一种预测非甾体抗炎药类新型污染物对斑马鱼早期生活阶段胚胎毒性的方法

摘要

本发明公开了一种预测非甾体抗炎药类新型污染物对斑马鱼早期生活阶段胚胎毒性的方法。本发明通过将斑马鱼胚胎暴露于呈等对数间距浓度的非甾体抗炎药类新型污染物中，记录暴露7天后斑马鱼胚胎的死亡率和畸变率；然后利用SPSS软件计算得到对应的LC50和致畸EC50用于评价非甾体抗炎药类新型污染物的毒性。本发明方法实现了对非甾体抗炎药类新型污染物的毒性特征和毒性水平进行分析测试和定量描述，同时可作为非甾体抗炎药污水生物毒性监测和评价的指标，可为水体中这类污染物的潜在生态毒性风险预测与评估提供参考。

说明书

技术领域

本发明属于环境毒理学技术领域，具体涉及一种预测非甾体抗炎药类新型污染物对斑马 鱼早期生活阶段胚胎毒性的方法。

背景技术

广泛使用的非甾体抗炎药(NSAIDs)在为人类减轻病痛的同时，也带来诸多环境污染和 危害，较低浓度暴露即会对水生生物造成不良影响，而且还可能通过协同、相加等相互作用 导致大量混存时的联合毒性增强，潜在风险不容忽视。然而，目前有关非甾体抗炎药的毒理 研究仍主要集中在实验室内模拟的短期高剂量暴露下的急性毒性方面，对其实际环境水平暴 露时所可能引起的毒性则研究较少，但非甾体抗炎药的急性毒性数据往往远高于其实际检出 浓度(100-1000倍)，并且其在水体中通常是大量多种混存、共同作用，情况较为复杂，因此， 为了避免高估甚至低估非甾体抗炎药的毒害风险，提高准确度和有效性，应重点加强对这类 污染物的低剂量慢性毒性研究以及对更敏感生物体、生物体早期更敏感生活阶段的致毒作用 和潜在风险研究。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中常规理化指标不能反映实际环境中低剂量非甾体抗炎药 类新型污染物的毒性的问题，提供一种预测非甾体抗炎药类新型污染物对斑马鱼早期生活阶 段胚胎毒性的方法，从而实现对非甾体抗炎药类新型污染物的毒性特征和毒性水平进行分析 测试和定量描述。

本发明的预测非甾体抗炎药类新型污染物对斑马鱼早期生活阶段胚胎毒性的方法，包括 以下步骤：

a.将待测的非甾体抗炎药类新型污染物配制成呈等对数间距浓度的试验溶液，将斑马鱼 胚胎暴露于试验溶液中半静态培养；

b.记录暴露7天后斑马鱼胚胎的死亡率和畸变率；

c.根据步骤b得到的数据计算得到对应的LC₅₀和致畸EC₅₀。

所述的步骤a的斑马鱼胚胎为受精后不超过8h的斑马鱼胚胎。

所述的步骤a的斑马鱼胚胎暴露于试验溶液中半静态培养，是在温度为25±1℃、光照 周期为14h光照∶10h黑暗条件下培养，在暴露开始第二天每隔24h更换原试验溶液体积 3/4的新鲜试验溶液。

所述的步骤b的死亡率，死亡情况判断标准包括：静止不动、无呼吸运动、无心脏跳动、 中枢神经系统呈白色不透明或/和对机械刺激无任何反应。

所述的步骤b的畸变率，畸变类型判断标准包括：卵凝结、发育停滞、心包囊肿、卵黄 囊肿、脊柱弯曲或/和尾部畸变(尾折)。

本发明方法采用斑马鱼早期生活阶段胚胎的体内试验方法，来测定评估非甾体抗炎药类 新型污染物对斑马鱼胚胎的毒性作用，判断这类污染物对斑马鱼及其胚胎是否具有毒性的依 据为：

1、利用半静态实验方式，测定得到非甾体抗炎药类新型污染物在不同浓度水平不同暴露 时间内对斑马鱼及其胚胎的毒性效应，具体包括致畸(卵凝结、发育停滞、心包囊肿、卵黄 囊肿、脊柱弯曲或/和尾部畸变(尾折))和致死效应，并通过计算半致死性浓度(50％Lethal concentration，LC₅₀)和半数致畸效应浓度(50％Effectconcentration，EC₅₀)来对毒性进行描 述与表征；

