滑菇多糖的乙醇醇析分级制备方法

摘要

本发明公开了一种滑菇多糖的乙醇醇析分级制备。本发明利用水提法经酶处理所得滑菇多糖溶液是多种不同分子量的多糖的混合组分，根据以上乙醇分级沉淀原理，向滑菇多糖的水溶液中逐次加入一定体积分数的乙醇，便可以逐级沉淀出分子量由大到小的多糖，具体是：首次在滑菇水提取液加入1:1(溶液:乙醇＝1:1)，之后每次按如下比例逐次对下层多糖依次加入1:1、1:2、1:3和1:5(溶液:乙醇)的乙醇进行分级醇析多糖。本方法将滑菇多糖通过多步醇析分级制备，简单方便经济，制备过程多糖损失少，而且醇析后的多糖纯度完全能达到各级多糖的功能研究、制作食品饮料和食品营养添加剂等用途的要求。

说明书

技术领域

本发明属食品领域，涉及一种滑菇(Pholiotanameko)多糖乙醇醇析分级制备的方法。

背景技术

滑菇(Pholiotanameko)，又名真珠菇、滑子蘑，担子菌纲，散菌目，盖球菇科，磷伞属。 滑菇因菌盖表面有粘液而得名，滑菇口味鲜美，营养价值高，在世界上享有较高声誉，是当 今世界第五、日本第三的食用菌品种，是食用、药用兼备的食用菌新秀。滑菇中含有对肿瘤 起抑制作用的多糖物质，并可预防葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎杆菌、结核杆菌的感染。

分级沉淀法是指在混合组分的溶液中加入能与该溶液互溶的溶剂，改变混合组分溶液中 某些组分的溶解度，使其从溶液中逐步析出。当在含有溶质的水溶液中加入一定量的乙醇， 从而降低溶质的溶解度，使其沉淀吸析出。具体地，当乙醇加入溶液中时，介质的介电常数 降低，溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。

滑菇在我国广泛种植，但是还未见到滑菇加工产品的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种滑菇多糖的乙醇醇析分级制备方法。利用水提法经酶处理所 得滑菇多糖溶液是多种不同分子量的多糖的混合组分，根据以上乙醇分级沉淀原理，向滑菇 多糖的水溶液中逐次加入一定体积分数的乙醇，便可以逐级沉淀出分子量由大到小的多糖， 乙醇醇析得到的多糖经醋酸纤维薄膜电泳都可以达到单一条带。

本发明的技术方案如下：

滑菇多糖的乙醇醇析分级制备，它包括以下步骤：

(1)选剔

选购新鲜滑菇，在购得的新鲜滑菇中挑选无明显组织伤痕、大小均一且干净的优良滑菇 备用；

(2)称重

将挑选好的优良滑菇置于提前清洗并烘干的500ml烧杯中，用电子天平称取300g供实验 使用；

(3)浸泡

在称取好的300g滑菇中加蒸馏水1500ml(滑菇与水的比例为1:5)，室温下浸泡2h，其 间每隔20min对浸泡液在速度60rpm下进行搅拌5min。

(4)破碎打浆

将浸泡过的滑菇与水一同倒入高速组织捣碎机中，对滑菇进行破碎打浆1-2min，得滑菇 组织浆液。

(5)水浴浸提

将上一步所得滑菇组织浆液等分为若干份分别置于500ml烧杯中，每份适量以确保浆液 恰好完全浸入水浴锅的热水中，再将盛有滑菇组织浆液的烧杯置于恒温水浴锅中，85℃下水 浴浸提3h。

(6)过滤

用三层纱布对水浴过后的滑菇组织浆液进行过滤，所得若干份滤液混合留存，所得滤渣 集中在一个烧杯中进行下一步。

(7)洗渣

上一步所得滤渣加1倍水于85℃下水浴浸提1h,过滤，保留滤液；所得滤渣再加0.5倍 水于85℃下水浴浸提1h,过滤，弃渣，保留滤液。所得所有滤液充分混合。

(8)分级醇析

根据多糖醇析分层操作工艺流程图1和图2，分步按比例对“过滤”、“洗渣”两步所得 混合滤液进行醇析，具体操作如下：

①第一步

所得滤液平均分为若干份，每份150-200ml，分别置于500ml烧杯中，每份按1:1 比例加无水乙醇醇析，静置2h分三层，分别是上层絮状多糖、中间清液以及下层胶状多 糖。取上层多糖去酒精后，弃中间清液，下层保留。上层多糖和下层多糖获得后在4000rpm 离心20min后除去液体，获得上层多糖和下层多糖的固体。

