虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因、重组表达载体、应用

摘要

本发明公开了一种虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因，命名为OmElo基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？No.1。OmElo基因是根据家蚕基因组序列数据中编码基因表达序列密码子的偏好性，对来源基因进行优化设计后得到的新的延长酶基因。由OmElo基因指导编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ？ID？No.2。本发明同时提供包含OmElo基因的重组表达载体及其构建方法。该重组表达载体表达框的启动子是BmNPV极早期启动子IE1。包含OmElo基因的重组表达载体可应用于获得高11,14,17-顺-二十碳三烯酸含量家蚕转基因品系。本发明还提供提高家蚕组织中11,14,17-顺-二十碳三烯酸含量的方法，是将虹鳟鱼脂肪酸延长酶OmElo基因导入家蚕胚胎中，经筛选，得到目标家蚕转基因系。

说明书

技术领域

本发明涉及一种虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因及其编码蛋白、重组载体，以及增加蚕蛹组织11,14,17-顺-二十碳三烯酸含量的方法，属于基因工程、转基因动物育种领域。

背景技术

脂肪酸按不饱和度不同可以分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸是和多不饱和脂肪酸(PUFAs)。在生物体内，许多代谢过程都在膜上进行或与膜有关，而不饱和脂肪酸是细胞膜磷脂的重要组成成分。由于脂肪酸的凝固点随其不饱和度升高而降低，因此膜脂中的不饱和脂肪酸含量越高，其相变温度越低，流动性越大。进而，细胞膜的各种功能，如细胞识别、转运作用和膜结合酶的活性等等都和细胞膜的流动性密切相关，因此不饱和脂肪酸在生物体内直接或间接的发挥着重要的功能，如抗癌抗肿瘤活性、免疫调节活性、促生长发育活性和降低胆固醇活性等。

多不饱和脂肪酸对人体的生理功能有着重要的生理意义，其功能的研究一直备受关注。其中，亚油酸(linoleic acid，LA)和α-亚麻酸(α-Linolenic acid,ALA)被认为是人类饮食中的必需脂肪酸。更长链的PUFAs，如二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid，DHA)等在人体的新陈代谢中发挥着至关重要 的作用。

家蚕是重要的经济昆虫。蚕蛹不仅是优质的饲料蛋白源，而且富含丰富的不饱和脂肪酸。家蚕组织内，脂肪酸占干重的约30％，其中不饱和脂肪酸约占70％，以α-亚麻酸为主。但是目前蚕蛹的加工利用方式主要是用于家畜饲料的蛋白源添加组分，其组织中脂肪酸成分利用非常有限。因此，提高蚕蛹不饱和脂肪酸含量尤其是主要的亚油酸和α亚麻酸含量对蚕蛹的进一步综合利用有着重要意义。近几年来，家蚕转基因技术的建立以及成熟使家蚕成为了新型的真核生物反应器，已有研究者通过将家蚕作为反应器成功的表达了多种高附加值产物，如人成纤维细胞生长因子、猫干扰素和人Ⅲ型前胶原蛋白等。然而用家蚕转基因技术在家蚕体内表达外源脂肪酸去饱和酶基因，增加家蚕组织中某特定不饱和脂肪酸含量的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的就是提供一种虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因、由该基因指导编码的蛋白，以及由该基因重组表达载体实现的提高蚕蛹组织11,14,17-顺-二十碳三烯酸含量的方法。为实现上述目的，本发明技术方案分别如下：

本发明首先提供一种虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因。

一种虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因，命名为OmElo基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID No.1。

上述虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因OmElo是根据家蚕基因组序列数据中编码基因表达序列密码子的偏好性，对来源于虹鳟鱼的脂肪酸延长酶基 因(OmElo)序列(NCBI登陆号：NP_001118108.1)进行优化设计，优化后获得新的去饱和酶基因，命名为OmElo，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

由上述虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因OmElo指导编码的蛋白质，其技方案如下：

一种由上述虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因OmElo指导编码的蛋白质，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述由OmElo基因指导编码的蛋白能够以特定碳链长度及不饱和度的脂酰辅酶A作为底物，在羧基端增加一个二碳单位，从而对碳链进行延长。

