一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用

摘要

本发明涉及一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用，步骤如下：将转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶与对硝基苯-N-乙酰-β-已糖胺和乳糖溶液混合，配制成反应体系，反应后，终止，纯化，制得N-乙酰已糖胺寡糖。该方法所需要的底物价格便宜，易于获得，且反应条件温和，操作简便，大大降低了N-乙酰已糖胺寡糖的生产成本，适合于GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc和GalNAcβ1-3Galβ1-4Glc的规模化合成，具有潜在的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用，特别涉及一种 β-N-乙酰氨基已糖苷酶专一性合成N-乙酰已糖胺寡糖的应用，属于糖苷酶应用技术领域。

技术背景

β-N-乙酰氨基已糖苷酶(β-N-acetylhexosaminidases，EC.3.2.1.52)是一类重要的糖苷水 解酶，催化β-N-乙酰氨基已糖苷键的水解，广泛分布于细菌、真菌，植物和动物中，根据氨 基酸序列同源性归属于糖苷酶家族GH3、GH20和GH84(http://www.cazy.org/)。其中，细 菌来源的β-N-乙酰氨基已糖苷酶在三个家族中均有分布，真核生物来源的主要属于GH20。 该类酶既可以水解简单的β-N-乙酰氨基已糖苷，也可以作用于含β-N-乙酰氨基已糖苷键的大 分子，如多糖、糖蛋白和糖脂。此外，某些β-N-乙酰氨基已糖苷酶不仅具有水解功能，在体 外合适的反应条件下还具有转β-N-乙酰氨基已糖苷的活性，合成重要N-乙酰氨基已糖苷化 合物，应用于基础研究、农业和医药等领域，但目前报道的酶转糖基区域选择性不严格，合 成产物存在同分异构体，不利于产物纯化，并且产物产量很低。

N-乙酰已糖胺寡糖的合成具有重要意义，如寡糖GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(即lacto-N-triose II)是存在于母乳低聚糖和很多血型抗原中的糖链结构，但目前糖苷酶法合成产率很低，不 超过10％；寡糖GalNAcβ1-3Galβ1-4Glc是血型P抗原的类似物，但目前糖苷酶法合成还是空 白。由于现有的合成方法均存在局限性，使得N-乙酰已糖胺寡糖的商品价格一直非常昂贵， 需要寻找新的酶源和经济有效的合成方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种β-1,3区域选择性专一的高效转糖基β-N-乙酰氨 基已糖苷酶的应用。

发明概述

本发明的技术要点是利用区域选择性专一的β-N-乙酰氨基已糖苷酶以对硝基苯-N-乙酰 -β-D-已糖胺为糖基供体，以乳糖为受体，一步转糖基反应高效合成单一的N-乙酰已糖胺寡 糖产物。

发明详述

一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用，所述转糖基β-N-乙酰氨基 已糖苷酶的表达基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

上述应用，步骤如下：

将转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶与对硝基苯-N-乙酰-β-D-已糖胺和乳糖溶液混合，配制 成反应体系，在45～55℃条件下，反应1.5～4h，终止反应，纯化，制得N-乙酰已糖胺寡糖。

根据本发明优选的，所述转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的制备方法如下：

(1)将核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的基因序列插入质粒pET-21b中，转化大肠杆 菌BL21(DE3)，制得重组大肠杆菌；

(2)将步骤(1)制得的重组大肠杆菌经扩大培养，再经过诱导培养后，收集细胞，细 胞破碎、纯化，制得转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶。

经检测，转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。该转糖基 β-N-乙酰氨基已糖苷酶单亚基分子量为170kDa，专一性水解β-N-乙酰氨基已糖苷键，以对 硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为底物时，最适pH为5.0～7.0，在pH4.0～11.0范围内稳定，适 宜的反应温度为45℃～55℃，在低于55℃时稳定；Zn²⁺和Hg²⁺显著抑制酶活，NH₄⁺、Na⁺、 Mg²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、K⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ca²⁺对酶有激活作用，EDTA对酶活性没有抑 制作用。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(1)中，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的基因 序列以两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)JCM1254的基因组DNA为模板，经PCR扩 增获得，PCR引物核苷酸序列如下所示：

引物F：5’-agtcaagcttagcgatgacaatcttgcact-3’

HindIII

引物R：5’-atatctcgagggcgacctcgtcaggcgtgt-3’

XhoI

PCR体系如下(总体积100μL)：

10×PCRbuffer10μL，2.5mmol/LdNTP8μL、20μmol/L引物各2μL、100ng/μL模板1μL、 5U/μLTaKaRaLATaq酶1μL，超纯水76μL。

