与靶基因24872_gi400019881相互作用的琼脂糖凝胶电泳图。

图5为本发明实施例3中利用5′RACERNA接头序列验证miR399与靶基因76159_gi319841213相互作用的琼脂糖凝胶电泳图。

图6为本发明实施例3中利用5′RACERNA接头序列验证miR156与靶基因isotig01056相互作用的琼脂糖凝胶电泳图。

图7为本发明实施例3中miRNA396d与其靶基因isotig01346相互作用示意图。

图3-图6中，泳道1为TaKaRa公司试剂盒中的接头序列的实验结果，泳道2为2000bp的DNAMarker(D2000Plus)，泳道3为本发明的5′RACERNA接头序列的实验结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端的5′RACE试剂盒

本实施例提供的用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端的5′RACE试剂盒组成如下：

用于RNA处理的反应(10次量)：5′RACEAdaptor(15μM)10μl，T4RNA连接酶(40U/μl)10μl，5×RNA连接酶缓冲液80μl，40％PEG6000200μl，3MCH₃COONa(pH5.2)400μl，NACarrier40μl，RNase抑制剂(40U/μl)32.5μl，反转录酶M-MLV(RNaseH^-)(200U/μl)2.5μl，5×M-MLV缓冲液20μl，dNTPMixture(各10mM)10μl，Random9mers(50μM)5μl，RNaseFreedH₂O2×1ml。

用于5′RACEPCR反应(50次量)：1×cDNA稀释缓冲液II400μl5′RACEOuterPrimer(10μM)100μl，5′RACEInnerPrimer(10μM)100μl。

其中，5′RACEAdaptor及引物序列如下：

5′RACEAdaptor：5'-GCGUGACCACUAGUCACGUCUGAGUUCGUCGCCAUUCCACAAA-3'(SeqIDNo.1)

5′RACEOuterPrimer：5'-ACTAGTCACGTCTGAGTTCG-3'(SeqIDNo.2)

5′RACEInnerPrimer：5'-CGCGGATCCACGTCTGAGTTCGTCGCCATTCCAC-3'(SeqIDNo.3)

此外，需要准备的试剂为：

(1)根据目的基因已知的cDNA序列设计用于巢式PCR的上游外侧特异性引物GSP1和上游内侧特异性引物GSP2。引物设计原则如下：①引物长度为20-28nt；②引物中GC含量为45％-55％，GC、AT分布均匀，避免局部富含GC或AT；③引物不形成二级结构，与5′RACE外侧引物和5′RACE内侧引物不形成复杂结构；④引物3′端的3-4个碱基不与配对引物形成互补序列。

(2)PCR用DNA聚合酶。推荐使用扩增性能良好的TaKaRaLA(TaKaRaCode：DRR02AM)或保真性能极高的PrimeSTAR^TMHSDNAPolymerase(TaKaRaCode：DR010)。

(3)PCR产物克隆试剂(如：T载体等)。

(4)苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)。

(5)氯仿、异丙醇、100％预冷乙醇、70％预冷乙醇。

本试剂盒应于-20℃保存。

利用试剂盒进行5′RACE的扩增原理如图1所示。操作步骤如下：

1、用T4RNA连接酶将5′RACEAdaptor连接到去帽后的mRNA上或经miRNA剪切后的靶mRNA上；

2、以步骤/3的mRNA为模板，Random9mers为反转录引物，用反转录酶M-MLV进行反转录合成cDNA；

3、以步骤/4的cDNA为模板，进行巢式PCR反应，用上游外侧特异性引物GSP1和5′RACEOuterPrimer进行第一轮PCR反应，再用上游内侧特异性引物GSP2和5′RACEInnerPrimer进行第二轮PCR反应；

4、分析PCR产物。

实施例2利用5′RACE扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端序列的方法

利用实施例1的试剂盒对实验样品进行5′RACE。

1、5′RACEAdaptor的连接。

①首先配制下列溶液：miRNA剪切后的靶mRNA5μl，5′RACEAdaptor(15μM)1μl，RNaseFreedH₂O4μl。

②65℃保温5分钟后冰上放置2分钟，然后加入下列试剂：RNase抑制剂(40U/μl)1μl，5×RNA连接酶缓冲液8μl，40％PEG600020μl，T4RNA连接酶(40U/μl)1μl。

③16℃反应1小时。

④向上述反应液中加入20μl的3MCH₃COONa(pH5.2)，140μl的RNaseFreedH₂O后，充分混匀。

⑤加入200μl的苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，充分混匀后13,000×g室温离心5分钟，将上层水相转移至新的Microtube中。

⑥加入200μl的氯仿，充分混匀后13,000×g室温离心5分钟，将上层水相转移至新的Microtube中。

⑦加入2μl的NACarrier后均匀混合。

⑧加入200μl的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10分钟。

⑨13,000×g4℃离心20分钟，弃上清。加入500μl的70％冷乙醇(RNaseFreedH₂O配制)漂洗，13,000×g4℃离心5分钟，弃上清后干燥。

⑩加入6μl的RNaseFreedH₂O溶解沉淀，得到LigatedRNA。

2、反转录反应。

①按下列组份配制反转录反应液：LigatedRNA6μl，Random9mers(50μM)0.5μl，5×M-MLV缓冲液2μl，dNTP(各10mM)1μl，RNase抑制剂(40U/μl)0.25μl，反转录酶M-MLV(RNaseH^-)(200U/μl)0.25μl，总体积10μl。