利用上述OmElo基因可以得到重组载体、表达盒、转基因细胞系统或重组菌株，其技术方案如下：

一种包含核苷酸序列如SEQ ID No.1的重组表达载体或基因表达盒或转基因细胞系或重组菌株。

上述重组表达载体，其表达框的启动子是BmNPV极早期启动子IE1。

进一步地，上述重组表达载体是以家蚕肌动蛋白3的启动子A3启动的加强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为表达盒，加强型绿色荧光蛋白作作为筛选标记，筛选标记后带有以IE1启动子启动虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因OmElo的表达盒。

本发明还提供构建包括核苷酸序列如SEQ ID No.1的重组表达载体的方法。

构建包括核苷酸序列如SEQ ID No.1的重组表达载体的方法，其特 征在于：是将所述OmElo基因插入到出发载体pSL1180的多克隆位点得到中间载体，然后再将完整的含有OmElo基因的表达盒IE1-OmElo-SV40插入到最终载体pBac[A3-EGFP]得到重组表达载体。

上述重组表达载体在获得蚕蛹组织高11,14,17-顺-二十碳三烯酸含量家蚕转基因品系中的应用。

本发明还提供提高蚕蛹组织中11,14,17-顺-二十碳三烯酸含量的方法，其技术方案如下：

提高蚕蛹组织中11,14,17-顺-二十碳三烯酸含量的方法，其特征在于：将虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因OmElo导入家蚕胚胎中，经筛选，得到目标家蚕转基因系。

进一步地，上述方法，是利用piggyBac重组表达载体将所述OmElo基因整合入家蚕基因组，重组表达载体是将含有OmElo基因的表达盒插入到载体pBac[A3-EGFP]的BglⅡ酶切位点得到。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)设计优化并人工合成了适用于家蚕体内表达的虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因OmElo。(2)根据家蚕基因组序列数据中内源编码序列密码子的偏好性，对虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因OmElo序列进行了优化设计，使人工合成的OmElo基因更有利于在家蚕个体中表达。(3)提供了包含核苷酸序列如SEQ ID No.1的重组表达载体或基因表达盒或转基因细胞系或重组菌株。(4)包括核苷酸序列如SEQ ID No.1的重组表达载体可应用于获得高11,14,17-顺-二十碳三烯酸含量家蚕转基因品系。(5)利用piggyBac转座子结合BmNPV极早期启动子IE1驱动其表达，从而获得了可稳定在家蚕中表达虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因OmElo的家蚕转基因系，该品系蚕蛹期组织含有高含 量11,14,17-顺-二十碳三烯酸。

附图说明

图1是真核生物多不饱和脂肪酸合成途径。

图2是重组载体pBac[A3-EGFP+IE1-OmElo-SV40]结构图。

图3是转基因家蚕的鉴定图。

图4是非转基因305多化品系蛹期3天脂肪酸甲酯的气相色谱图。

图5是305多化品系家蚕虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因(OmElo)品系蛹期3天脂肪酸甲酯的气相色谱图。

图6是305多化品系家蚕转虹鳟鱼的脂肪酸延长酶基因(OmElo)品系和非转基因305多化品系蛹期3天脂肪酸的11,14,17-顺-二十碳三烯酸含量变化图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的优选实施例作进一步的描述。

实施例一

虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因OmElo的制备。

来源基因：虹鳟鱼的脂肪酸延长酶基因(OmElo)序列(NCBI登陆号：NP_001118108.1)。

根据家蚕基因组序列数据中编码基因表达序列密码子的偏好性，对来源基因进行优化设计，优化后得到虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因OmElo，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，命名为OmElo基因。

由OmElo基因指导编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所 示。

实施例二

构建家蚕转基因重组载体pBac[A3-EGFP+IE1-OmElo-SV40]。

如图2所示，将OmElo基因插入到出发载体pSL1180的多克隆位点得到的中间载体，然后再将完整的含有OmElo基因的表达盒IE1-OmElo-SV40插入到最终载体pBac[A3-EGFP]得到重组表达载体。

具体实施操作：

步骤S1、制备载体pSL1180[Ser1-OmElo-SV40]

将OmElo基因连接于pUC57载体质粒；通过BamHⅠ/NotⅠ双酶切pUC57载体质粒，回收得到OmElo基因片段(回收操作按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行)，将回收片段与相同酶切的pSL1180[Ser1-pGH-SV40]载体骨架片段按照TAKARA DNA ligation kit Ver2.1使用说明进行连接，即将pGH序列替换为OmElo序列，得到pSL1180[Ser1-OmElo-SV40]载体。

