在测定叶酸的情形中特别有用的叶酸衍生物

摘要

本发明涉及叶酸衍生物用于体外测定样品诸如生物样品中的叶酸的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及用于在体外生物样品中，优选地应用非放射性同位素竞争 技术测定叶酸中特别有用的叶酸衍生物。

现有技术

维生素B9是给予都源自叶酸(folic acid)的化学和生物学上非常密切 相关的化合物家族的通用名称。这些化合物的主要特性之一是，它们的以 不足量的存在，或它们的实际的不存在，导致在人或动物中贫血。叶酸家 族包括，除其他外，维生素M、维生素Bc、叶酸类似物(folacin)和叶酸。 在本申请的意义内，属于该家族的化合物的每个被称为“叶酸(folate)”， 该家族的多个成员被称为“叶酸(folates)”，而维生素B9家族的成分的混 合物被称为“总叶酸”。

如本领域技术人员熟知的，叶酸，还称为蝶酰基单谷氨酸 (pteroylmonoglutamic acid)，由蝶呤基团、对氨基苯甲酸基团和谷氨酸酯/ 盐基团形成，如以下由通式(G)所示：

其中n是整数1。

如该通式中所示，叶酸在其谷氨酸酯/盐部分上具有两个羧酸功能，一 个在α位置，另一个在γ位置。

在食品中，叶酸主要呈还原的甲基多聚谷氨酸酯/盐或甲酰基多聚谷氨 酸酯/盐的形式。在消化后，这些聚谷氨酸酯/盐转化为单谷氨酸酯/盐 (monoglutamates)，被肠细胞主动地吸收。然后，单谷氨酸酯/盐转化为5- 甲基四氢叶酸(5-MTHF)，叶酸以这种形式穿过肠屏障并进入全身循环。

在血液中，循环叶酸的主要部分以弱亲和力结合各种蛋白：α2巨球蛋 白(40％)、白蛋白(33％)和转铁蛋白(23％)。维生素B9的血浆浓度从 5μg/L至15μg/L变化，并很大程度上受食物摄取的影响。维生素B9浓度 在红细胞中高约20倍，其可包含高达95％的循环叶酸。叶酸的多种形式 存在于人血清中，但占优势的循环和细胞内的形式是5-甲基四氢叶酸 (5-MTHF)，其还呈肝存储的形式。通常，生物活性化合物单独呈还原形式： 二氢叶酸(DHF)和主要四氢叶酸(THF)，以及其甲基或甲酰基衍生物。如上 所述，在本申请的意义内，名称“叶酸”包括特别是这些还原形式；分别地 取的所述的形式的每个，被称为“叶酸”。

真核细胞，以及某些原核细胞，不能合成叶酸。因此，它们使用允许 内化外源分子的跨膜运输系统。目前，已描述了两种主要的运输系统。然 而，很可能还存在次要途径，诸如被动扩散。氧化叶酸如叶酸由叶酸受体 (FR)在细胞内运输，“叶酸受体”在英语语言中(Antony,1992[1])。这些蛋白 以前被称为“叶酸结合蛋白”(FBP)。在人类中已鉴定了三种亚型，分别称 为FRα(P15328)、FRβ(P14207)和FRγ(P41439)，括号之间所示的代码对应 于该蛋白在UniProt数据库中的标识符(http://www.uniprot.org)。FRα和β 由脂质部分，糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在质膜中。γ亚型是分泌的。另一 方面，还原的叶酸，由英语中称为还原的叶酸载体(P41440)或“还原叶酸载 体”(RFC)的蛋白来运输。这是高度糖基化的整合膜蛋白，其具有多个跨膜 域。

由于它们的化学结构，叶酸在我们的有机体的基本成分即氨基酸和碱 基(嘌呤和嘧啶)的合成及代谢中发挥重要作用。

THF，重要的辅酶，能够固定并转移自由基至碳原子。它参与甘氨酸 的合成及组氨酸的分解代谢。

5-MTHF允许通过甲基钴胺素和甲硫氨酸合成酶将高半胱氨酸再次甲 基化为甲硫氨酸。叶酸还参与嘌呤和嘧啶的生物合成的几个关键步骤，从 而影响核酸DNA和RNA的合成。由于这种核心作用，叶酸缺乏具有严重 的后果和许多生理病理表现。

严重叶酸缺乏通常引起血液学和神经精神病学迹象。慢慢地，出现乏 力和厌食。贫血可以以单独的大红细胞症为先导。通常是巨幼红细胞类型 的这种贫血，是叶酸缺乏的最常见的表现之一。此外，通常还存在叶酸和 铁的组合的缺乏，其导致伴随涂片上Jolly小体的存在的正常红细胞贫血， 而不是经典大红细胞贫血。该贫血是由于这样的事实：嘌呤和嘧啶不以足 够的量供应，从而导致血液干细胞合成遗传物质并因此分开的不可能性。 相反，现有的细胞继续生长，其通常部分解释了与叶酸缺乏相关的贫血的 巨幼红细胞类型。

叶酸还对大脑的正常运作是必要的，并有助于心理健康和情绪平衡。 因此，维生素B9缺乏导致神经精神病学问题。这些问题可部分地与某些 胺和甘氨酸的合成中的异常现象有关。后者还是神经递质。

由于其对遗传物质的合成的贡献，叶酸的令人满意的摄入在童年时 期、青春期和妊娠期间是特别必要的。事实上，精神运动性阻滞和身长- 重量发育不良(staturo-ponderal hypotrophy)经常发现于具有叶酸缺乏的儿 童中。在妊娠期间，叶酸缺乏可引起在胎儿发育的延迟或异常，或甚至先 天性畸形诸如是神经管的不完全闭合的脊柱裂，或甚至三体型。

