D-葡萄糖二酸生产菌及D-葡萄糖二酸的制造方法

摘要

本发明提供D-葡萄糖二酸生产菌及D-葡萄糖二酸的制造方法。本发明特征在于，从选自D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸的1种或2种以上的糖质，制造由特定的醇脱氢酶PQQ-ADH(1)及特定的醛脱氢酶PQQ-ALDH(2)催化的D-葡萄糖二酸或其盐，以及，在上述的1种或2种以上的糖质的存在下，使用有上述PQQ-ADH(1)及PQQ-ALDH(2)的微生物或其处理物制造D-葡萄糖二酸或其盐。由本发明可提供为了制造D-葡萄糖二酸而使用的D-葡萄糖二酸生产能力升高的微生物及D-葡萄糖二酸的有效的制造法。

说明书

【技术领域】

本发明涉及为了制造D-葡萄糖二酸使用的D-葡萄糖二酸生产能力升高的微生物及D-葡萄糖二酸的有效的制造法，更具体而言，涉及在有特定的吡咯并喹啉醌依赖性醇脱氢酶(PQQ-ADH(以下，本酶记作1))和特定的吡咯并喹啉醌依赖性醛脱氢酶(PQQ-ALDH(以下，本酶记作2))的2种脱氢酶活性，再者，与酮酸类的生成相关的多种ALDH(以下，有同样的性质的酶记作3)活性减弱或消失的反应条件下廉价并且有效制造D-葡萄糖二酸的方法。

【背景技术】

作为D-葡萄糖的代表性的羧酸，已知醛基被氧化的D-葡萄糖酸和羟甲基被氧化的D-葡萄糖醛酸。另外，醛基和羟甲基二者被氧化的二羧酸被称为D-葡萄糖二酸，天然包括苹果、葡萄水果等的果物或，绿花椰菜、芽圆白菜等的油菜科的蔬菜。

D-葡萄糖二酸由于强力地抑制β-葡萄糖醛酸糖苷酶，有抑制乳腺癌、大肠癌、肝脏癌、肺癌、皮肤癌的发癌风险的效果(非专利文献1)，在美国，作为D-葡萄糖二酸钙用于健康辅助食品。另外，D-葡萄糖二酸作为鳌合剂、水泥添加剂等的原料利用，再者，在2004年，由美国能源部定为生物精练厂的骨干物质(非专利文献2)、也被期待为新颖的聚合物原料。

对于D-葡萄糖二酸的制备法，至今，作为现有技术，报告有利用化学合成法、酶法、发酵法的各种各样的方法。化学合成法多作为起始原料使用D-葡萄糖的方法，作为氧化剂使用硝酸的方法(专利文献1)、作为氧化催化剂使用铂的方法(专利文献2)、作为氧化剂使用4-乙酰氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基的方法(专利文献3)等也被提 案。

再者，作为现有技术，也公开有提高氧化反应时的选择性，使D-葡萄糖二酸的收率大幅地升高的改良法(专利文献4、专利文献5)。但是，这些化学合成法由于需要大量的药品和特殊的设备，制造成本变高，并且，有多派生生成氮氧化物等的环境负荷物质的缺点。

另一方面，酶法或发酵法有与化学合成法想比反应条件稳和，给地球环境的影响少的优点。作为酶法，作为现有技术，报告有例如，使己糖氧化酶、醛脱氢酶、醛氧化酶作用于D-葡萄糖醛酸而将其转变为D-葡萄糖二酸的方法(专利文献6)，或使葡萄糖氧化酶作用于D-葡萄糖醛酸的方法(专利文献7)，但哪种方法的酶反应性都低，达不到实用化。

作为发酵法，作为现有技术，报告有例如，将啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的肌肌醇-1-磷酸合成酶基因、小鼠来源的肌肌醇加氧酶基因、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)来源的糖醛酸脱氢酶基因导入大肠杆菌，从D-葡萄糖生成D-葡萄糖二酸的方法(专利文献8、非专利文献3)，葡萄糖二酸的生成量最大也不过2.5g/L，不是工业上充分的水平。

【现有技术文献】

【专利文献】 

专利文献1：美国专利第2,436,659号

专利文献2：美国专利第2,472,168号

专利文献3：美国专利第6,498,269号

专利文献4：美国专利第5,599,977号

专利文献5：美国专利第7,692,041号

专利文献6：WO02/074926号

专利文献7：日本国专利第3713530号

专利文献8：WO/2009/145838号

【非专利文献】

非专利文献1：Cancer Letters，54，1-8(1990)

非专利文献2：Top value added chemicals from biomass，Volume 1-Results of screening for potential candidates from sugars and synthesis gas.U.S.Department of Energy，Washington，DC

非专利文献3：Metab.Eng.，12(3)，298-305(2010)

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

如此，以往报告有各种各样的D-葡萄糖二酸的制备法，但现状是以工业的规模廉价地制造的技术尚未确立，D-葡萄糖二酸的市场价格与作为其他D-葡萄糖氧化物的D-葡萄糖酸或D-葡萄糖醛酸相比显著地高。从而，本发明人以确立使用D-葡萄糖二酸生产能力升高的微生物，廉价并且有效制造D-葡萄糖二酸的方法作为目标，重复了锐意研究开发。

即，本发明人在上述研究开发的过程中，从D-葡萄糖二酸的生成能力不同的生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)的菌株，各自分离、纯化醇脱氢酶(ADH(1))和醛脱氢酶(ALDH(2)，ALDH(3))，详细地探讨其性质。

结果发现，为了有效生产D-葡萄糖二酸，需要有特定的吡咯并喹啉醌依赖性醇脱氢酶(PQQ-ADH(1))和特定的吡咯并喹啉醌依赖性醛脱氢酶(PQQ-ALDH(2))的2种脱氢酶活性，再者，与酮酸类的生成相关的多个ALDH(3)活性减弱或消失的新颖见解，从而完成本发明。

本发明旨在提供使用D-葡萄糖二酸生产能力升高的微生物，廉价并且有效制造D-葡萄糖二酸的方法、以及所述微生物。

【解决课题的技术方案】

用于解决上述课题的本发明由以下的技术的手段构成。

(1)微生物，其特征在于，其属于假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter)属，且有以下的性质：(A)、(B)、(C)之全部：

(A)有与D-葡萄糖二酸的生成相关的特定的醇脱氢酶ADH(1)活性，

(B)有与D-葡萄糖二酸的生成相关的特定的醛脱氢酶ALDH(2)活性，

(C)与酮酸类的生成相关的醛脱氢酶ALDH(3)活性减弱或消失。

(2)上述(1)所述的微生物，其中特定的醇脱氢酶ADH(1)是以SDS-PAGE示64,000±5,000、以凝胶过滤层析示120,000±10,000的分子量的吡咯并喹啉醌依赖性酶，且有以下的氨基酸序列：(a)～(c)之任何：

(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列、

(b)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中保持其功能、并且1或多个的氨基酸被取代、缺失、插入、及/或附加的氨基酸序列、

(c)与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列有80％以上的相同性，并且保持其功能的氨基酸序列。

(3)上述(1)所述的微生物，其中特定的醛脱氢酶ALDH(2)是以SDS-PAGE示61,000±5,000、以凝胶过滤层析示180,000±10,000的分子量的吡咯并喹啉醌依赖性酶，且有以下的氨基酸序列：(d)～(f)之任何：

(d)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列、

(e)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中保持其功能、并且1或多个的氨基酸被取代、缺失、插入、及/或附加的氨基酸序列、

(f)与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列有80％以上的相同性，并且保持其功能的氨基酸序列。

(4)醇脱氢酶ADH(1)，其特征在于，其为以SDS-PAGE示64,000±5,000、以凝胶过滤层析示120,000±10,000的分子量的吡咯并喹啉醌依赖性酶，且有以下的氨基酸序列：(a)～(c)之任何：