PCR扩增程序如下：

95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸5分钟，反应30个循 环；72℃延伸10分钟。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(2)中，扩大培养条件为：37℃、150～180r/min 培养至OD₆₀₀为0.4～0.6。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(2)中，扩大培养基为LB培养液，配制方法如 下：

蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl7g/L、pH7.0，121℃灭菌20分钟。

更优的，所述扩大培养基还包括浓度为40～60μg/mL的氨苄霉素。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(2)中，诱导培养为在扩大培养后，向培养液中 加入IPTG，使培养液中IPTG的浓度为0.5mM～1mM，在25～28℃、100r/min继续过夜培 养。

根据本发明优选的，所述反应体系中，对硝基苯-N-乙酰-β-D-已糖胺的反应浓度为10～ 20mM，乳糖反应浓度为300～400mM，pH为5.0～6.0。

根据本发明优选的，所述反应体系由浓度为50mM的磷酸钠缓冲液配制，pH为5.8。

根据本发明优选的，所述纯化采用柱层析进行纯化。

有益效果

本发明提供了一种区域选择性专一的β-N-乙酰氨基已糖苷酶高效合成N-乙酰已糖胺寡 糖的方法，所采用的β-N-乙酰氨基已糖苷酶在以乳糖为受体底物的反应体系中专一性合成 GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc或GalNAcβ1-3Galβ1-4Glc，获得单一寡糖产物，不存在其他异构产 物的干扰，避免了异构体纯化的复杂步骤，真正适合于N-乙酰已糖胺寡糖的规模化合成及 分离制备纯品，具有潜在的应用前景。

附图说明

图1为本发明制备的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶电泳图；

其中，M、分子量标准；1、含β-N-乙酰氨基已糖苷酶的重组菌的粗细胞酶液；2、对照 重组菌的粗细胞酶液；3、纯化转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶；

图2为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺为供体 合成产物的质谱；

图3为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺为供体 合成产物的核磁氢谱图；

图4为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺为供体 合成产物的核磁碳谱图；

图5为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为供体 合成产物的质谱；

图6为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为供体 合成产物的核磁氢谱图；

图7为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为供体 合成产物的核磁碳谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源

两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)JCM1254来源于日本微生物菌种保藏中心(Japan CollectionofMicroorganisms)；

质粒pET-21b购自Novagen公司。

实施例1

一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用，步骤如下：

1.β-N-乙酰氨基已糖苷酶的制备

根据两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)JCM1254预测的β-N-乙酰氨基已糖苷酶基 因序列(GenBankAccessionNo.AB504521.1)设计引物F和引物R：

引物F：5’-agtcaagcttagcgatgacaatcttgcact-3’

HindIII

引物R:：5’-atatctcgagggcgacctcgtcaggcgtgt-3’

XhoI

以两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)JCM1254的基因组为模板，PCR扩增β-N- 乙酰氨基已糖苷酶基因片段，PCR体系如下(总体积100μL)：

10×PCRbuffer10μL，2.5mmol/LdNTP8μL、20μmol/L引物各2μL、100ng/μL模板1μL、 5U/μLTaKaRaLATaq酶1μL，超纯水76μL。

PCR扩增条件为：

95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸5分钟，反应30个循 环；72℃延伸10分钟。

将纯化的PCR产物加入与HindIII和XhoI37℃双酶切3小时，16℃过夜连接到同样双 酶切处理的质粒pET-21b载体上，构建重组质粒。采用CaCl₂转化法转化宿主菌大肠杆菌 DH5α，转化菌液涂布氨苄霉素LB平板，37℃过夜培养，挑取阳性生长菌菌落，提取质粒 验证，测得核苷酸序列见SEQIDNo.1。

将获得的含有重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于LB培养液，37℃，180r/min 培养至OD₆₀₀约0.8，加入终浓度0.5mMIPTG，25℃、100r/min过夜诱导，离心收集细胞， 用pH7.0、50mmol/L磷酸钠缓冲溶液重新悬浮菌体，并置于冰水浴中，超声波破碎细胞壁 20分钟，12000r/min离心30分钟，上清液通过镍亲和层析纯化获得电泳纯重组酶，SDS-PAGE 显示重组酶单亚基分子量约为170kDa(如图1所示)。

2.β-N-乙酰氨基已糖苷酶的性质研究

研究了重组β-N-乙酰氨基已糖苷酶的酶学性质，该酶专一性水解β-D-N-乙酰氨基已糖 苷键，对对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺的水解活性高于对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺。