叶酸缺乏还与心血管疾病，更确切地动脉和/或静脉形成血栓和动脉硬 化(atheroscleroses)的风险增加相关。该风险与血浆高半胱氨酸水平的增加 相关，起因于缺乏该化合物变为甲硫氨酸的甲基化。

这个列表不是限制性的，且叶酸缺乏可引起其他紊乱/病理学。因此首 要的是能测定人或动物个体中全部或部分叶酸，优选地“总”叶酸，即由不 同叶酸形式的混合物形成的。

此外，还重要的是能够定量食物来源(意在人或动物摄取)的样品中存 在的全部或部分叶酸，以证实讨论中的食物的维生素B9的贡献。测定食 品类产品中的叶酸还可证明是有利的，以便确保这些包含叶酸的足够的量 /浓度。此类食物补充剂可特别用于预防可能的维生素B9缺乏。

测定全血、血清、血浆或红血细胞中的叶酸，从临床观点来看具有一 定的优势。血液叶酸浓度的减少可能导致表示应该临床研究可能与其他维 生素或代谢物测定相关的缺乏。血液叶酸水平受取决于饮食或药物的服用 的变化支配。红血细胞的叶酸水平给出生物体的叶酸储备的最佳估计值。

存在几种方法，以允许定量临床来源，即来自患者的生物样品中的血 浆、血清和/或红细胞叶酸。这些方法可分类为三个主要的组，即：(1)微生 物学技术、(2)色谱技术、及(3)竞争免疫测定。

微生物学技术(1)通常使用“叶酸依赖性”种子，其的生长与待测定的样 品中存在的维生素水平成比例。通常，将样品在作为抗氧化剂的维生素C 的存在下在100℃脱蛋白。与细菌菌株的接触在37℃下进行20小时。最 常用的种子细菌，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，对叶酸的所有氧化和还 原的形式敏感；其他种子对更特定的形式敏感。例如，粪链球菌 (Streptococcus faecalis)允许除了5-MTHF以外的所有形式的叶酸的测定。 在血清和红血细胞中的优势形式的5-MTHF的浓度，由干酪乳杆菌和粪链 球菌的值之间的差异来获得。第三种子，啤酒片球菌(Pediococcus  cerevisiae)，仅对N5-甲酰基-THF(亚叶酸)敏感。

虽然通常这些微生物技术(1)敏感并可再现，但冗长并耗时。此外，它 们存在干扰抗生素和抗有丝分裂剂，诸如甲氨蝶呤、甲氧苄啶和乙胺嘧啶 的风险。

色谱类型(2)的测定允许分离属于叶酸家族的不同的化合物。作为色谱 测定的实例，可特别列举：

-与HPLC结合的薄层色谱测定(Reif,V.D.等人，1977[2])，

-与质谱分析法(MS)结合的色谱测定(通常气相或液相)，例如：

a)带有同位素稀释的气相色谱/质谱分析法(ID-GCMS)(Dueker,S.R等 人2000[3])，或

b)与同位素稀释串联的液相色谱/质谱分析法(ID-LC-MS/MS)(Pfeiffer, C.M.等人，2004[4])。

色谱类型(2)的这些测定显著地具有需要开发完全技术测试，需要合格 人员的缺点。此外，证明仪器是昂贵的。

考虑到实施微生物(1)和色谱(2)技术遇到的问题(参见上文)，已开发了 竞争免疫测定(3)。尽管减少分析时间，这些后者(3)允许“总”叶酸的测定， 并因此，提供涉及可能的叶酸缺乏的可靠的临床诊断。

这些免疫测定方法(3)，还称为免疫测定或免疫化学测试，包括，将待 检测的分析物(在这种情况下是叶酸)与是该分析物的结合配对物(binding  partner)的至少第一化合物结合。当叶酸测定通过竞争实现时，方法还包 括参加与待测定、有关固定在结合配对物上的叶酸竞争的至少第二化合 物，该第二化合物是叶酸衍生物。该反应的监测包括标记两种化合物中的 一个。该标记的化合物称为标记的缀合物或示踪物。

当然，前缀“免疫”，例如在“免疫测定”中，在本申请中不被认为是严 格指示，结合配对物是免疫学配对物，诸如抗体或抗体片段。事实上，如 本领域技术人员熟知的，该术语更广泛地用于指定测试和方法，其中结合 配对物，还称为配体，不是免疫配对物，但由，例如，需要待测定的分析 物的受体组成。条件是结合配对物能够优选地以特异性方式结合分析物。 因此，已知，使用术语ELISA(酶联免疫吸附测定)用于使用严格意义上的 非免疫结合配对物的测定，在英语中更广泛称为“配体结合测定”，其可翻 译成法语为“Dosage utilisant la liaison à un ligand”，而术语“免疫”包括在首 字母缩略词ELISA中。为了清楚和一致起见，在本申请中使用术语“免疫” 以指定使用合适的结合配对物优选地以特异性方式结合待定量的分析物 的任何测定，甚至当该结合配对物不是最严格意义上的免疫学性质或来源 时。