(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列、

(b)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中保持其功能、并且1或多个的氨基酸被取代、缺失、插入、及/或附加的氨基酸序列、

(c)与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列有80％以上的相同性，并且保持其功能的氨基酸序列。

(5)醛脱氢酶ALDH(2)，其特征在于，其为以SDS-PAGE示61,000±5,000、以凝胶过滤层析示180,000±10,000的分子量的吡咯并喹啉醌依赖性酶，且有以下的氨基酸序列：(d)～(f)之任何：

(d)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列、

(e)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中保持其功能、并且1或多个的氨基酸被取代、缺失、插入、及/或附加的氨基酸序列、

(f)与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列有80％以上的相同性，并且保持其功能的氨基酸序列。

(6)D-葡萄糖二酸或其盐的制造方法，其特征在于，其为从选自D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸的1种或2种以上的糖质制造D-葡萄糖二酸的方法，且

从这些糖质生成D-葡萄糖二酸的反应被上述(4)所述的特定的醇脱氢酶ADH(1)及上述(5)所述的特定的醛脱氢酶ALDH(2)催化。

(7)D-葡萄糖二酸或其盐的制造方法，其特征在于，在选自D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸的1种或2种以上的糖质的存 在下，使用上述(1)～(3)之任一项所述的微生物或其处理物生产D-葡萄糖二酸。

(8)D-葡萄糖二酸或其盐的制造方法，其特征在于，在选自D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸的1种或2种以上的糖质的存在下，使用向宿主导入上述(2)所述的醇脱氢酶ADH(1)的基因及上述(3)所述的醛脱氢酶ALDH(2)的基因的基因重组生物或其处理物生产D-葡萄糖二酸。

(9)上述(8)所述的D-葡萄糖二酸或其盐的制造方法，其中醇脱氢酶的基因有SEQ ID NO：1的碱基序列，且醛脱氢酶的基因有SEQ ID NO：2的碱基序列。

(10)上述(7)或(8)所述的D-葡萄糖二酸或其盐的制造方法，其中处理物是细胞破碎液、细胞提取液、或者丙酮粉末。

(11)D-葡萄糖二醛的制造方法，其特征在于，使用上述(1)或(2)所述的微生物或其处理物或酶ADH(1)，从D-葡萄糖生产D-葡萄糖二醛(中间体A)。

(12)L-古洛糖醛酸或其盐的制造方法，其特征在于，在选自D-葡萄糖、D-葡萄糖酸的1或2的糖质的存在下，使用上述(1)～(3)之任一项所述的微生物或其处理物、或者上述(4)及(5)所述的酶ADH(1)、ALDH(2)生产L-古洛糖醛酸(中间体B)。

接下来，对本发明再详细地进行说明。

本发明提供(1)D-葡萄糖二酸的生产能力升高的属于假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter)属的微生物，其有与D-葡萄糖二酸的生成相关的PQQ-ADH(1)和PQQ-ALDH(2)活性，并且，与酮酸类的生成相关的ALDH(3)活性减弱或消失，以及(2)D-葡萄糖二酸或其盐的制造方法，其特征在于，从选自D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸的1种或2种以上的糖质生成D-葡萄糖二酸的反应被图1所示的PQQ-ADH(1)及PQQ-ALDH(2)的2种酶催化。

另外，本发明提供(3)D-葡萄糖二酸或其盐的制造方法，其特征在于，向选自D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸的1种或2种以上的糖质接触使D-葡萄糖二酸生成能力升高的细胞或其处理物而生产D-葡萄糖二酸、以及(4)制造D-葡萄糖二酸时作为中间物质生成的D-葡萄糖二醛及L-古洛糖醛酸的制造方法。

本发明中涉及的PQQ-ADH(1)的性质如下。 

(1)作用：

有在2，6-二氯苯酚吲哚苯酚、铁氰化钾、吩嗪甲硫酸盐、四唑鎓盐等的电子受体的存在下、将D-葡萄糖或D-葡萄糖酸的羟甲基氧化为醛基的ADH活性及将D-葡萄糖二醛(D-葡萄糖二酸的二醛：中间体A)的6位的醛基氧化为羧基的ALDH活性。

(2)分子量：

以SDS-PAGE为64,000±5,000、以凝胶过滤层析为120,000±10,000。

(3)辅基：

在分子内含吡咯并喹啉醌(PQQ)。

(4)推定氨基酸序列：

含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。再有，在推定氨基酸序列中含信号序列。

至今，作为生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)产生的ADH，已知在分子中含稀土类元素的醇脱 氢酶(酶A、专利第3056295号)和PQQ依赖性醇/醛脱氢酶(酶B、特开2003-159079)。

本发明中涉及的PQQ-ADH(1)与酶A同样地，有由稀土类元素的添加而表达诱导的特征，分子量也与酶A相同，但酶A在分子内有PQQ，尚无也有醛脱氢活性的报告。另外，本发明中涉及的PQQ-ADH(1)与酶B同样地，在分子内含有PQQ，也有醛脱氢酶活性，但与酶B分子量不同。

PQQ-ADH(1)极少，但也显示氧化中间体A的1位的醛基而生成L-古洛糖醛酸(L-古洛糖的糖醛酸：中间体B)，氧化中间体B的醛基而生成D-葡萄糖二酸的醛脱氢酶活性。但是，由于这些反应非常地慢，所以仅由PQQ-ADH(1)的作用难从D-葡萄糖或D-葡萄糖酸生成D-葡萄糖二酸。

另一方面，本发明中涉及的PQQ-ALDH(2)的性质如下。 

(1)作用：

有在2，6-二氯苯酚吲哚苯酚、铁氰化钾、吩嗪甲硫酸盐、四唑鎓盐等的电子受体的存在下，将D-葡萄糖、中间体A、中间体B、D-葡萄糖醛酸的醛基氧化为羧基的ALDH活性。

(2)分子量：

以SDS-PAGE为61,000±5,000、以凝胶过滤层析为180,000±10,000。

(3)辅基：

在分子内含PQQ。

(4)氨基酸序列： 

含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

由于PQQ-ALDH(2)不催化从D-葡萄糖生成中间体A，从D-葡萄糖酸生成中间体B的反应，仅由PQQ-ALDH(2)无法从D-葡萄糖或D-葡萄糖酸生成D-葡萄糖二酸。另外，PQQ-ALDH(2)虽可氧化D-葡萄糖醛酸而将其转变为D-葡萄糖二酸，但其氧化速度慢。

生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes) 除PQQ-ALDH(2)之外，也生产多种催化醛基的氧化的ALDH(3)。在ALDH(3)之内、活性最高的PQQ/Heme-ALDH(以下，本酶记作4)的性质如下。

(1)作用：

在2，6-二氯苯酚吲哚苯酚、铁氰化钾、吩嗪甲硫酸盐、四唑鎓盐等的电子受体的存在下，主要催化氧化D-葡萄糖、D-葡萄糖酸而生成2-酮基-D-葡萄糖酸，氧化D-葡萄糖醛酸而生成D-葡萄糖二酸的反应。

(2)分子量：

以SDS-PAGE为59,000±5,000、以凝胶过滤层析为130,000±10,000。

(3)辅基：

在分子内含PQQ和血红素c。

(4)氨基酸序列： 

含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

以PQQ/Heme-ALDH(4)作为代表的ALDH(3)作用于D-葡萄糖或D-葡萄糖酸，则多生成成为副产物的酮酸类，从而在用于D-葡萄糖二酸的制造的菌株中，有必要使这些的ALDH(3)活性减弱或消失。

作为有PQQ-ADH(1)及PQQ-ALDH(2)活性，且多种ALDH(3)活性减弱的D-葡萄糖二酸生产能力升高的微生物的具体例，可举出生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)Rh47-3株(FERM BP-10820)。

