声明
第一章 绪论
1.1 D-葡萄糖二酸简介
1.1.1 D-葡萄糖二酸的理化性质
1.1.2 D-葡萄糖二酸的用途
1.2 国内外对D-葡萄糖二酸合成途径的研究进展
1.2.1 化学法生产D-葡萄糖二酸
1.2.2 微生物法合成D-葡萄糖二酸的研究进展
1.3 代谢工程改造策略
1.3.1竞争性副产物相关基因的敲除
1.3.2 关键酶的表达翻译水平调节
1.3.3 酶的热稳定性改造
1.4 无细胞生物催化系统概述
1.4.1 无细胞生物催化系统研究进展
1.4.2 无细胞生物催化系统的应用
1.4.3 无细胞生物催化系统中辅因子和能量再生策略
1.4.4 无细胞生物催化系统的优势和挑战
1.5 本课题研究意义及主要研究内容
1.5.1 本课题的研究意义
1.5.2 本课题的主要内容
第二章“一步法”合成D-葡萄糖二酸的研究
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 菌株和质粒
2.2.2 培养基
2.2.3 仪器和设备
2.2.4 试剂、酶及相关试剂盒
2.3 实验方法
2.3.1 大肠杆菌（E. coli DH α）的质粒提取
2.3.2 基因组提取
2.3.3 酶切和连接
2.3.4 DNA片段胶回收
2.3.5 大肠杆菌感受态的制备与转化
2.3.6 重组蛋白的诱导表达和纯化
2.3.7 蛋白浓度测定
2.3.8 重组葡萄糖醛酸脱氢酶Udh的辅因子依赖性研究和酶活测定
2.3.9 重组葡萄糖醛酸脱氢酶Udh的最适反应温度及热稳定性研究
2.3.10 重组葡萄糖醛酸脱氢酶Udh的最适反应pH及pH稳定性研究
2.3.11 金属离子和化学试剂对重组葡萄糖醛酸脱氢酶Udh活性的影响
2.3.12 重组葡萄糖醛酸脱氢酶Udh的酶促反应动力学研究
2.3.13 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404Udh的三维结构建模
2.3.14 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404 Udh突变位点的选择
2.3.15 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404 Udh突变文库的构建
2.3.16 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404Udh突变文库的筛选
2.3.17 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404 Udh突变体的分离纯化
2.3.18 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404 Udh突变体的酶活测定
2.3.19 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404 Udh突变体的酶学性质研究
2.3.20 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404 Udh突变体的热稳定性考察
2.3.21 重组全细胞催化D-葡萄糖醛酸产D-葡萄糖二酸
2.4 结果与讨论
2.4.1 编码葡萄糖醛酸脱氢酶Udh的载体构建及诱导表达
2.4.2 葡萄糖醛酸脱氢酶Udh的辅因子依赖性
2.4.3 葡萄糖醛酸脱氢酶Udh的最适反应温度及热稳定性研究
2.4.4 葡萄糖醛酸脱氢酶Udh的最适反应pH及pH稳定性研究
2.4.5 金属离子和化学试剂对重组葡萄糖醛酸脱氢酶Udh酶活影响
2.4.6 重组葡萄糖醛酸脱氢酶催化反应动力学参数研究
2.4.7 重组葡萄糖醛酸脱氢酶（AtLBA4404 Udh）突变位点的选取
2.4.8 重组葡萄糖醛酸脱氢酶突变文库筛选
2.4.9 部分突变体酶的最适温度和最适pH测定
2.4.10葡萄糖醛酸脱氢酶Udh突变体的催化反应动力学参数
2.4.11 突变体酶的热稳定性研究
2.4.12 全细胞催化D-葡萄糖醛酸合成D-葡萄糖二酸的过程曲线
2.5 本章小结
第三章 代谢工程构建高产D-葡萄糖二酸的大肠杆菌工程菌株的研究
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 菌株和质粒
3.2.2 培养基
3.2.3 仪器和设备
3.2.4 试剂、酶及相关试剂盒
3.3 实验方法
3.3.1 大肠杆菌的质粒提取
3.3.2 基因组提取
3.3.3 酶切和连接
3.3.4 DNA片段胶回收
3.3.5 大肠杆菌感受态的制备与转化
3.3.6 菌株培养和发酵条件
3.3.7 产物的发酵和检测方法
3.3.8大肠杆菌基因组基因敲除流程
3.3.9 D-葡萄糖二酸合成途径质粒及敲除副产物途径基因构建
3.4 大肠杆菌对D-葡萄糖二酸耐受性试验
3.5 结果与讨论
3.5.1 大肠杆菌对D-葡萄糖二酸的耐受性
3.5.2 利用工程菌株从D-葡萄糖合成D-葡萄糖二酸
3.5.3 考察不同拷贝数质粒对D-葡萄糖二酸产量的影响
3.5.4 筛选最适的大肠杆菌宿主来提高生产D-葡萄糖二酸性能
3.5.5 基于 CRISPR/pCas系统的菌体中心代谢途径改造
3.5.6 miox基因的改造
3.5.7 发酵条件优化
3.6 本章小结
第四章 无细胞生物催化系统合成D-葡萄糖二酸的研究
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 菌株和质粒
4.2.2 培养基
4.2.3 仪器和设备
4.3 实验方法
4.3.1 分子生物学操作
4.3.2 D-葡萄糖二酸无细胞生物催化系统中7种酶的诱导表达及纯化
4.3.3 D-葡萄糖二酸无细胞生物催化中的各个酶活测定
4.3.4 D-葡萄糖二酸无细胞生物生物催化系统中各个条件优化
4.4 结果与讨论
4.4.1 D-葡萄糖二酸无细胞生物催化系统的可行性分析
4.4.2 D-葡萄糖二酸无细胞生物生物催化系统中酶的选取及限速步骤分析
4.4.3 D-葡萄糖二酸无细胞生物催化系统中条件优化
4.4.4 D-葡萄糖二酸无细胞生物催化体系中酶浓度优化
4.4.5 D-葡萄糖二酸无细胞生物催化体系中pH调控
4.5 本章小结
结论与展望
主要结论
本论文创新点
展望
参考文献
附录
攻读博士学位期间取得的研究成果
致谢
答辩决议书
华南理工大学;