在竞争免疫测定(3)的情形下，并且当使用标记的缀合物时，取决于标 记的缀合物的性质及由所述缀合物发射的信号的类型区分三种类型的竞 争免疫测定，即：

-放射性同位素免疫分析(Waxman S.和Schreiber C.,1980[5])，

-免疫酶测定法或EIA“酶联免疫-测定”；取决于选择的酶底物，信号 可呈荧光的比色类型(Hansen,S.I.和Holm J.,1988[6])或化学发光类型，

-电化学发光免疫测定(Owen,W.E.和Roberts W.L.2003[7])。

竞争免疫测定的后两种类型称为“非放射性同位素竞争免疫测定”。

放射性同位素方法(RIA)的发展，从20世纪60年代，使维生素且特别 是维生素B9的定量彻底改变。

专利申请WO 80/00562通过公开由谷氨酸酯/盐衍生物取代在α碳和/ 或γ碳携带的羧酸官能团的放射性叶酸衍生物阐明了这一点。放射性标记 来自碘-125或130在酪氨酸结构的苯酚环中的插入。

法国专利申请FR-A-2455602还涉及获得放射性碘化的化合物，并提 到通式的蝶酸衍生物：

其中谷氨酸酯/盐基团被基团X代替，该基团X表示，当需要时，必定包 含对于放射性同位素标记(用碘125、131或123)不可缺少的芳香环或杂环 的氨基酸或“脱-羧基氨基酸”的残基。该碘化的芳香环或杂环通过不包含多 于5个碳原子的链从对氨基苯甲酸基团分离，所述链由仲胺附着于对氨基 苯甲酸基团。作为包含芳香环或杂环的“脱-羧基氨基酸残基”，公开了以 下结构：

然而，这些放射性同位素测定(RIA)，特别具有放射性废物处理和标记 的试剂的半衰期相对短的持续时间的缺点。

这是已开发对如今仅很少使用的RIA不利的非放射性同位素竞争免疫 测定的原因。

以实例说明，出版物Arcot J.等人，2005[8]描述了用于通过结合于以 酶加标签的蛋白测定叶酸的工艺(在英语语言中“酶-标记的蛋白结合测 定”)，所述标记的蛋白是FBP，且工艺方法是基于生物样品中游离叶酸的 分子与预先固定在微量滴定板上以固定标记的FBP的那些分子之间的竞 争。冲洗后，启示步骤通过引入无色的酶底物，在由固定于FBP的酶切割 后引起蓝色着色来进行。如通常在竞争测定的情况下，样品中存在的游离 叶酸的量通过参考校正曲线来确定，游离叶酸存在于样品中的量根据测量 的发光强度从校正曲线来推理。

Abbott Axsym叶酸试剂盒(目录号B7K460,Abbott Laboratories)还允许 实施竞争叶酸测定方法。作为结合配对物，该试剂盒使用蛋白FBP，且作 为标记的缀合物，使用结合至碱性磷酸酶(ALPA)的蝶酸(一种叶酸类似物)。 测试的原理是基于待测定的叶酸与在固定至可溶性FBP的情形中的以上 提及的缀合物之间的竞争。竞争反应后，使FBP与抗FBP单克隆抗体接 触且抗原-抗体反应发生。所述抗体共价结合至一种聚阴离子羧基甲基直 链淀粉(carboxymethylamylose)。因此，复合物在带正电荷的基质上通过聚 阴离子-聚阳离子静电相互作用来捕获。然而，申请人已发现了，该测定的 灵敏度并不完全令人满意，特别是关于低叶酸浓度的定量。

因此，存在改进非放射性同位素叶酸免疫测定的分析灵敏度，以获得 在临床来源的样品(生物样品)中和/或在包含低叶酸浓度的农业食品来源的 样品中可用的方法的迫切需要。

发明陈述

申请人已出乎预料地发现了，允许纠正以上提及的全部或部分缺点的 新颖叶酸衍生物，由于它们在非放射性同位素竞争测定(诸如免疫测定)中 的使用，特别是作为示踪物，允许获得增强的分析灵敏度，特别是在最低 叶酸浓度的范围中。

因此，本发明的目的涉及使用叶酸衍生物用于体外在样品，诸如生物 样品中测定叶酸，所述测定是非放射性同位素竞争免疫测定且所述叶酸衍 生物在α位置中被脱羧基。所述α位置诸如在以上提及的通式(G)中示出。

事实上，申请人已以惊讶的方式特别地发现，在α位置脱羧基的叶酸 衍生物显著改进了非放射性同位素竞争免疫测定的分析灵敏度，允许在体 外测定叶酸。

优选地，根据本发明的叶酸衍生物不同于由权利要求1中的式(A)和(B) 分别表示的NSP-DMAE-HD-蝶酸(NSP-DMAE-HD-pteroate)和 NSP-DMAE-HEG-蝶酸化合物。

有利地，根据本发明的叶酸衍生物不包含-(O-CH₂-CH₂)-结构，且不同 于由权利要求1中的式(A)表示的NSP-DMAE-HD-蝶酸化合物。

如上所述，前缀“免疫”，例如在术语“免疫测定”中，不必狭义地解释 为指定免疫学性质和/或来源的结合配对物，诸如抗体。事实上，在竞争免 疫学测试中使用的结合配对物可以是，例如，为需要测定的分析物的受体， 在这种情况下，是叶酸受体。根据本发明可适用的非放射性同位素免疫测 定技术可以是本领域技术人员已知的应用以足够的亲和力结合叶酸的结 合配对物用于正确进行的竞争测定的任何技术。