2、参照欧盟委员会所划分的污染物对于水生生物的风险等级(EUDirective93/67/EEC， 1996)：EC₅₀<1mg/L表示非常有毒；1mg/L<EC₅₀<10mg/L表示有毒；11mg/L<EC₅₀<100 mg/L表示有害)进一步对比评估非甾体抗炎药类新型污染物对斑马鱼及其胚胎的致毒级别， 并推测这类污染物在低水平暴露环境下因生物累积和生物放大等效应所可能导致的对水生生 物的毒害作用及生态安全风险。

本发明方法可以对非甾体抗炎药类新型污染物的毒性特征和毒性水平进行分析测试和定 量描述，解决常规理化指标不能反映的典型非甾体抗炎药污水生物毒性，同时可作为非甾体 抗炎药污水生物毒性监测和评价的指标，可为水体中这类污染物的潜在生态毒性风险预测与 评估提供参考。

附图说明

图1是经双氯芬酸染毒后的斑马鱼胚胎非致死性效应。其中，A是尾部畸变(尾折)，B 是脊柱弯曲，C是卵黄囊肿，D是心包囊肿。

图2是经双氯芬酸染毒后的斑马鱼胚胎致死性效应。其中，A是胚胎死亡，B是幼鱼死 亡。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商 的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

实施例1：三种典型非甾体抗炎药类新型污染物(双氯芬酸、醋氨酚和布洛芬)对斑马 鱼早期生活阶段胚胎毒性效应评估

(1)预试验

实验前先挑选活泼健康的短尾斑马鱼雌雄成鱼(1∶1)放入曝气24h后的自来水水槽中， 保持水槽温度26±1℃左右。为了防止鱼自食其卵，放纱网于水槽中，然后盖上纸箱避光。 并于次日早晨捞出亲鱼，用虹吸的方法收集胚胎于大烧杯中。在解剖显微镜下挑选正常发育、 形态完好的胚胎；分裂正常的胚胎不粘沉并且呈现透明，未受精胚胎粘沉呈乳白色，未受精 胚胎不分裂或者分裂形状明显不规则(不均衡或水肿)或卵膜坏损或者黑色。

毒性效应评估实验开展前先进行预实验以确定双氯芬酸、醋氨酚和布洛芬三种目标化合 物对斑马鱼胚胎的全致死和全存活浓度范围(加标组5浓度2水平)，具体设置为：双氯芬酸 暴露浓度0.30、1.20、4.80、19.2、76.8mg/L；醋氨酚暴露浓度0.05、0.20、0.80、3.20、12.8 mg/L；布洛芬暴露浓度0.20、0.80、3.20、12.8、51.2mg/L。此外，实验开始前会先繁殖斑马 鱼数次，以便观察正常胚胎发育并统计胚胎的孵化率，胚胎孵化率达到90％以上方可进行实 验。胚胎暴露实验在恒温光照培养箱中进行，保持温度为25±1℃左右，光照周期为14h光 照∶10h黑暗。选用玻璃平板(9cm培养皿)作为染毒实验容器，加入20mL试验试液和12 枚胚胎。采用半静态法，即在实验开始第二天每隔24h更换新鲜同等浓度溶液，更换体积可 达容器容量的1/2。胚胎连续暴露7天，每隔24h进行观察和数据统计，并及时更换新鲜同 等浓度溶液。每次所更换的实验溶液均由同一母液现配得到。在倒置显微镜下观察并记录斑 马鱼胚胎暴露24、48、72、96、120、144和168h(即共7天)的存活、发育和畸变情况， 如呼吸急促、不协调的游动、反常的静止和异常的摄食等，并及时移走和清除死亡的胚胎和 畸形个体。试验结束时，对每个试验容器所有存活的鱼逐尾测量鱼体体长(若鱼在测量鱼体 体长时过度活跃，则用鱼安定对鱼进行安乐死)并称量干重(60℃烘24h)。