②第二步

上一步所得下层多糖用水复溶(每g加水400ml水)，再按1:1(溶液:乙醇)比例 加乙醇醇析，静置2h，分层情况同上。取上层多糖去乙醇，弃中间清液，下层保留。

③第三步

上一步所得下层多糖用水复溶(每g加水400ml水)，再按1:1(溶液:乙醇)比例加 乙醇醇析，静置2h，分层情况同上。取上层多糖去乙醇，弃中间清液，下层保留。

④第四步

上一步所得下层多糖用水复溶(每g加水400ml水)，再按1:2(溶液:乙醇)比例加 乙醇醇析，静置2h，分层情况同上。取上层多糖去乙醇，弃中间清液，下层保留。

⑤第五步

上一步所得下层多糖用水复溶(每g加水400ml水)，再按1:3(溶液:乙醇)比例加 乙醇醇析，静置2h，分层情况同上。取上层多糖去乙醇，弃中间清液，下层保留。

⑥第六步

上一步所得下层多糖用水复溶(每g加水400ml水)，再按1:5(溶液:乙醇)比例加 乙醇醇析，静置2h分两层，分别是上层絮状多糖和下层清液。取上层多糖去乙醇，弃下 层清液。

注：每一步所得上层多糖复溶后取一定量按以上步骤重复操作；

以上各步骤样品均标记留样；

以下为标记原则：E表示经过醇析的样品，下标U、D分别表示多糖醇析液的上、 下层多糖，stepX(X＝1.2.3……)表示第X步醇析，其后用连接符“-”连接这一步的醇析比 例。例如第三步1:1醇析所得多糖标记为E_Ustep3-1:1。

(9)冻干

分级醇析所得全部多糖样品均用冷冻干燥机冷冻干燥24h，得粉状多糖样品。

本发明具有如下有益效果：

本发明将滑菇多糖通过醇析制备，简单方便经济，制备过程多糖损失少(质量百分比小于 10％)，而且醇析后的多糖纯度达到电泳纯(图3-1、图3-2、图3-3、图3-4、图3-5电泳图上 是单一条带，出一条带表示多糖达到电泳纯)，完全能达到其功能研究、制作食品饮料和食 品营养添加剂等的用途。

附图说明

图1为本发明的滑菇多糖乙醇醇析操作工艺流程图；

图2为本发明经乙醇醇析分级的多糖电泳图；

图3-1滑菇多糖样品E_Ustep1-1:1的电泳结果图；

图3-2滑菇多糖样品E_Ustep2-1:1的电泳结果图；

图3-3滑菇多糖样品E_Ustep3-1:1的电泳结果图；

图3-4滑菇多糖样品E_Ustep4-1:2的电泳结果图；

图3-5滑菇多糖样品E_Dstep6-1:4的电泳结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步描述。

实施例1：工艺步骤如下：

(1)选剔

选购新鲜滑菇，在购得的新鲜滑菇中挑选无明显组织伤痕、大小均一且干净的优良滑菇 备用。

(2)称重

将挑选好的优良滑菇置于提前清洗并烘干的500ml烧杯中，用电子天平称取300g供实验 使用。

(3)浸泡

在称取好的300g滑菇中加蒸馏水1500ml，室温下浸泡2h，其间每隔20min对浸泡液以 60rpm的速度进行搅拌5min。

(4)破碎打浆

将浸泡过的滑菇与水一同倒入高速组织捣碎机中，以？rpm的速度对滑菇进行破碎打浆 1-2min，得滑菇组织浆液。

(5)水浴浸提

将上一步所得滑菇组织浆液等分为若干份分别置于500ml烧杯中，每份适量以确保浆液 恰好完全浸入水浴锅的热水中，再将盛有滑菇组织浆液的烧杯置于恒温水浴锅中，在85℃条 件下水浴浸提3h。