根据优选的实施方案，根据本发明的叶酸衍生物用于测定多种叶酸， 或甚至，优选地，总叶酸(如以上定义)。

根据具体的实施方案，根据本发明的叶酸衍生物用于测定叶酸(蝶酰基 单谷氨酸)。

在本申请中术语“以测定”和“测定”涉及，讨论中的分析物，即叶酸的 量/浓度的确定。

本发明还具有使用叶酸衍生物体外在样品诸如生物样品中测定叶酸 作为其目的，所述测定是竞争免疫测定，优选地非放射性同位素竞争免疫 测定，所述叶酸衍生物响应通式(I)：

其中：

X是包含1至10个碳原子的脂族烃链，其中放置在α位置的碳不携 带酰基官能团诸如羧酸官能团；

Y代表适合于允许结合单独分子M，诸如蛋白的官能团，所述结合包 括在Y与由所述单独分子M携带的官能团之间的至少一个共价键的形成。

本发明还具有使用叶酸衍生物体外在样品诸如生物样品中测定叶酸 作为其目的，所述测定是竞争免疫测定，优选地非放射性同位素竞争免疫 测定，所述叶酸衍生物响应通式(I)：

其中：

-X是包含1至10个碳原子的脂族烃链；

-Y代表适合于允许结合单独分子M，诸如蛋白的官能团，所述结合 包括在Y与由所述单独分子M携带的官能团之间的至少一个共价键的形 成。

在本发明的含义内，“脂族烃链”理解为线性或开放的支链(非环)的烃 链。根据参考著作中普遍接受并提出的定义，在本发明的含义内，烃链必 须相当明显地被理解为仅包含氢(H)和碳(C)。换言之，脂族烃链X仅由以 上提及的官能团Y官能化，且根据定义，不包含杂原子(诸如氧、氮、硫、 磷、卤素等)。

在根据本发明的叶酸衍生物的α位置中脱酰化(其中脱羧基是一个实 例)与包含从1个至10个碳原子的脂肪烃链的组合，导致叶酸衍生物当它 们用于竞争免疫测定(优选地非放射性同位素竞争免疫测定)中时给出卓越 的分析灵敏度。

所述分子M是，例如，标记分子Mm。该分子M还可以由化学臂或“连 接物”组成。

优选地，X是包含从2个至7个碳原子、优选地从3个至5个碳原子 的烃链，有利地，X是3个碳原子或5个碳原子的烃链。

有利地，X是饱和烃链。

优选地，X是线性烃链。

根据特别优选的实施方案，X是线性且饱和的脂族烃链，包含如以上 定义的碳原子数目。换言之，根据该特别优选的实施方案，根据本发明的 叶酸衍生物可由以下通式(I’)表示：

其中：

-n是1和10之间的整数。有利地，n是2和7之间，优选地3和5之 间的整数，有利地，n表示整数3或5。

-Y如以上定义。

根据优选的实施方案，Y是亲电中心型的基团或亲核中心型的基团， 优选地亲电中心型的基团，适合于允许在Y和由所述单独分子携带的官能 团之间形成酰胺、酯或硫酯键，优选地酰胺或酯，有利地酰胺。

根据优选的实施方案，Y是亲电中心型的基团，对应于以下通式(II)：

其中，Gp是离去基团，任选地由L臂键合至羰基官能团，Gp适合于在与 由所述单独分子M携带的亲核基团诸如伯胺的反应中从亲电中心型的基 团分离。

因此，L臂的存在是通式(II)的化合物中任选的，为该原因，该L臂在 所述式中的括号之间示出。因此，为了本申请的目的，因此，式(L)-Gp的 基团可指定式L-Gp的基团(L臂的存在)或离去基团Gp(所述L臂的不存 在)。

优选地，通式(II)的亲电中心型的基团与由所述分子M携带的所述亲 核基团诸如伯胺的所述反应是亲核取代反应。

仍在该优选实施方案中，根据该优选实施方案，Y是亲电中心型的基 团，(L)-Gp基团选自适合于允许在亲电中心型的所述基团与由所述单独分 子M携带的官能团之间形成以下的基团：酰胺、酯、或硫酯键，优选地酰 胺或酯，有利地酰胺。优选地，后者是亲核基团诸如伯胺。

有利地，(L)-Gp基团选自：-OH、-NH-(CH₂)_m-COOH、-N₃、

m是1和10之间的整数。

在以上提及的(L)-Gp基团之间，本领域技术人员将能够没有过多困难 地区分Gp离去基团(诸如基团-OH、-N₃和-N-氧-琥珀酰亚胺)与L-Gp基团， 即特别是：

-NH-(CH₂)_m-COOH、

其中L臂由-NH-(CH₂)_m-CO(或-NH-(CH₂)_m-OC)部分形成。

为清楚起见，应指出，所述以上“-N-氧-琥珀酰亚胺”的基团是以下式 的基团：

此类(L)-Gp基团的使用有利于在亲电中心型的基团Y与由所述单独分 子M携带的官能团之间形成酰胺、酯、或硫酯键，优选地酰胺或酯，有利 地酰胺。这些(L)-Gp基团特别适合于允许在亲电中心型的所述基团与由分 子M携带的胺官能团诸如伯胺之间形成酰胺键。

优选地，m在1和5之间，有利地在1和3之间。

有利地，Y是通式(II)的亲电中心型的基团，且(L)-Gp基团选自：

-OH和-NH-(CH₂)_m-COOH以及

m在1和10之间，且优选地m等于1。

根据特别优选的实施方案，Y是通式(II)的亲电中心型的基团，且 (L)-Gp是以下式的L-Gp基团：

换言之，因此，本发明的叶酸衍生物表征为诸如以上提供的通式(I)， 其中X如以上定义，且Y代表结合基团，所述结合基团被活化或准备待活 化以允许在所述衍生物与由所述单独分子M携带的官能团之间形成酰胺、 酯、或硫酯键，优选地酰胺或酯，有利地酰胺。