Rh47-3株是用于D-葡萄糖醛酸的制造的菌株(WO/2008/139844)，且是有将L-山梨糖氧化为2-酮基-L-古洛糖酸的能力的生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)K591s株(特开昭62-228288、FERM BP-1130)的变异株。

用Rh47-3株和K591s株生产D-葡萄糖二酸的能力大不同的理由如下。由于Rh47-3株有与D-葡萄糖二酸的生成相关的PQQ-ADH(1) 及PQQ-ALDH(2)活性，再者，生成酮酸类的ALDH(3)活性低，所以可从D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸有效生成D-葡萄糖二酸。

另一方面，K591s株虽有PQQ-ADH(1)活性，但几乎确认不到PQQ-ALDH(2)活性，再者，由于ALDH(3)活性(特别是，PQQ/Heme-ALDH(4))非常地强，从而一旦作用于D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸，则主要生成酮酸类，结果，无法有效生成D-葡萄糖二酸。

作为与K591s株有同样的性质的菌株，例如，有生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)TH14-86株(FERM BP-1128)、生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)12-5株(FERM BP-1129)、生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)12-4株(FERM BP-1131)、生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)12-15株(FERM BP-1132)、生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)22-3株(FERM BP-1133)。

但是，由于难生成D-葡萄糖二酸的这些菌株中也存在PQQ-ALDH(2)基因，从而通过使PQQ-ALDH(2)活性表达，并且，实施变异至其他ALDH(3)活性降低或消失，可改变为适宜于D-葡萄糖二酸生产的株。

作为变异处理的方法，不特别限定，可使用公知或公知的方法，例如，可适用紫外线照射、放射线照射、由使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等的化学变异衍生的随机变异法或由基因重组等的位点特异性变异法。再者，通过将Rh47-3株由公知或公知的方法变异处理，提高PQQ-ADH(1)或PQQ-ALDH(2)活性，或者，使其他ALDH(3)活性消失，可使D-葡萄糖二酸的生产能力再升高。

另外，也可由基因操作制作导PQQ-ADH(1)基因及PQQ-ALDH(2)基因的重组体，将其用于D-葡萄糖二酸的制造。通 常、只要重组DNA被整合入目的基因可自主增殖的表达载体，得到本发明中涉及的PQQ-ADH(1)基因及PQQ-ALDH(2)基因的DNA，就可由一般知道的公知或公知的基因操作技术比较容易地制备。

分别将PQQ-ADH(1)基因的碱基序列示于SEQ ID NO：1，将PQQ-ALDH(2)基因的碱基序列示于SEQ ID NO：2。表达载体的种类不特别限定，例如，可为能自主增殖的质粒，也可在导入宿主细胞时整合到宿主细胞的染色体而随染色体一同复制。

作为宿主细胞，只要对于整合对应基因的表达载体适合，且被其转化，就不特别限定，可利用当技术领域通常使用的细菌、酵母、真菌、动物细胞、植物细胞等，各种各样的细胞，但优选不产生作用于成为底物的D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸的酶的细胞。

作为确认由变异处理或基因操作得到的细胞的D-葡萄糖二酸生成能力的方法，不特别限定，例如，向含在相同条件下培养的细胞0.5％(w/v)的碳酸钙的1.0％(w/v)葡萄糖溶液添加，一边振荡一边进行氧化反应，将生成的D-葡萄糖二酸用各种分析装置定量即可。

作为由变异处理或基因操作得到的用于细胞的培养的营养培养基，只要含有碳源、氮源、无机物、及根据需要使用的细胞必要的微量营养素，则天然培养基、合成培养基均可。

作为营养培养基，只要细胞可利用即可，碳源可使用例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉等。氮源可使用例如，硫酸铵、尿素、硝酸钠等的无机氮化合物或玉米浆、酵母提取物、胨等的有机氮化合物。作为无机物，可使用例如，钠盐、钾盐、镁盐、铁盐等，具体而言使用氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁等。

再者，也可根据需要，添加氯化镧、氯化铈等的稀土类元素。特别是，培养假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter)属菌时，为了诱导PQQ-ADH(1)活性，稀土类元素的添加成为必须。另外，也适宜使用泛酸、生物素、硫胺素、核黄素等的微量营养素或辅酶。

作为培养法，优选使用液体培养基的振荡培养法或通气搅拌培养法。培养温度和pH只要选对使用的细胞的增殖最适宜的条件即可。 例如，假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter)属菌的情况中，温度的范围是15～45℃、优选为20～40℃、更优选为25～35℃、pH的范围是4～9、优选为pH5～8、更优选为pH6～7。

培养时间只要是细胞开始增殖的时间以上即可，优选为细胞生成的PQQ-ADH(1)活性及PQQ-ALDH(2)活性达最大的时间。在培养时的溶解氧浓度不特别限制，但由于通常优选为0.5ppm以上，所以只要调节通气量或搅拌速度即可。培养方式是分批培养、流加培养、连续培养之任何均可。

制造D-葡萄糖二酸时，向成为底物的选自D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸的1种或2种以上的糖质添加培养的细胞或其处理物而进行氧化反应。D-葡萄糖醛酸由PQQ-ALDH(2)的作用而被氧化为D-葡萄糖二酸，但其反应速度慢，并且，D-葡萄糖醛酸与D-葡萄糖或D-葡萄糖酸相比价格高，所以是作为D-葡萄糖二酸的起始原料不太适宜的底物。另外，在制造中间体A时，作为起始原料使用D-葡萄糖；在制造中间体B时，作为起始原料使用D-葡萄糖及/或D-葡萄糖酸。

细胞的处理物是指使用均浆器或玻璃珠等物理破碎的细胞破碎液、由表面活性剂或酶等药剂处理的细胞提取液、这些的丙酮粉末。另外，将细胞或处理物固定化到载体上，则重复使用变得可能，作为固定化的方法，可举出吸附到纤维素载体、陶瓷载体、玻璃珠载体等方法或包括到藻酸钙、角叉菜胶等的方法等。

氧化反应时的底物浓度是，一般而言在0.1～10％(w/v)的范围，优选在1～5％(w/v)的范围实施该氧化反应是优选的。但是，以D-葡萄糖作为起始原料时，在底物浓度低时，容易经由中间体B生成D-葡萄糖二酸，在底物浓度高时，容易经由中间体A生成D-葡萄糖醛酸，所以在制造中间体B或D-葡萄糖二酸时，优选分别将D-葡萄糖浓度调节到1～2％(w/v)的范围，在制造中间体A时，将D-葡萄糖浓度调节到3～5％(w/v)的范围。温度与培养温度同样地，在15～45℃、优选为20～40℃、更优选为25～35℃的范围。pH一般而言在 pH4～9的范围，特别是在5～8的范围是优选的，为了控制pH，可添加氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙等。

另外，氧化反应时，优选振荡或通气搅拌的装置，反应时间优选分别是，在制造D-葡萄糖二酸时，将反应液中的中间体B被全部氧化之时作为终点，在制造中间体A时，将D-葡萄糖被全部氧化之时作为终点，在制造中间体B时，将中间体A或D-葡萄糖酸被全部氧化之时作为终点。

反应结束后，对于从反应液采集D-葡萄糖二酸或其盐的方法而言，本发明中没必要特别的方法。即，可通过组合以往公知或公知的离子交换树脂法、沉淀法、结晶化法等实施。另外，对于中间体A或中间体B或其盐的采集而言，也没必要特别的方法。

【发明效果】 

由本发明得到如以下一样的效果。

(1)可提供D-葡萄糖二酸生产能力升高的微生物。

(2)可使用D-葡萄糖二酸生产能力升高的微生物，廉价并且有效制造，提供D-葡萄糖二酸。

(3)通过有与D-葡萄糖二酸的生成相关的PQQ-ADH(1)和PQQ-ALDH(2)的活性，并且，与酮酸类的生成相关的ALDH(3)活性减弱或消失而可提供D-葡萄糖二酸的生性能力升高的属于假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter)属的微生物。