步骤S2、制备IE1启动子序列 

PCR体外扩增，从BmNPV基因组中扩增IE1启动子序列，并在扩增片段上下游分别添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，经T-A克隆到载体pMD19-T获得质粒，将获得的pMD19-T载体质粒用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，回收IE1启动子序列(回收操作按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行)。

所需PCR反应程序为：①94℃预变性4min，②94℃变性40s，③55℃退火40s，④72℃延伸40s，⑤返回步骤②进行30个循环，⑥72℃终延伸10min，⑦12℃Forever。

PCR扩增上下游引物分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示：

IE1-F(SEQ ID No.3)：5’CGgaattcTTGCAGTTCGGGACATAAATG3’

IE1-R(SEQ ID No.4)：5’CGggatccTAGATCCCTAGTCGTTTGGT3’

步骤S3、制备中间载体pSL1180[IE1-OmElo-SV40]

通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切步骤S1所得载体pSL1180[Ser1-OmElo-SV40]，将Ser1启动子切除，回收载体骨架(回收操作按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行)，与步骤S2获得的IE1启动子序列按照TAKARA DNA ligation kit Ver2.1使用说明进行连接，获得中间载体pSL1180[IE1-OmElo-SV40]；

步骤S4、制备表达盒片段IE1-DrDes-SV40

通过AscⅠ单酶切pSL1180[IE1-OmElo-SV40]，按试剂盒要求回收并补平黏性末端，制得表达盒片段IE1-OmElo-SV40。

步骤S5、制备载体骨架

通过BglⅡ单酶切载体pBac[A3-EGFP](参见参考文件1)，按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行回收载体骨架并补平去磷酸化，得到载体骨架片段。

步骤S6、制备目标载体pBac[A3-EGFP+IE1-OmElo-SV40]

将步骤S4制得表达盒片段IE1-OmElo-SV40与步骤S5制得的pBac[A3-EGFP]载体骨架片段按照TAKARA DNA ligation kit Ver2.1使用说明进行连接，获得目标载体pBac[A3-EGFP+IE1-OmElo-SV40]。

本实施例构建获得的转基因重组载体以肌动蛋白3启动子A3启动的加强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达盒，加强型绿色荧光蛋白作为筛选标记，其后含有以IE1启动子启动优化后的虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因 (OmElo)的表达。

参考文件1：Tamura T,Thibert C,Royer C,et al.Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L using a piggyBac transposon-derived vector.Nat Biotechnol,2000,181:81～84.

实施例三

培育虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因(OmElo)的家蚕转基因系。

用商业化多化性家蚕品系305作为原始材料，亲代蚕卵经正常桑叶饲养并化蛾交配产卵。

取10nL～15nL浓度为400ng/μL的实施例一制得的重组载体pBac[A3-EGFP+IE1-OmELo-Sv40]分别与辅助质粒pHA3PIG的混合液成混合液，将混合液分别注射至400粒家蚕品系305雌蛾产下2h至6h的蚕卵中，用无毒胶水封口，置于25℃、相对湿度为85％的环境中催青孵化。孵化后pBac[A3-EGFP+IE1-OmElo-SV40]载体获得98头G0代蚁蚕。

所得蚁蚕用桑叶饲养至化蛾，将获得的蚕蛾通过回交或自交。获得33蛾圈。

G1代蚁蚕以桑叶饲喂养一天后，用电动宏观荧光显微镜观察，经筛选获得2个全身发绿色荧光的蛾圈，转化效率为6.1％。

图3是转基因家蚕的鉴定图。图3显示在体式荧光显微镜下，IE1-OmElo转基因系家蚕在幼虫期、蛹期和蛾期均能在全身观察到筛选标记加强型绿色荧光蛋白EGFP的表达。

将获得的阳性转基因家蚕饲养至上蔟采茧并进一步自交选纯，即获得能稳定遗传的在蚕蛹中表达虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因(OmElo)的家蚕转基因系IE1-OmElo-SV40。

测试例一

检测实施例三所得虹鳟鱼脂肪酸延长酶基因(OmElo)家蚕转基因系组织11,14,17-顺-二十碳三烯的含量。

通过检测转基因蚕蛹的11,14,17-顺-二十碳三烯含量，结果如图4～图6所示。结果显示，IE1-OmElo-SV40转基因家蚕蛹期3天的11,14,17-顺-二十碳三烯含量相比非转基因305家蚕品系增加了84.6％。表明获得的IE1-OmElo-SV40转基因家蚕在蛹期3天的11,14,17-顺-二十碳三烯含量有显著提高。