根据特别优选的实施方案，Y是结合基团，所述结合基团被活化或准 备待活化以允许与所述分子M的伯胺形成酰胺键。在该实施方案中，可与 本发明的叶酸衍生物键合的分子是天然具有伯胺的所有分子，诸如蛋白， 或已被化学修饰为包含此类伯胺的任何分子，例如具有伯胺的修饰的生物 素。

“活化的或准备待活化的结合基团”，理解为必要时在活化后合适的官 能团，以允许本发明的叶酸衍生物键合至由所述单独分子M携带的官能团 (例如由后者携带的伯胺)。

根据特别优选的实施方案，Y是活化的结合基团，其允许与由分子M 携带的官能团(例如伯胺)直接形成酰胺键，该基团无需预先被修饰。例如， 可列举以下基团：

以及

m是整数，优选地在1和10之间，其构成本发明的一个实施方案。

根据本发明的另外的实施方案，Y是准备待活化的结合基团，即通过 本领域技术人员已知的方法一定被活化的任何基团，以能够形成酰胺、酯 或硫酯键，优选地酰胺或酯，有利地酰胺。

根据特别优选的实施方案，Y是准备待活化以在根据本发明的叶酸衍 生物与所述分子M之间形成酰胺键的结合基团。此类基团具有-OH或 -COOH基团。作为实例，可列举基团-OH和-NH-(CH₂)_m-COOH；m是整 数，优选地在1和10之间，其构成本发明的一个实施方案。

根据本发明一个特定的实施方案，m在1和5之间，或在1和3之间。

根据另一个实施方案，Y选自-OH、-NH-(CH₂)_m-COOH，以及

m在1和10之间，且优选地等于1。

根据另一个特别优选的实施方案，通式(I)的衍生物以与所述分子M的 缀合物的形式来使用，所述缀合物通过以下通式(III)来表示：

其中X和M如以上定义，且其中Y’是在通式(I)的衍生物与所述分子 M键合后官能团Y的衍生物，

所述分子M优选地是标记分子Mm。

通式(III)的该缀合物不同于由权利要求1中式(A)所示的化合物 NSP-TMAE-HD-蝶酸。

优选地，Y’由以下通式(IV)来表示：

或由以下通式(V)来表示：

其中R1是-NH-、-O-、或-S-，优选地-NH-或-O-，有利地-NH-；

Y’优选地由通式(IV)来表示。

当Y’对应于通式(IV)时，根据本发明的缀合物可由以下通式(III’)来表 示：

其中X、R₁和M如以上定义。

根据特别优选的实施方案，R₁是-NH-，且式(III’)如以下：

其中X和M如以上定义。

根据特别优选的实施方案，仍然当Y’是通式(IV)的基团时，X是 -(CH₂)_n-，且根据本发明的缀合物由以下通式(III’)来表示：

其中M和n如以上定义。因此，n是1和10之间的整数。根据优选 的实施方案，n是2和7之间，优选地3和5之间的整数，有利地，n是 整数3或5。

当Y’对应于通式(IV)的基团时，根据本发明的缀合物由通式(III”)来表 示：

其中X、R₁和M如以上定义。

根据优选的实施方案，R₁是-NH-，且然后根据本发明的缀合物对应于 以下式(III”)：

其中X和M如以上定义。

根据特别优选的实施方案，X是-(CH₂)_n-，且根据本发明的缀合物对应 于以下通式(III”)：

其中M和n如以上定义。因此，n是1和10之间的整数。根据优选 的实施方案，n是2和7之间，优选地3和5之间的整数，有利地，n是 整数3或5。

本发明的另一个目的涉及用于在体外测定样品，诸如生物样品中叶酸 的方法，所述测定是非放射性同位素竞争免疫测定法，所述方法包括以下 步骤：

a)在所述生物样品中，使(i)叶酸的至少一个结合配对物，诸如适合于 与叶酸结合的抗体或诸如叶酸受体，与(ii)选自叶酸衍生物的至少一种化合 物，诸如以上定义的及根据本发明的缀合物接触，所述化合物(i)和(ii)中的 至少一种适合于发射信号，

b)任选地留下足够的时间推移以允许竞争反应，

c)测量信号的强度，并通过参考建立测量的信号强度和叶酸浓度之间 的关系的校正曲线从信号的强度推断所述生物样品中存在的叶酸浓度。

该测定方法可实施于临床来源，即取自人或动物患者的生物样品。此 外，该测定方法还发现应用于农业食品来源的样品，诸如意在用于人或动 物摄取的食品或食品补充剂中的叶酸的测定。通常，无论何时给定样品中 需要/必需叶酸测定时，根据本发明的测定方法是可适用的。

无论样品是临床来源或食品来源，叶酸测定需要处理样品的先前步 骤，以使叶酸从这些样品中存在并与叶酸相互作用的其他分子分离。此类 分离技术是本领域技术人员熟知的。例如，我们可列举欧洲专利EP  0382334，其公开了制备血清样品用于测定维生素B12和叶酸的方法。专 利US 4,418,151公开了另外的预处理方法。Abbott Axsym叶酸试剂盒(目录 号B7K460,Abbott Laboratories)的手册描述了用于从全血样品制备溶血物 质以使红细胞中存在的所有叶酸分子对测定可及的方案。