(4)可提供通过由选自D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸的1种或2种以上的糖质PQQ-ADH(1)及PQQ-ALDH(2)的2种酶催化的反应制造D-葡萄糖二酸或其盐的方法。

(5)可提供向上述糖质接触使D-葡萄糖二酸生成能力升高的细胞或其处理物而生产D-葡萄糖二酸的制造D-葡萄糖二酸或其盐的方法。

(6)可提供制造在制造D-葡萄糖二酸时作为中间物质生成的D-葡萄糖二醛(中间体A)及L-古洛糖醛酸(中间体B)的方法。

(7)可提供有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其有80％以上的 相同性的氨基酸序列的醇脱氢酶ADH(1)、及有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与其有80％以上的相同性的氨基酸序列的醛脱氢酶ALDH(2)。

(8)可提供向宿主细胞导入有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其有80％以上的相同性的氨基酸序列的醇脱氢酶ADH(1)的基因、及，有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与其有80％以上的相同性的氨基酸序列的醛脱氢酶ALDH(2)的基因之一方或两方，从而赋予D-葡萄糖二酸生产能力的转化体。

(9)可提供从D-葡萄糖二醛(中间体A)及/或L-古洛糖醛酸(中间体B)由PQQ-ALDH(2)的反应而生产D-葡萄糖二酸或其盐的方法。

【附图说明】

【图1】是显示PQQ-ADH(1)及PQQ-ALDH(2)的反应特性的图。箭头越大，表示反应性越高。

【图2】是显示中间体A的质谱分析结果的图。

【图3】是显示中间体B的质谱分析结果的图。

【图4】是显示中间体B的¹H-NMR的测定结果的图。

【图5】是显示中间体B的¹³C-NMR的测定结果的图。

【图6】是显示中间体B的H，H-COSY NMR的测定结果的图。

【图7】是显示中间体B的C，H-COSY NMR的测定结果的图。

【图8】是显示离子交换层析的溶出图案的图。A：Rh47-3株、B：K591s株

【图9】是显示以D-葡萄糖作为底物时的氧化反应的经时变化的图。

【图10】是显示以D-葡萄糖酸钠作为底物时的氧化反应的经时变化的图。

【图11】是公开SEQ ID NO：1的碱基序列及氨基酸序列的图。

【图12】是公开SEQ ID NO：1的序列的图。

【图13】是公开SEQ ID NO：2的碱基序列及氨基酸序列的图。

【图14】是公开SEQ ID NO：2的序列的图。

【图15】是公开SEQ ID NO：3的碱基序列及氨基酸序列的图。

【图16】是公开SEQ ID NO：3的序列的图。

【图17】是公开SEQ ID NO：4～9的碱基序列的图。

【实施方式】 

接下来，基于实施例具体说明本发明，本发明不受以下的实施例的任何限定。

【实施例】

【实施例1】

在本实施例中进行由生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)的D-葡萄糖二酸生成能的比较。

【(1)生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)的培养】

作为菌株，使用生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)Rh47-3株、生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)TH14-86株、生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)12-5株、生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)K591s株、生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)12-4株、生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)12-15株、生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)22-3株。

将这些各菌株的琼脂斜面培养菌植菌各自1铂耳到含由1.0％乳糖、1.0％酵母提取物、2.0％玉米浆、0.3％硫酸铵(pH7.0)组成的前培养基10mL的试管，于30℃进行72小时振荡培养而制备预培养液。 接下来，向含由2.0％乳糖、0.5％酵母提取物、1.0％玉米浆、0.5％硫酸铵、0.1％硫酸亚铁、0.01％氯化镧(pH7.0)组成的本培养基100mL的坂口瓶植菌1mL预培养液，于30℃进行72小时振荡培养。

【(2)ADH(1)活性及ALDH(2及3)活性的测定】

培养菌体的ADH(1)活性及ALDH(2及3)活性由以下的方法测定。

【(1)ADH(1)的活性测定方法】

<试剂>

底物溶液：0.2M葡萄糖溶液 

缓冲液：McIlvaine缓冲液(pH5.0)

铁氰化钾溶液：0.1M铁氰化钾溶液 

反应停止液：将硫酸铁5g、磷酸95mL溶解于纯水，定容至1L。

<测定顺序>

将培养液1mL以10,000rpm离心分离5分钟而回收菌体之后，加0.9％生理盐水1mL，悬浮菌体。将此菌体悬浮液用0.9％生理盐水适宜稀释，作为粗酶液。向试管加缓冲液250μL、底物溶液500μL、粗酶液50μL，于30℃预备加温5分钟。

向其中加铁氰化钾溶液200μL，使氧化反应开始，10分钟后，加反应停止液500μL，停止反应。添加3.5mL的纯水，于室温在暗处放置20分钟之后，测定660nm处的吸光度。作为对照，代替底物溶液使用纯水。再有，在本测定法中，将在1分钟氧化1μM的底物所需要的酶量定义为1U。

【(2)ALDH(2及3)的活性测定方法】

<试剂>

底物溶液：0.2M乙醛酸钠盐溶液(用氢氧化钠调节到pH8.0)

缓冲液：McIlvaine缓冲液(pH8.0)

其他试剂的制备方法或测定顺序基于ADH(1)的活性测定方法。

各菌株的酶活性的结果示于表1。所有菌株的ADH(1)活性是相同程度，但ALDH(2及3)活性是，Rh47-3株显示比其他菌株低 的值。

【表1】各菌株的ADH(1)活性和ALDH(2及3)活性

菌株名 ADH(1)活性(U/mL) ALDH(2及3)活性(U/mL) Rh47-3株 3.8 27.3 TH14-86株 4.1 278.8 12-5株 4.3 170.0 K591s株 3.6 286.6 12-4株 4.0 118.6 12-15株 4.3 115.0 22-3株 3.7 143.3

【(3)D-葡萄糖二酸的生成反应】

将培养液10mL以10,000rpm离心分离5分钟，回收菌体。向得到的菌体添加各自各10mL含等量的碳酸钙的底物溶液(60mM D-葡萄糖、100mM D-葡萄糖酸钠、50mM D-葡萄糖醛酸钠)，于30℃一边振荡一边进行氧化反应60小时。反应生成物的分析通过向反应液20μL添加0.2N盐酸980μL而使碳酸钙溶解之后，在以下的条件下分析。

<反应生成物的分析方法>

装置：DIONEX公司制糖分析系统ICS-3000

分析柱：CarboPac PA-1(内径4mm×250mm)

检测器：脉冲电流测定法检测器

溶离液A：100mM氢氧化钠

溶离液B：含1M醋酸钠的100mM氢氧化钠

分析时间：12分钟

梯度条件：用从分析开始12分钟将溶离液B的浓度从0％直线性地升高到100％。

柱温度：35℃

流速：1.0mL/分

作为标准物质，使用D-葡萄糖(和光纯药工业株式会社)、D-葡萄糖酸钠盐(和光纯药工业株式会社)、D-葡萄糖醛酸钠盐一水和 物(和光纯药工业株式会社)、2-酮基-D-葡萄糖酸半钙盐(和光纯药工业株式会社)、D-葡萄糖二酸一钾盐(SIGMA公司)，中间体A及中间体B钠盐如实施例2及实施例3一样制备。

使作用于D-葡萄糖时的各生成物的摩尔收率与Rh47-3株以外的菌株的情况一起示于表2。再者，使作用于D-葡萄糖酸钠时的各生成物的摩尔收率示于表3，使作用于D-葡萄糖醛酸钠时的各生成物的摩尔收率示于表4。作用于任何底物时，都是Rh47-3株最生成D-葡萄糖二酸。在Rh47-3株以外的菌株中，在使作用于D-葡萄糖或D-葡萄糖酸钠时，主要生成2-酮基-D-葡萄糖酸，在使作用于D-葡萄糖醛酸钠时，主要生成2种未知物质。