对选取的各效应参数进行分析，如果暴露组与空白对照组差异显著，即0.01<P<0.05或 者P<0.01时，则认为非甾体抗炎药类新型污染物具有亚急性生物毒性，该对应的效应参数 可以用于评价非甾体抗炎药类新型污染物对斑马鱼早期生活阶段胚胎的毒性；若暴露组与空 白对照组差异不显著，则认为非甾体抗炎药类新型污染物无亚急性生物毒性，该对应的效应 参数不用于评价非甾体抗炎药类新型污染物对斑马鱼早期生活阶段胚胎的毒性。由此筛选得 到可以用于评价非甾体抗炎药类新型污染物对斑马鱼早期生活阶段胚胎的毒性的效应参数 为：致死性效应参数为死亡率，死亡情况判断标准：静止不动、无呼吸运动、无心脏跳动、 中枢神经系统呈白色不透明、对机械刺激无任何反应；非致死性效应参数主要针对致畸毒性 效应，包括卵凝结、发育停滞、耳石及眼点异常、无自主运动、心包囊肿、卵黄囊肿、脊柱 弯曲、白化、色素沉淀、游囊关闭、脑发育不良和尾部畸变(尾折)，筛选后比较敏感的致畸 毒性效应参数包括：卵凝结、发育停滞、心包囊肿、卵黄囊肿、脊柱弯曲和尾部畸变(尾折)。

由统计的斑马鱼胚胎存活结果，分析得到：暴露7天后双氯芬酸、醋氨酚和布洛芬三种 目标化合物对斑马鱼胚胎的全致死浓度分别为57.6、118和88.7mg/L，全存活浓度分别为0.30、 0.05和0.20mg/L。

(2)毒性效应评估实验

参照预实验结果，按照等对数间距方式设置毒性效应评估实验浓度梯度。每种非甾体抗 炎药类化合物设计5个染毒组和1个空白对照：双氯芬酸暴露浓度为0.50、1.50、4.50、13.5和 40.5mg/L；醋氨酚暴露浓度为0.08、0.24、0.72、2.16和6.48mg/L；布洛芬暴露浓度组0.40、 1.20、3.60、10.8和32.4mg/L。受试生物为受精后不超过8h的斑马鱼胚胎，具体实验条件及 操作与预实验相同，仍然采用半静态方式；不同的是，每个培养皿加入40mL的试验溶液和12 枚胚胎，每次更换3/4试验溶液(30mL)，用烧杯收集换掉的旧溶液，以便用于测定溶解氧(不 能低于空气饱和值的60％)、pH，以及浓度分析测定。由此，观察得到斑马鱼胚胎的存活、发 育和畸变效应参数结果，利用SPSS软件计算效应参数结果对应的半致死性(50％Lethal concentration，LC₅₀)和半数(50％Effectconcentration，EC₅₀)效应浓度，结果为：暴露7 天后，双氯芬酸、醋氨酚和布洛芬对斑马鱼胚胎的半致死性毒性效应浓度LC₅₀分别为5.19、 6.18和5.31mg/L；对斑马鱼胚胎的半数致畸毒性效应浓度EC₅₀分别为1.48、2.99和1.93mg/L。

实验结果表明，三种非甾体抗炎药类污染物中，双氯芬酸毒性最强，布洛芬次之，醋氨 酚最弱，也即斑马鱼胚胎在相同暴露时间内对双氯芬酸最敏感，受毒害程度最重，这与现有 理论相符合。经双氯芬酸染毒后的胚胎出现严重的发育阻滞和神经管缺损，突出表现为尾部 畸变或尾折(图1A)、脊柱弯曲(图1B)、卵黄囊肿(图1C)、心包囊肿(图1D)等非致 死性效应以及胚胎死亡(图2A)和幼鱼死亡(心跳停止)(图2B)等致死性效应，严重影 响早期器官的形成和胚胎的进一步生长发育，其中最高浓度(40.5mg/L)甚至100％致畸致 死。

另一方面，也就毒性敏感性对效应终点参数进行了优化与筛选：致畸效应>致死效应，体 长和体重均相对不敏感，受非甾体抗炎药类污染物的影响较小；所以在实践中，优选采用致 畸效应参数和致死效应来对非甾体抗炎药类新型污染物对斑马鱼早期生活阶段胚胎的毒性进 行评价。

毒害性有机污染物对生物体的胁迫作用往往呈现出一定的“浓度-效应”关系和“时间- 效应”关系，推测随着暴露时间延长，环境中痕量甚至超痕量(ng/L或μg/L)的NSAIDs很 可能会由于生物累积和生物放大等效应导致对水生生物毒害性增强，潜在风险不容忽视，鉴 于这种“长效低毒”的特点，也有必要对其生殖毒性、神经毒性和内分泌影响等进行深入研 究。