十分熟悉非放射性同位素竞争免疫技术的本领域技术人员将设法实 施步骤b)和c)，而没有过多困难。特别是，他将基于包含已知浓度叶酸的 样品完全能够构建校正曲线，因此建立测量的信号强度与叶酸浓度之间的 关系。

如以上提及，竞争免疫测定(还称为“通过竞争的免疫测定”)是本领域 技术人员广泛已知的测定。它在于测定讨论中的样品中的分析物(这里是 叶酸)，通过在样品的分析物与该分析物的衍生物(根据本发明这里是叶 酸衍生物)之间，关于固定免疫学来源的结合配对物(例如抗体或抗体片段) 或以其他方式(例如叶酸受体)创造竞争。借助示踪物的存在揭示讨论中的 分析物的衍生物的结合与结合配对物的结合。

分析物的衍生物(本情形中是叶酸衍生物)可用于竞争反应，如以上所 示，无需与标记物在前键合或在后键合以形成缀合物或示踪物。

当分析物衍生物(本情形中是叶酸衍生物)未与标记物键合(在此情况 下，它不形成示踪物而是捕获配对物)时，然后使结合配对物加标记以形成 反应的示踪物。当分析物衍生物(本情形中是叶酸衍生物)与标记物(本情形 中是标记物分子Mm)键合以形成缀合物时，然后后者构成示踪物，且然后 结合配对物成为捕获配对物。

然后，测量的由示踪物发射的信号，与待测定的样品中存在的叶酸的 量成反比。

使用能够结合叶酸的任何分子作为叶酸的结合配对物。作为叶酸的结 合配对物的实例，可以是列举的抗体、抗体片段、nanofitin、叶酸受体或 已知以足够的亲和力与叶酸键合以进行根据本发明的非放射性同位素竞 争免疫测定的任何其他的蛋白。

当抗体用作结合配对物时，它们可以是，例如，多克隆抗体或单克隆 抗体。

多克隆抗体可通过以下来获得：通过用靶叶酸作为免疫原免疫接种动 物，随后以纯化的形式回收需要的抗体，随后从所述动物采取血清并从血 清的其他成分分离所述抗体，特别是，随后在其上固定了由抗体特异识别 的抗原，特别是免疫原的柱上的亲和色谱法。

单克隆抗体可通过本领域技术人员广泛已知的杂交瘤技术获得。单克 隆抗体还可以是通过遗传工程，通过本领域技术人员熟知的技术获得的重 组抗体。

作为抗体片段的实例可以列举的是Fab、Fab’、F(ab’)₂片段以及scFv(单 链可变区片段)、dsFv(双链可变区片段)链。这些功能性片段可特别是通过 遗传工程而获得。

Nanofitins(商品名)是如同抗体的小分子蛋白，能够与生物学靶点结合 从而允许其在生物体中检测、其捕获或其相当仅仅是靶向。

所用的结合配对物对叶酸可以是特异性或非特异性的。当它们能够专 有地或几乎专有地与叶酸结合时，它们被称为特异性的。当与叶酸的结合 选择性是低的，且它们能够与其他配体诸如蛋白或抗体结合时，它们被称 为非特异性的。根据优选的实施方案，至少一种特异性结合配对物用在根 据本发明的非放射性同位素竞争免疫测定方法的上下文中。

当它们用于捕获时，根据本发明的结合配对物或叶酸衍生物可通过本 领域技术人员已知的任何技术键合或不键合于支持体。

本发明的方法的第二步骤b)是竞争免疫测定方法的常规步骤。

根据本发明的方法的最后步骤c)在于确定叶酸浓度。测量的信号与样 品中叶酸的量成反比。为确定叶酸浓度，测量信号的强度并将该强度绘制 在通过本领域技术人员广泛已知的技术预先获得的校正曲线上。因此，例 如，通过使用相同的结合配对物以及递增的叶酸的量进行竞争免疫测定获 得校正曲线。这样获得曲线，例如，通过将叶酸浓度放置在横坐标且将在 免疫测定后获得的相应信号放置在纵坐标上。

当化合物(ii)是根据本发明的缀合物时，如以上所述，其构成本发明的 一个实施方案，信号通过给标记分子Mm标记标签产生，如以上所述。

当化合物(ii)是本发明的叶酸衍生物时，如以上所述，即它未与标记物 分子Mm结合，信号存在于结合配对物/叶酸衍生物结合的直接读数中，其 可特别是通过等离子体表面共振或通过循环伏安法进行。

优选地，化合物(ii)是根据本发明的缀合物。

如上所示，根据本发明的叶酸衍生物和缀合物可用于测定样品中的叶 酸。优选地，这些衍生物和缀合物用于测定所述样品中的多种(至少两种) 的叶酸，即多种叶酸形式(特别是还原形式)。

根据本发明特定的实施方案，以上提及的叶酸衍生物和缀合物用于测 定样品中的总叶酸。

本发明还涉及意在确定人或动物患者，优选地人，是否具有叶酸缺乏 的体外诊断方法，所述方法包括以下步骤：

a)在取自所述患者的生物样品，优选地全血、血浆或血清中，通过实 施根据本发明的体外测定方法测定叶酸，以从叶酸推断生物样品中的叶酸 浓度，

b)将所述浓度与对应于预定的叶酸浓度的阈值比较，低于所述阈值， 患者被认为是叶酸缺乏，以及

c)如果测定的浓度低于所述阈值，从这个推断，患者具有叶酸缺乏。

本发明的另一目的涉及通式(I)的叶酸衍生物

其中：

-X如以上定义；

-Y是亲电中心型或亲核中心型的基团，优选地亲电中心型的基团，适 合于允许在Y和由单独分子M携带的官能团之间形成酰胺、酯或硫酯键， 优选地酰胺或酯，有利地酰胺；以及其中：