【表2】使作用于D-葡萄糖时的各生成物的摩尔收率(％)

菌株名 D-葡萄糖醛酸 D-葡萄糖二酸 2-酮基-D-葡萄糖酸 其他 Rh47-3株 25.6 50.3 1.3 22.8 TH14-86株 6.7 12.9 60.8 19.6 12-5株 18.2 10.4 49.5 21.9 K591s株 9.4 19.1 53.7 17.8 12-4株 16.3 8.4 57.0 18.3 12-15株 12.1 11.0 61.2 15.7 22-3株 11.5 13.1 55.5 19.9

【表3】使作用于D-葡萄糖酸钠时的各生成物的摩尔收率(％)

菌株名 中间体B D-葡萄糖二酸 2-酮基-D-葡萄糖酸 其他 Rh47-3株 1.6 81.2 2.8 14.4 TH14-86株 0 9.7 61.3 29.0 12-5株 0 22.3 53.7 24.0 K591s株 0 27.2 47.3 25.5 12-4株 0 6.4 65.9 27.7 12-15株 0 22.1 51.6 26.3 22-3株 0 16.2 55.3 28.5

 【表4】使作用于D-葡萄糖醛酸钠盐时各生成物的摩尔收率(％)

菌株名 D-葡萄糖醛酸 D-葡萄糖二酸 其他 Rh47-3株 58.6 36.1 5.3 TH14-86株 32.1 12.4 55.5 12-5株 41.2 16.5 42.3 K591s株 20.8 21.3 57.9 12-4株 42.5 18.8 38.7 12-15株 39.3 11.7 49.0 22-3株 37.7 10.9 51.4

【实施例2】

在本实施例中进行由生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)的D-葡萄糖二酸生成时的中间体A的制备和结构确认。

【(1)中间体A的制备方法】

向5％(w/v)D-葡萄糖溶液500mL，根据上述的方法添加培养的生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)Rh47-3株的清洗菌体(主培养500mL分)，于30℃、以150rpm、以通气量0.2L/分开始氧化反应。

一边用1M氢氧化钠溶液将pH调节到7.0，一边经时进行分析，在D-葡萄糖被完全地氧化的时间点，以10,000rpm离心分离10分钟，回收反应液(中间体A：17.8％、中间体B：2.8％、D-葡萄糖醛酸：75.2％、D-葡萄糖二酸：1.9％、其他：2.3％)。

将回收的反应液之一部分(固体成分5.0g)连续供于填充1L的强酸性离子交换树脂PK-216(三菱化学株式会社)的柱和填充3L的弱碱性离子交换树脂IRA-96SB(有机株式会社)的柱，仅溶出中间体A。溶出液添加1％(w/w)活性炭，脱色之后，进行冷冻干燥，得到纯度98.0％的中间体A粉末0.8g。

【(2)中间体A的结构确认】

使用中间体A的甲醇溶液，在以下的分析条件下，进行质谱分析。

装置：Thermo Quest公司制FINNIGAN LCQ-DECA质谱分析装 置

离子源：ESI

喷雾电压：7kV

毛细管电压：-11V

毛细管温度：150℃

样品浓度：50μg/mL

样品导入速度：10μL/min

中间体A的质谱分析结果示于图2。结果，检测[M-H]^-176.9及[M₂-H]^-354.8的负离子峰。另外，在蚁酸的存在下，检测[M+HCOO] ^-222.8及[M₂+HCOO]^-400.7的2种负离子峰。从峰强度推定，与蚁酸的复合物相比由脱质子发生的负离子更容易地发生，确认不是二羧酸，是分子质量178的二醛。

另外，使用中间体A样品水溶液，进行由Somongyi-Nelson法的还原力测定、及由苯酚硫酸法的全糖量测定。结果，(还原糖量)/(全糖量)的比成为8.02，确认有强的还原性。从这些的结果，中间体A的结构被推定为D-葡萄糖的C1位及C6位的两处变成醛的D-葡萄糖二醛。

【实施例3】

在本实施例中进行由生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)的D-葡萄糖二酸生成时的中间体B的制备和结构确认。

【(1)中间体B钠盐的制备方法】

向3％(w/v)D-葡萄糖酸钠溶液500mL，根据上述的方法添加培养的生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)Rh47-3株的离心菌体(主培养500mL分)，于30℃、以150rpm、以通气量0.2L/分开始氧化反应。一边用1M氢氧化钠溶液将pH调节到7.0，一边经时进行分析，在D-葡萄糖酸被完全地氧化的时间点，以10,000rpm离心分离10分钟，回收反应液(中间体B：71.4％、D- 葡萄糖二酸：26.0％、其他：2.6％)。

将回收的反应液之一部分(固体成分5.0g)浓缩至固体成分成70％之后，冷却至20℃，将中间体B钠盐结晶化。用30％(v/v)乙醇清洗结晶之后，于30℃减压干燥3小时，得到纯度99.5％的中间体B钠盐结晶1.3g。

【(2)中间体B的结构确认】

使用中间体B的甲醇溶液，在以下的分析条件下，进行质谱分析。

装置：Thermo Quest公司制FINNIGAN LCQ-DECA质谱分析装置

离子源：ESI

喷雾电压：5kV

毛细管电压：-11V

毛细管温度：250℃

样品浓度：50μg/mL

样品导入速度：10μL/min

中间体B的质谱分析结果示于图3。

结果，检测[M₂-H]^-193.0及[M₂-H]^-386.8、Na[M₂-H₂]^-408.9的负离子峰，中间体B的分子质量被推定为194。

另外，中间体B的¹H-NMR(300MHz，D₂O)测定结果示于图4， ¹³C-NMR(75MHz，D₂O)测定结果示于图5，H，H-COSY(300MHz，D₂O)测定结果示于图6，C，H-COSY(75MHz，D₂O)测定结果示于图7。

从¹H-NMR及¹³C-NMR的测定结果，如下述一样归属各光谱。 ¹H-NMR(300MHz，D₂O)δ4.86(d，1H，³J_1，2＝8.6Hz，H1)，4.33(s，1H，H5)，4.08(s，2H，H3及H4)，3.63(d，1H，³J_1，2＝8.6Hz，H1).¹³C-NMR(75MHz，D₂O)δ178.6(C6)，96.2(C1)，77.1(C5)，74.0(C3或C4)，73.8(C4或C3)，71.5(C2)。

从以上的结果得出，中间体B的结构是在D-葡萄糖的两端各有1个残基的羧基及醛基的结构，并且由于与D-葡萄糖醛酸不同，因此被 推定为L-古洛糖醛酸(L-古洛糖的糖醛酸)。

【实施例4】

在本实施例中进行ADH(1)、ALDH(2)及ALDH(3)的纯化。

【(1)生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)的培养】

将生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)Rh47-3株及生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)K591s株的琼脂斜面培养菌向含由1.0％乳糖、1.0％酵母提取物、2.0％玉米浆、0.3％硫酸铵(pH7.0)组成的种培养基10mL的试管植菌各自1铂耳，于30℃进行72小时、振荡培养。

接下来，向含由1.0％乳糖、1.0％酵母提取物、2.0％玉米浆、0.3％硫酸铵(pH7.0)组成之前培养基100mL的坂口瓶3瓶，各自植菌各1mL种培养菌液，于30℃进行72小时、振荡培养。

最后，向含由2.0％乳糖、0.5％酵母提取物、1.0％玉米浆、0.5％硫酸铵、0.1％硫酸亚铁、0.01％氯化镧(pH7.0)组成的本培养基30L的发酵槽，全量植菌预培养菌液，在30℃、通气10L/分、搅拌250rpm的条件下进行72小时主培养。培养液以10,000rpm进行10分钟离心分离，回收的菌体用0.9％生理盐水清洗2次。如此，从30L的培养液各自得到约90g的湿润菌体。 