对于立体结构复杂的基因，应该先将LigatedRNA变性后再进行反转录反应。具体操作为：首先将LigatedRNA和Random9mers的混合物于70℃变性10分钟后，冰上放置2min，再加入反转录反应的其余试剂进行反转录反应。

②反转录反应条件如下：30℃10分钟；42℃1小时；70℃15分钟。

③反应结束后可以进行下一步实验，或将反应液保存于-20℃。

3、第一轮PCR反应：OuterPCR反应。

①按下列组份配制OuterPCR反应液：上述4的反转录反应液Xμl，1×cDNA稀释缓冲液II10-Xμl，10×LAPCR反应缓冲液II(Mg²⁺Free)4μl，MgCl₂(25mM)3μl，TaKaRaLATaq(5U/μl)0.25μl，上游外侧特异性引物GSP1(10μM)2μl，5′RACEOuterPrimer(10μM)2μl，用dH₂O补足至50μl。

②PCR反应条件如下：94℃3分钟；94℃30秒，58℃30秒；72℃1分钟/kb，共28个循环；72℃10分钟。

其中，反转录反应液的推荐使用量X为2μl，使用范围为2-5μl。另外，可根据实际情况适当提高或降低退火温度。一般情况下，延伸时间按1min/kb设定。特殊情况时可适当增加延伸时间。

4、第二轮PCR反应：InnerPCR反应。

①按下列组份配制InnerPCR反应液：OuterPCR反应液1μl，10×LAPCR反应缓冲液Ⅱ(Mg²⁺Free)15μl，MgCl₂(25mM)5μl，dNTPMixture(各2.5mM)8μl，TaKaRaLATaq(5U/μl)，0.5μl上游内侧特异性引物GSP2(10μM)2μl，5′RACEInnerPrimer(10μM)2μl，用dH₂O补足至50μl。

②PCR反应条件如下：94℃3分钟；94℃30秒，60℃30秒；72℃1分钟/kb，共28个循环；72℃10分钟。

其中，可根据实际情况适当提高或降低退火温度。一般情况下，延伸时间按1min/kb设定。特殊情况时可适当增加延伸时间。另外，视实际扩增情况，循环圈数可减少至20-30个循环。

5、琼脂糖凝胶电泳。

反应结束后，取5-10μlPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物。如果此PCR产物需用于以后实验，将PCR产物于-20℃保存。

6、测序分析。

测序时可以采用下述方法：

①PCR产物直接测序。

将5′RACE扩增的PCR产物纯化后直接进行DNA测序。PCR产物的纯化可使用TaKaRa的PCR产物回收试剂盒(TaKaRaCode：DV807A)以及琼脂糖凝胶回收试剂盒(TaKaRaCode：DV805A；D301)。若PCR产物直接测序无法进行时，建议将DNA片段克隆后再进行测序。

②PCR产物克隆测序。

5′RACEPCR产物可以克隆至合适的载体后测序。如使用pMD18-TSimpleVector(TaKaRaCode：D103A)或pMD19-TSimpleVector(TaKaRaCode：D104A)等。测序时应选取插入片段较长的两个以上质粒测序，因为有些基因存在不同的转录起始位点和剪切、拼接方式。

实施例3用于5′RACE的RNA接头序列在研究miRNA与靶基因相互作用中的应用

miRNA具有十分重要的调控功能，它们主要参与基因转录后水平的调控，通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解(植物中较为常见)或抑制其翻译(动物中较为常见)，从而影响了靶mRNA的表达(图2)。

按照实施例2的方法，以茶树品种‘舒茶早’总RNA为实验材料(提取的总RNA中含有miRNA剪切后的靶mRNA)，分别进行以下5′RACE实验，以验证miRNA与靶基因的相互作用。实验设立TaKaRa公司5′-FullRACEkitwithTAP试剂盒作为对照。

其中，植物总RNA的提取按照天根生化科技(北京)有限公司的植物总RNA提取试剂盒说明书进行操作。以下所有miRNA和其靶基因均由茶树中降解组测序得到，再经克隆测序获得准确结果。

1、验证miR396d的靶基因isotig01346，扩增了284bp的5′RACE目的片段(SeqIDNo.4)，其GSP1：5′-ATCAATGAAATGGCGAAGTGG-3′，GSP2：5′-ATGTTGCTTTGGAATGGAGAATG-3′。实验结果见图3。

2、验证miR408的靶基因24872_gi400019881，扩增了173bp的5′RACE目的片段(SeqIDNo.5)，其GSP1：5′-ATAGATGGGATGGGAGCA-3′，GSP2：5′-GCCTTGTTCACACTGACCAC-3′。实验结果见图4。

3、验证miR399的靶基因76159_gi319841213，扩增了215bp的5′RACE目的片段(SeqIDNo.6)，其GSP1：5′-GCTTGATAGAATGTTACTGGC-3′，GSP2：5′-ATTACCAACACTCCATGTCTTCT-3′。实验结果见图5。

4、验证miR156的靶基因isotig01056，扩增了153bp的5′RACE目的片段(SeqIDNo.7)，其GSP1：5′-GTTAGGAAGGAAGTGACTGAAT-3′，GSP2：5′-TGCTCAGTCTGCCAATAGTCT-3′。实验结果见图6。

从图3-图6可以看出，采用本发明的用于5′RACE的RNA接头序列进行miRNA与靶基因相互作用的验证，效率高于TaKaRa公司5′-FullRACEkitwithTAP试剂盒中的接头序列。

以miRNA396d与其靶基因isotig01346相互作用为例，二者相互作用的示意图如图7所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。