-当X是包含等于2的碳原子数目的线性且饱和的烃链时，Y不是 -(O-CH₂-CH₂)₂-NH₂基团；

-当Y是存在于伯胺的亲核中心型的基团时，X包含不同于6的碳原 子数目，

-当Y是亲电中心型的基团时，后者对应于以下通式(II)：

其中，Gp是离去基团，任选地由L臂连接至羰基官能团，Gp适合于 在与由所述单独分子M携带的亲核基团诸如伯胺的反应中从亲电中心型 的基团分离，且其中，当L不存在且Gp是-OH时，X包含大于4的碳原 子数目。

根据特别的实施方案，官能团Y不包含-(O-CH₂-CH₂)-结构。

通式(I)的该叶酸衍生物适合于实施样品中叶酸的非放射性同位素竞 争免疫测定。因此它不包含放射性同位素/放射性元素。

通式(I)的所述叶酸衍生物本身没有被标记。在必要时，所述叶酸衍生 物将在与标记物分子Mm键合后被标记，所述键合包括在所述叶酸衍生物 的官能团Y与由所述标记物分子Mm携带的官能团之间形成共价键。

通式(I)的叶酸衍生物不同于由权利要求1中式(A)所示的 NSP-DMAE-HD-蝶酸化合物。

根据特定的实施方案，Y不同于基团(C)：

根据另一个特别的实施方案，当X是包含等于2的碳原子数目的线性 且饱和的烃链时，Y不同于以下基团(D)和(E)：

根据该“其他特别的实施方案”的修改形式，Y不同于以上提及的基团 (D)和(E)，且这无论X的定义。

优选地，通式(II)的亲电中心型的基团与由所述分子M携带的所述亲 核基团诸如伯胺的所述反应是亲核取代反应。

根据特别的实施方案，当Y是亲核中心型的基团时，后者存在于与伯 胺不同的官能团中。

根据优选的实施方案，当Y是对应于通式(II)的亲电中心型的基团时， (L)-Gp是选自以下的基团：-OH、-NH-(CH₂)_m-COOH、-N₃、

m是1和10之间，优选地1和5之间，有利地1和3之间的整数， 其中当L不存在且Gp是-OH时，X包含大于4的碳原子数目。

优选地，当Y是式(II)的亲电中心型的基团时，(L)-Gp选自：

-OH和-NH-(CH₂)_m-COOH以及

m在1和10之间，且优选地m等于1，

其中当L不存在且Gp是-OH时，X包含大于4的碳原子数目。

根据特别有利的实施方案，当Y是式(II)的亲电中心型的基团时， (L)-Gp是：

根据特别的实施方案，且仍然当Y是通式(II)的亲电中心型的基团时， Gp是不同于-OH(羟基基团)基团的基团。

本发明还涉及包含根据本发明的叶酸衍生物和单独分子M的缀合物， 所述衍生物与所述分子M在Y和由所述分子M携带的官能团之间，由至 少一个酰胺、酯或硫酯键，优选地酰胺或酯键，有利地酰胺键连接。

根据特别优选的实施方案，所述分子M选自化学臂或“连接物”或标记 物分子Mm，所述分子M优选地是标记物分子M_m，其允许直接或间接标 记所述叶酸衍生物(然后后者称为“加标签的缀合物”)。

本发明的另一个目的涉及允许实施根据本发明的方法的试剂盒，所述 试剂盒包含：

-(i)所述叶酸的至少一种结合配对物，诸如适合于与叶酸结合的抗体或 诸如叶酸受体，

-(ii)至少一种化合物，所述至少一种化合物选自叶酸衍生物诸如以上 定义的和根据本发明的缀合物，

所述化合物(i)和(ii)中的至少一种适合于发射信号，以及

-至少一种校正工具。

当然，该试剂盒(还称为“检测试剂盒”)可包含允许或有利于实施根据 本发明的免疫测定的其他成分，诸如，例如，洗涤缓冲液和允许标记被可 视化，或发射可检测信号的一种或更多种其他试剂。

本发明的叶酸衍生物可以以两种不同的方式通过竞争免疫测定，诸如 诊断测试用于测定叶酸的方法。事实上，它们原样使用，或它们键合另一 个分子以形成缀合物地使用。

所述“其他分子”是直接或间接的标记物，或化学臂或“连接物”，或与 叶酸衍生物的键合具有优势，特别是用于通过竞争免疫测定(优选地非放射 性同位素竞争免疫测定)实施叶酸测定的化学化合物。

因此，本发明还具有缀合物作为其目的，其包含叶酸衍生物诸如以上 所述和另一个分子，特别是标记物或化学臂，或由叶酸衍生物诸如以上所 述和另一个分子，特别是标记物或化学臂形成。

标记物理解为能够直接或间接产生可检测信号的任何分子。这些直接 检测标记物的非限制性列表存在于：

-产生可检测信号的酶例如，通过比色法、荧光、发光，像辣根过氧化 物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，

-发色团诸如荧光、发光、着色剂化合物，

-荧光分子诸如Alexa或藻蓝蛋白，

-电化学发光盐诸如基于吖啶所有钌的有机金属衍生物。

还可使用间接检测系统，像例如能够与抗配体反应的配体。然后配体 对应于标记物分子Mm以与以上提及的叶酸衍生物构成本发明的缀合物。

配体/抗配体对是本领域技术人员熟知的。例如，可特别列举以下对： 生物素/链霉亲和素、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体、糖/凝集素、多核 苷酸/互补的多核苷酸。