【(2)菌体提取级分的制备】

使回收的湿润菌体30g悬浮于10mM磷酸缓冲液(pH6.5)100mL之后，用弗压碎器破碎菌体。破碎液以18,000rpm进行15分钟离心，回收上清。得到的上清，再以30,000rpm离心60分钟，作为菌体提取级分回收上清。

【(3)离子交换层析】

将Rh47-3株及K591s株的菌体提取级分各自供于用含100mM甘 油的10mM磷酸缓冲液(pH6.5)(之后，简称为缓冲液)平衡化的TOYOPEARL DEAE-650M(Tosoh株式会社)填充柱(内径5.6cm×5cm)。

用缓冲液150mL清洗柱之后，用缓冲液中的氯化钠浓度以500mL成0.35M的直线梯度溶出酶。分取各5mL，根据实施例1所示的活性测定法测定各级分的ADH(1)活性及ALDH(2及3)活性。

在图8(A：Rh47-3株、B：K591s株)示溶出图案。有ADH(1)活性的峰在与Rh47-3株、K591s株大致相同的位置溶出。各自回收此ADH(1)活性级分，用分子量筛截10,000的超滤膜进行浓缩-脱盐。

另一方面，有ALDH(Rh47-3株是2、K591s株是3)活性的峰确认2种，在Rh47-3株中，确认在ADH(1)活性级分之前，在K591s株中，确认在ADH(1)活性级分之前后。这些活性峰之中，各自回收活性高的峰A(Rh47-3株)和峰B(K591s株)的级分，用分子量筛截10,000的超滤膜进行浓缩-脱盐。再有，Rh47-3株、K591s株均在非吸附级分中也确认ALDH(3)活性，但这些酶由于活性低而未进行纯化。

【(4)疏水层析】

向用离子交换层析得到的各级分约3mL等量加含3M硫酸铵的缓冲液之后，以10,000rpm离20分钟而除去不溶物。得到的上清供于用含1.5M硫酸铵的缓冲液平衡化的TOYOPEARL Butyl-650(Tosoh株式会社)填充柱(内径3.0cm×10cm)。

用含1.5M硫酸铵的缓冲液100mL清洗柱之后，用硫酸铵浓度以300mL成0M的直线梯度使吸附的酶溶出。回收ADH(1)活性及ALDH(Rh47-3株是2、K591s株是3)活性的各级分，用分子量筛截10,000的超滤膜进行浓缩-脱盐。再有，在K591s株中，在非吸附级分也确认ALDH(3)活性，但由于此酶活性低，未进行这以上的纯化。

【(5)凝胶过滤层析】

将用疏水层析得到的各级分供于用含0.1M氯化钠的10mM磷酸缓冲液(pH6.5)平衡化的TSK-gel G3000SW柱(内径6.0mm×40cm、 Tosoh株式会社)。以流速0.6mL/分溶出，检测使用UV检测器(280nm)。

如此，各自从Rh47-3株及K591s株纯化有ADH(1)活性的PQQ-ADH(1)，从Rh47-3株纯化有ALDH(2)活性的PQQ-ALDH(2)，从K591s株纯化有ALDH(3)活性的PQQ/Heme-ALDH(4)。纯化酶的总活性、总蛋白质量、比活性如表5所示。

【表5】纯化酶的总活性、总蛋白质量、比活性

【实施例5】

在本实施例中进行PQQ-ADH(1)的特性解析。 

自生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)Rh47-3株及生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)K591s株纯化的ADH(1)显示相同的性质，被鉴定为PQQ-ADH(1)。

【(1)分子量】

将纯化酶用SDS-PAGE解析的结果，本酶的分子量经计算是64,000±5,000。接下来，用实施例4的(5)所述的凝胶过滤层析求出分子量时，分子量经计算是120,000±10,000。从而，本酶被推定为是由单一亚基组成的2聚体。

【(2)N末端氨基酸序列】

将纯化酶转印到PVDF膜之后，本酶的N序列氨基酸序列用全自动蛋白质一级结构分析装置PPSQ-21A(株式会社岛津制作所)解析时，氨基酸序列是Ala-Glu-Thr-Thr-Ser-Glu-Arg-Leu-Leu-Asn。

【(3)辅基】

向纯化酶溶液50μL(360.0μg)加1N盐酸50μL、甲醇250μL而充分混和之后，以12,000rpm离心5分钟。对上清液20μL在下述的 条件下进行HPLC分析。另外，向上清液50μL加2mM二硫代苏糖醇(DTT)10μL之后，同样地，用HPLC进行分析，研究酶中是否含吡咯并喹啉醌(PQQ)。

柱：Cadenza CD-C18(内径4.6mm×7.5cm、Imtakt株式会社)

移动相：含1％(v/v)85％磷酸的30％(v/v)甲醇

流速：1.0mL/分

温度：35℃

检测器：UV(254nm)

结果，酶提取物液和PQQ标准品(吡咯并喹啉醌二钠盐、关东化学株式会社)显示相同的保持时间。另外，将酶提取液用DTT还原之后的保持时间与将PQQ标准品用DTT还原的保持时间一致。以上的结果提示，PQQ-ADH(1)作为构成成分有PQQ。

【(4)最适pH】

使用pH3.0～10.0的0.15M GTA缓冲液，测定氧化活性的结果，PQQ-ADH(1)的最适pH是5.0～5.5。

【(5)底物特异性】

将各底物(D-葡萄糖、D-葡萄糖酸钠、D-葡萄糖醛酸钠、中间体A、中间体B钠)用McIlvaine缓冲液(pH5.0)溶解，根据实施例1所示的ADH的活性测定法测定PQQ-ADH(1)的底物特异性。结果示于表6。再有，对各底物的酶活性表示为以D-葡萄糖作为底物时的酶活性作为100的相对活性。

【表6】PQQ-ADH(1)的底物特异性 

底物 相对活性(％) 0.2M D-葡萄糖 100 0.2M D-葡萄糖酸钠 88.6 0.2M D-葡萄糖醛酸钠 ＜1 0.02M中间体A 59.1 0.2M中间体B钠 2.7

【(6)反应生成物的解析】

向含50mM碳酸钙的底物溶液(50mM D-葡萄糖、50mM D-葡萄糖酸钠、50mM D-葡萄糖醛酸钠、50mM中间体A、50mM中间体B钠)100μL加100mM铁氰化钾溶液90μL、纯化PQQ-ADH(1)溶液10μL(46U)，于30℃开始氧化反应。反应生成物用实施例1所示的糖分析系统定量。反应开始16小时后的反应生成物的摩尔收率的结果示于表7。

【表7】反应生成物的摩尔收率(％)

【实施例6】

在本实施例中进行PQQ-ALDH(2)的特性解析。 

自生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)Rh47-3株纯化的PQQ-ALDH(2)显示以下的性质。

【(1)分子量】

将纯化酶溶液用SDS-PAGE解析的结果，本酶的分子量经计算为61,000±5,000。接下来，用实施例4的(5)所述的条件的凝胶过滤层析求出分子量时，分子量经计算为180,000±10,000。从而，本酶被推定为是由单一亚基组成的3聚体。

【(2)N末端氨基酸序列】

将纯化酶溶液转印到PVDF膜之后，将本酶的N末端氨基酸序列用全自动蛋白质一级结构分析装置解析，但N末端被阻断，无法确定氨基酸序列。

【(3)内部氨基酸序列】

向纯化酶溶液100μL(220.8μg)加V8蛋白酶溶液(将0.1mg的 V8蛋白酶溶解于0.1MTris盐酸缓冲液(pH8.0)1mL的)10μL，于30℃进行16小时反应。将肽片段用SDS-PAGE分离之后，转印到PVDF膜。