在适当的温度范围(30℃～70℃)内，每5℃为一个梯度测定酶在该温度下的相对酶活。 结果表明：酶适宜反应的温度为45℃～55℃，最适反应温度为55℃。将酶在上述温度梯度 下保温30min后测定相对酶活。结果表明：酶在55℃以下比较稳定，55℃以上失活较快， 70℃失去所有的酶活。

用不同pH的缓冲液配制酶反应体系，测定相对酶活，结果表明：酶适宜反应的pH范 围比较广，为pH4.5～8.0，最适反应pH为5.0～7.0；酶在不同pH的缓冲液中4℃保存24 小时，测定相对酶活，结果表明酶在pH4.0～11.0范围内稳定。

以对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为底物，在酶活测定反应体系中分别加入终浓度为 1mmol/L的各种金属离子，10mmol/L的EDTA，测定相对酶活。结果显示，Zn²⁺和Hg²⁺显 著抑制酶活，NH₄⁺、Na⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、K⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ca²⁺对酶有激活作用， EDTA对酶活性没有抑制作用。

上述酶活测定方法为：50μL稀释一倍的纯酶与450μL、2mmol/L的糖苷底物溶液混合， 于37℃反应10分钟，加1mL、0.5mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应，测定OD₄₀₀。

上述不同pH缓冲液分别为：醋酸－醋酸钠缓冲液pH3.6～5.0；磷酸氢二钾－磷酸二氢 钾缓冲液pH5.5～8.5；甘氨酸－氢氧化钠缓冲液pH8.7～10.6；碳酸氢钠－氢氧化钠缓冲液 pH10.0～11.0。

3.β-N-乙酰氨基已糖苷酶催化合成寡糖GalNAcβ1-3Galβ1-4Glc

将重组β-N-乙酰氨基已糖苷酶在以对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺为糖基供体，乳糖为 糖基受体进行转糖基反应。研究了转糖基反应条件如糖基供体底物浓度(5-30mM)、糖基受 体底物浓度(100-400mM)、pH(3.6-12.0)、反应温度(35℃-60℃)和时间(1-14h)对转 糖基产物产率的影响，对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺10mM、乳糖400mM时45℃反应4h 产物产率达到最高。将反应产物煮沸10min终止反应，于12000r/min离心10min，取上清液 进行薄层层析分析，结果显示反应产物为单一寡糖，高效液相色谱定量分析产物产量为 55.4％。进一步对产物采用Bio-gelP2柱层析进行纯化，质谱和核磁共振分析鉴定其结构为 GalNAcβ1-3Galβ1-4Glc(图2、图3、图4)。

上述薄层层析条件如下：

薄层层析板点样，在展层剂(正丁醇:无水乙醇:水＝5:3:2)中展开，雾喷显色剂(苯胺、 二苯胺、磷酸)，于86℃烘烤10分钟，糖斑点显色后，产物单一。

上述高效液相色谱分析所用设备及条件如下：

安捷伦(Agilent)1200型高压液相色谱仪；安捷伦G1314B紫外检测器；WatersSpherisorb NH₂分析柱(4.6×250mm)；流动相为乙腈/水(72：28，v/v)；流速为1.0mL/min，柱温30℃； 结果分析软件为AgilentChemstationB.04.01版。反应液按1：1.5(v/v)的比例加水稀释， 煮沸离心后上清用0.22μm的滤膜过滤后，进样分析。

4.β-N-乙酰氨基已糖苷酶催化合成寡糖GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc

将重组β-N-乙酰氨基已糖苷酶在以对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为糖基供体，乳糖为 糖基受体进行转糖基反应。研究了转糖基反应条件如糖基供体底物浓度(5-40mM)、糖基受 体底物浓度(100-400mM)、pH(3.6-12.0)、反应温度(35℃-60℃)和时间(10-300min) 对转糖基产物产率的影响，结果表明酶在对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺20mM、乳糖400mM 时，55℃反应90min产物产率达到最高。将反应产物煮沸10min终止反应，于12000r/min 离心10min，取上清液进行薄层层析分析，结果显示反应产物为单一寡糖，高效液相色谱定 量分析产物产量为44.9％，进一步对产物采用Bio-gelP2柱层析进行纯化，质谱和核磁共振 分析鉴定其结构分别为GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(图5、图6、图7)。

薄层层析条件及高效液相色谱分析所用设备及条件同3。