(6)过滤

用三层纱布对水浴过后的滑菇组织浆液进行过滤，所得若干份滤液混合留存，所得若干 份滤渣集中在一个烧杯中进行下一步。

(7)洗渣

上一步所得滤渣添加相同质量数的水于85℃下水浴再次浸提1h,然后再用三层纱布进行 过滤，保留滤液；所得滤渣再加0.5倍质量数的水于85℃下水浴继续浸提1h,最后再次过滤， 弃渣，保留滤液；将步骤6和7的所得所有滤液充分混合。

(8)分级醇析

根据多糖醇析分层操作流程图1和图2，分步按比例对步骤6和7两步所得混合滤液进 行醇析，具体操作如下：

①第一步

所得滤液平均分为若干份，每份150-200ml，分别置于500ml烧杯中，每份按体积 比1:1比例加无水乙醇醇析，静置2h后分三层，分别是上层絮状多糖、中间清液以及下 层胶状多糖；取上层絮状多糖去除酒精，弃掉中层的中间清液，保留下层胶状多糖；将 上层絮状多糖和下层胶状多糖分别在4000rpm条件下离心20min后除去液体，获得上层 多糖和下层多糖的固体。

②第二步

将上一步所得下层多糖固体用水复溶(每g加水400ml水)，再按体积比1:1向复 溶水溶液中添加乙醇进行醇析，静置2h，分层情况与第一步相同；取上层多糖去乙醇， 弃中间清液，下层多糖保留。将上层絮状多糖和下层胶状多糖分别在4000rpm条件下离 心20min后除去液体，获得上层多糖和下层多糖的固体。

③第三步

将第二步所得下层多糖用水复溶(每g加水400ml水)，再按1:1向复溶水溶液中加 乙醇醇析，静置2h，分层情况与第一步相同；取上层多糖去乙醇，弃中间清液，下层多 糖保留。将上层絮状多糖和下层胶状多糖分别在4000rpm条件下离心20min后除去液体， 获得上层多糖和下层多糖的固体。

④第四步

将第三步所得下层多糖用水复溶(每g加水400ml水)，再按溶液:乙醇以1:2(体积 比)向复溶水溶液中加乙醇醇析，静置2h，分层情况与第一步相同，取上层多糖去乙醇， 弃中间清液，下层多糖保留。将上层絮状多糖和下层胶状多糖分别在4000rpm条件下离 心20min后除去液体，获得上层多糖和下层多糖的固体。

⑤第五步

将第四步所得下层多糖用水复溶(每g加水400ml水)，再按溶液:乙醇以1:3(体积 比)比例向复溶水溶液中加乙醇醇析，静置2h，分层情况同上。取上层多糖去乙醇，弃 中间清液，下层多糖保留。将上层絮状多糖和下层胶状多糖分别在4000rpm条件下离心 20min后除去液体，获得上层多糖和下层多糖的固体。

⑥第六步

将第五步所得下层多糖用水复溶(每g加水400ml水)，再按溶液:乙醇以1:4(体积 比)比例向复溶水溶液中加乙醇醇析，静置2h分两层，分层情况是上层絮状多糖和下层 清液；取上层多糖去乙醇，弃下层清液。将上层絮状多糖在4000rpm条件下离心20min 后除去液体，获得上层多糖的固体。

以上各步骤样品均标记留样；

以下为标记原则：E表示经过醇析的样品，下标U、D分别表示多糖醇析液的上、 下层多糖，stepX(X＝1.2.3……)表示第X步醇析，其后用连接符“-”连接这一步的醇析比 例。例如第三步1:1醇析所得多糖标记为E_Ustep3-1:1。

(9)冻干

分级醇析所得全部多糖样品均用冷冻干燥机冷冻干燥24h，得粉状多糖样品。

实验验证：

(1)复溶

冷冻干燥所得粉状多糖样品按1:50(g:ml)比例加蒸馏水复溶，供电泳实验使用。

(12)醋酸纤维薄膜电泳(对分级醇析所得多糖样品)

将分级醇析所得5种干燥多糖样品E_Ustep1-1:1、E_Ustep2-1:1、E_Ustep3-1:1、E_Ustep4-1:2，E_Dstep6-1:4分别按1:50(g:ml)比例加蒸馏水复溶，做醋酸纤维薄膜电泳。电泳条件为140V，15mA， 10min。电泳结果见图3-1、图3-2、图3-3、图3-4、图3-5，都呈现单一条带，表明滑菇多糖 酒精分级后的5种多糖达到电泳纯。