将本酶的内部氨基酸序列用全自动蛋白质一级结构分析装置解析时，分子量17kDa的肽片段的氨基酸序列是Phe-Xaa-Ser-Asn-Thr-Asp-Val-Asn-Pro-Leu。

【(4)辅基】

用实施例5的(3)所述的方法进行分析的结果提示，PQQ-ALDH(2)作为构成成分有PQQ。

【(5)最适pH】

使用pH4.0～10.0的GTA缓冲液测定氧化活性的结果，PQQ-ALDH(2)的最适pH是7.5～8.0。

【(6)底物特异性】

将各底物(D-葡萄糖、D-葡萄糖酸钠、D-葡萄糖醛酸钠、中间体A、中间体B钠、乙醛酸钠)用McIlvaine缓冲液(pH8.0)溶解，根据实施例1所示的ALDH的活性测定法测定PQQ-ALDH(2)的底物特异性。结果示于表8。对各底物的酶活性表示为以中间体B钠作为底物时的酶活性作为100的相对活性。 

【表8】PQQ-ALDH(2)的底物特异性 

底物 相对活性(％) 0.2M D-葡萄糖 11.8 0.2M D-葡萄糖酸钠 ＜1 0.2M D-葡萄糖醛酸钠 18.6 0.02M中间体A 476 0.2M中间体B钠 100 0.2M乙醛酸钠 3,050

【(7)反应生成物的解析】

向含50mM碳酸钙的底物溶液(50mM D-葡萄糖、50mM D-葡萄糖酸钠、50mM D-葡萄糖醛酸钠、50mM中间体A、50mM中间体B钠)100μL加100mM铁氰化钾溶液90μL、纯化PQQ-ALDH(2)溶 液10μL(188U)，于30℃开始氧化反应。反应生成物用实施例1所示的糖分析系统定量。反应开始16小时后的反应生成物的摩尔收率的结果示于表9。

【表9】反应生成物的摩尔收率(％)

【实施例7】

在本实施例中进行PQQ/Heme-ALDH(4)的特性解析。

自生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)K591s株纯化的PQQ/Heme-ALDH(4)显示以下的性质。

【(1)分子量】

将纯化酶溶液用SDS-PAGE解析的结果，本酶的分子量经计算为59,000±5,000。接下来，用实施例4的(5)所述的条件的凝胶过滤层析求出分子量时，分子量经计算为130,000±10,000。从而，本酶被推定为是由单一亚基组成的2聚体。

【(2)N末端氨基酸序列】

将纯化酶溶液转印到PVDF膜之后，将本酶的N末端氨基酸序列用全自动蛋白质一级结构分析装置解析，但N末端被阻断，无法确定氨基酸序列。

【(3)内部氨基酸序列】

向纯化酶溶液100μL(200.5μg)加V8蛋白酶溶液(将0.1mg的V8蛋白酶溶解于0.1MTris盐酸缓冲液(pH8.0)1mL的)10μL，于27℃进行16小时反应。肽片段用SDS-PAGE分离之后，转印到PVDF膜。将本酶的内部氨基酸序列用全自动蛋白质一级结构分析装置解析 时，分子量37kDa的肽片段的氨基酸序列是Ala-Ser-Trp-Asn-Gly-Val-Pro-Pro-Glu-Asn。

【(4)辅基】

用实施例5的(3)所述的方法进行分析的结果提示，PQQ/Heme-ALDH(4)作为构成成分有PQQ。另外，向纯化酶溶液(100.4μg/mL)添加1MTris盐酸缓冲液(H9.0)1/20量之后，测定加连二亚硫酸钠至终浓度成5mM的溶液的吸收光谱。结果，在522及550nm处确认吸收极大值，提示PQQ/Heme-ALDH(4)除PQQ之外，作为辅基有血红素c。

【(5)最适pH】

使用pH4.0～10.0的GTA缓冲液测定氧化活性的结果，PQQ-ALDH(4)的最适pH是7.5～8.0。

【(6)底物特异性】

将各底物(D-葡萄糖、D-葡萄糖酸钠、D-葡萄糖醛酸钠、中间体A、中间体B钠、乙醛酸钠)用McIlvaine缓冲液(pH8.0)溶解，根据实施例1所示的ALDH的活性测定法，测定PQQ/Heme-ALDH(4)的底物特异性。结果示于表10。对各底物的酶活性表示为以D-葡萄糖酸钠作为底物时的酶活性作为100的相对活性。

【表10】PQQ/Heme-ALDH(4)的底物特异性 

底物 相对活性(％) 0.2M D-葡萄糖 35.1 0.2M D-葡萄糖酸钠 100 0.2M D-葡萄糖醛酸钠 2.9 0.02M中间体A 11.6 0.2M中间体B钠 21.1 0.2M乙醛酸钠 20,260

【(7)反应生成物的解析】

向含50mM碳酸钙的底物溶液(50mM D-葡萄糖、50mM D-葡萄糖酸钠、50mM D-葡萄糖醛酸钠、50mM中间体A、50mM中间体B钠)100μL加100mM铁氰化钾溶液90μL、纯化PQQ/Heme-ALDH (4)溶液10uL(1,680U)，于30℃开始氧化反应。反应生成物用实施例1所示的糖分析系统定量。反应开始16小时后的反应生成物的摩尔收率的结果示于表11。仅在将D-葡萄糖醛酸钠作为底物时，略微生成D-葡萄糖二酸。

【表11】反应生成物的摩尔收率(％)

【实施例8】

在本实施例中进行由纯化酶的D-葡萄糖二酸的生成反应。

向含50mM碳酸钙的底物溶液(50mM D-葡萄糖、50mM D-葡萄糖酸钠、50mM D-葡萄糖醛酸钠)100μL各加5μL 100mM铁氰化钾溶液90μL、纯化酶溶液(PQQ-ADH(1)：23U、PQQ-ALDH(2)：94U、PQQ/Heme-ALDH(4)：840U)或纯水，于30℃进行36小时反应，用实施例1所示的糖分析系统定量生成的D-葡萄糖二酸或2-酮基-D-葡萄糖酸。

结果示于表12。通过组合PQQ-ADH(1)和PQQ-ALDH(2)，从D-葡萄糖或D-葡萄糖酸生成D-葡萄糖二酸。另一方面，用PQQ-ADH(1)和PQQ/Heme-ALDH(4)的组合，则从D-葡萄糖或D-葡萄糖酸完全不生成D-葡萄糖二酸，主要生成2-酮基-D-葡萄糖酸。 

【表12】由纯化酶的D-葡萄糖二酸、2-酮基-D-葡萄糖酸的生成反应

【实施例9】

在本实施例中进行生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)Rh47-3株的基因组草图解析。

从生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)Rh47-3株的培养菌体使用GenElute TM Bacterial Genomic DNA kit(SIGMA公司)回收基因组DNA。将基因组DNA片段化为500bp左右的尺寸之后，连接带生物素的适配体。使用链霉亲和素磁珠回收单链DNA，用生物分析仪2100(Agilent公司)确认DNA的尺寸及浓度。

将单链DNA和固定化适配体互补序列的珠混合后，进行EmulsionPCR。PCR后，向板添加适当量的珠，由使用GS Titanium Sequencing kit XLR70及Genome Sequencer FLX System(Roche Diagnostics公司)的焦磷酸测序法解析碱基序列。

结果，解析总碱基数是106,737,181个碱基、4k碱基以上的重叠组数20、4k碱基以上的总重叠组碱基数是3,875,227个碱基。

在解析的碱基序列中，推定的氨基酸翻译区域存在4,345个位置，相同性检索的结果，与脱氢酶确认相同性的序列被确认273个。在这 些推定氨基酸序列中，含与在实施例5、6、7解读的PQQ-ADH(1)的N-末端氨基酸序列、PQQ-ALDH(2)的内部氨基酸序列、PQQ/Heme-ALDH(4)的内部氨基酸序列一致的序列。

【实施例10】

在本实施例中进行PQQ-ADH(1)、PQQ-ALDH(2)、PQQ/Heme-ALDH(4)基因的碱基序列的确定。

以生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)Rh47-3株及K591s株的基因组DNA作为模板，基于在实施例9得到的草图解析的碱基序列信息，设计引物。

使用设计的引物(PQQ-ADH(1)正向引物：SEQ ID NO：4、PQQ-ADH(1)反向引物：SEQ ID NO：5、PQQ-ALDH(2)正向引物：SEQ ID NO：6、PQQ-ALDH(2)反向引物：SEQ ID NO：7、PQQ/Heme-ALDH(4)正向引物：SEQ ID NO：8、PQQ/Heme-ALDH(4)反向引物：SEQ ID NO：9)及Pfx50DNA聚合酶(Life Technologies公司)进行PCR，确定Rh47-3株及K591s株的PQQ-ADH(1)、PQQ-ALDH(2)、PQQ/Heme-ALDH(4)的各基因区域的碱基序列。

Rh47-3株来源PQQ-ADH(1)基因的碱基序列及推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1。PQQ-ADH(1)基因由1,800bp(599个的氨基酸残基)构成，其氨基酸序列与慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)来源的醌蛋白乙醇脱氢酶示42％的相同性。再有，K591s株来源的PQQ-ADH(1)基因是与Rh47-3株来源PQQ-ADH(1)基因相同的序列。

Rh47-3株来源PQQ-ALDH(2)基因的碱基序列及推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。PQQ-ALDH(2)基因由1,761bp(586个的氨基酸残基)构成，其氨基酸序列与耐盐海洋杆菌(Pelagibacterium halotolerans)来源的甲醇脱氢酶大亚基蛋白示35％的相同性。

再有，K591s株来源的PQQ-ALDH(2)基因在Rh47-3株来源 PQQ-ALDH(2)基因的第1533A是G，但翻译的氨基酸均是亮氨酸(Leu)。

Rh47-3株来源PQQ/Heme-ALDH(4)的碱基序列及推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO：3。PQQ/Heme-ALDH(4)基因由1785 bp(594个的氨基酸残基)构成，其氨基酸序列与耐盐海洋杆菌(Pelagibacterium halotolerans)来源的甲醇脱氢酶大亚基蛋白示41％的相同性。

再有，K591s株来源的PQQ/Heme-ALDH(4)基因在Rh47-3株来源PQQ/Heme-ALDH(4)基因的第224T是C，氨基酸是异亮氨酸(Ile)是苏氨酸(Thr)。

【实施例11】

在本实施例中，从D-葡萄糖进行D-葡萄糖二酸的大量制备。

根据实施例4中记载的方法，将生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)Rh47-3株以30L规模培养。向10g/L浓度的D-葡萄糖溶液30L添加用离心分离(6,000rpm、20分钟)回收的菌体，在温度30℃、搅拌速度150rpm、通气量10L/分的条件下进行反应。反应中用12％(w/v)氢氧化钠溶液将pH调节到7.0。

经时进行采样，将生成的D-葡萄糖二酸用实施例1所示的糖分析系统定量。结果，如图9所示，反应68小时后，生成最大7.0g/L(摩尔收率60.3％)的D-葡萄糖二酸。

【实施例12】

在本实施例中，从D-葡萄糖酸钠进行D-葡萄糖二酸的大量制备。

根据实施例2中记载的方法，将生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)Rh47-3株用30L规模培养。向30g/L浓度的D-葡萄糖酸钠溶液30L添加用离心分离(6,000rpm、20分钟)回收的菌体，在温度30℃、搅拌速度150rpm、通气量10L/ 分的条件下进行反应。

在反应中用12％(w/v)氢氧化钠溶液将pH调节到7.0。经时进行采样，将生成的D-葡萄糖二酸用实施例1所示的糖分析系统定量。结果，如图10所示，反应82小时后，生成最大22.5g/L(摩尔收率78.6％)的D-葡萄糖二酸。

【实施例13】

在本实施例中进行由纯化酶的D-葡萄糖二醛(中间体A)的生成反应。 

向含50mM碳酸钙的底物溶液(50mM D-葡萄糖)100μL加100mM铁氰化钾溶液90μL、纯化PQQ-ADH(1)溶液10μL(46U)，于30℃开始氧化反应。反应生成物用实施例1所示的糖分析系统定量。反应开始16小时后，生成摩尔收率68.8％的D-葡萄糖二醛(中间体A)。

【实施例14】

在本实施例中进行由纯化酶的L-古洛糖醛酸(中间体B)的生成反应。 

向含50mM碳酸钙的底物溶液(50mM D-葡萄糖酸钠)100μL加100mM铁氰化钾溶液90μL、纯化PQQ-ADH(1)溶液10μL(46U)，于30℃开始氧化反应。反应生成物用实施例1所示的糖分析系统定量。反应开始16小时后，生成摩尔收率77.4％的L-古洛糖醛酸(中间体B)钠。

【实施例15】

在本实施例中，从D-葡萄糖进行L-古洛糖醛酸(中间体B)的大量制备。 

根据实施例4中记载的方法，将生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)Rh47-3株以30L规模培养。 向10g/L浓度的D-葡萄糖溶液30L添加用离心分离(6,000rpm、20分钟)回收的菌体，在温度30℃、搅拌速度150rpm、通气量10L/分的条件下进行反应。

在反应中用12％(w/v)氢氧化钠溶液将pH调节到7.0。经时进行采样，将生成的L-古洛糖醛酸用实施例1所示的糖分析系统定量。结果，反应12小时后，生成最大2.2g/L(摩尔收率18.3％)的L-古洛糖醛酸(中间体B)钠。

【实施例16】

在本实施例中，从D-葡萄糖酸钠进行L-古洛糖醛酸(中间体B)的大量制备。 

根据实施例4中记载的方法，将生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)Rh47-3株以30L规模培养。向30g/L浓度的D-葡萄糖酸钠溶液30L添加用离心分离(6,000rpm、20分钟)回收的菌体，在温度30℃、搅拌速度150rpm、通气量10L/分的条件下进行反应。

在反应中用12％(w/v)氢氧化钠溶液将pH调节到7.0。经时进行采样，将生成的L-古洛糖醛酸用实施例1所示的糖分析系统定量。结果，反应24小时后，生成最大14.9g/L(摩尔收率41.3％)的L-古洛糖醛酸(中间体B)钠。

【工业实用性】

如以上详述，本发明涉及D-葡萄糖二酸生产菌及D-葡萄糖二酸的制造方法，由本发明，可提供D-葡萄糖二酸生产能力升高的微生物。另外，使用D-葡萄糖二酸生产能力升高的微生物，可廉价并且有效制造，提供D-葡萄糖二酸。另外，可提供制造在制造D-葡萄糖二酸时作为中间物质生成的D-葡萄糖二醛(中间体A)及L-古洛糖醛酸(中间体B)的方法。再者，可提供有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其有80％以上的相同性的氨基酸序列的醇脱氢酶ADH(1)、及有SEQ  ID NO：2的氨基酸序列或与其有80％以上的相同性的氨基酸序列的醛脱氢酶ALDH(2)。本发明作为提供为了制造D-葡萄糖二酸而使用的D-葡萄糖二酸生产能力升高的微生物及D-葡萄糖二酸的有效的制造方法相关的新技术有用。

【微生物保藏信息】

国际保藏机构名称：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心

国际保藏机构地址：日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8120号室(邮政编码292-0818)

国际保藏日：2007年4月26日

国际保藏号：FERM BP-10820 

微生物的标识号：Rh47-3