然后抗配体可通过以上描述的直接检测标记物直接可检测，或其本身 通过另一个配体/抗配体对可被检测，等。

这些间接检测系统在一定条件下可导致放大信号。放大信号的该技术 是本领域技术人员熟知的，且可特别是对本申请人的在先专利申请 FR98/10084和WO-A-95/08000进行参考。

取决于使用的标记类型，本领域技术人员将添加试剂，所述试剂允许 标记被可视化或发射通过任何适当类型的测量仪器，像例如分光光度计、 荧光光度计或照相机(例如高清照相机)可检测的信号。

化学臂或“连接物”理解为能够与根据本发明的衍生物键合的任何分 子，此外所述分子能够以选择性或非选择性方式共价或非共价固定至固相 上。

如以上所示，根据本发明的叶酸衍生物和相应的缀合物对于体外确定 临床来源的样品(例如取自人或动物患者的生物样品)，或农业食品来源(取 自食品或食品补充剂)的样品中的叶酸浓度是特别有用的。

使用根据本发明的衍生物或缀合物确定叶酸浓度，可在培养物上清液 或细胞的溶解产物中进行。

本发明的另一个目的涉及用于获得根据本发明的衍生物的方法，所述 方法包括以下步骤：

a)由蝶酸合成通式(VI)的化合物：

其中，W代表增加所述化合物在有机溶剂中的溶解度的基团，诸如三 氟乙酰基基团(COCF3)，

b)在允许通过键合获得以下通式(VIII)的化合物的条件下，将步骤a) 中获得的式(VI)的所述化合物与以下通式(VII)的化合物反应：

NH₂-X-Y″-Z

        (VII)

X如以上定义；

Z是惰性基团，优选地烷基或芳基，以及

Y”是在与所述Z基团键合后，Y基团的衍生物(诸如以上定义)。

c)在允许解除保护的条件下，对式(VIII)的化合物解除保护，以获得根 据本发明的式(I)的叶酸衍生物。

根据优选的实施方案，在步骤b)中，将步骤a)中获得的式(VI)的所述 化合物与以下通式(VII)的化合物反应：

NH₂-X-Y″-Z

        (VII)

其中Y”是-C(O)O-，

以制备式(I)的叶酸衍生物，其中Y是-COOH。

在该优选的实施方案中，如果Z是甲基或乙基基团，Y-Z分别是式(VII) 和(VIII)的化合物中的-C(O)O-CH3或-C(O)O-CH3。如果Z是芳基基团，则 Y-Z是所述化合物中的-C(O)O-Ar(Ar代表该芳基基团)。

在解除保护步骤c)结束，且仍在该优选的实施方案中时，以上提及的 基团-C(O)O-结果是-COOH基团。因此获得的根据本发明的通式(I)的叶酸 衍生物称为“酸性”叶酸衍生物。根据该实施方案的一个优选方面，然后该 方法在步骤c)后包括以下另外的步骤：

d)从所述酸性叶酸衍生物(其中Y＝-COOH)获得NHS-叶酸衍生物酯， 即，对应于以下通式(IX)的化合物：

其中X如以上定义。

通式(IX)的该化合物代表了优选的叶酸衍生物之一或在本发明的含义 内的优选的叶酸衍生物。有利地，X是饱和的线性脂肪烃链，其包含在1 到10之间，优选地在2和7之间，有利地在3和5之间的碳原子数目。

用于获得NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯的方法是本领域技术人员熟知 的。获得根据本发明的式(IX)的叶酸衍生物的实例提供如下(参见以下实施 例3和4)作为说明性和非限制性的实例。

蝶酸是商购可得的化合物。不幸地，这种化合物被证明在有机溶剂中 具有低溶解度。因此，它在步骤a)中被转化为通式(VI)的化合物，以促进 本发明方法的继续。优选地，式(VI)的该化合物是N-三氟乙酰基蝶酸(W＝ -COCF3)。在这种情况下，蝶酸，优选地有利地由氮气保护地与三氟乙酸 酐进行反应。

如以上所示，步骤b)在允许获得需要的反应的反应条件下进行。这些 反应条件，优选地，包括使用粘合剂。

如以上所示，惰性基团Z包括，例如，甲基或乙基基团(特别是当Y” 是-C(O)O-时，以生成-C(O)O-Mp或-C(O)O-Et)或Fmoc基团(特别是当Y” 是-NH-时，以产生-NH-Fmoc)。

根据特别的实施方案，步骤b)包括以下两个子步骤：

b.1)由在步骤a)中获得的式(VI)的化合物形成活性中间体诸如，以下通 式(VI’)的甲酸异丁酯N-三氟乙酰基蝶酸：

b.2)在允许通过键合获得以下通式(VIII)的化合物的条件下，将在步骤 b.1)中获得的所述活性中间体与以下通式(VII)的化合物反应：

NH₂-X-Y″-Z

          (VII)

其中W、X、Y”和Z如以上定义。

根据优选的实施方案，在以上提及的步骤b)和/或b.2)中，键合通过转 酰胺化(transamidification)来获得。

解除保护步骤c)有利地在氮气的保护下，导致消除W基团，且同时或 随后消除Z基团。

该解除保护步骤c)，优选地，在碱性介质，例如NaOH的溶液中进行。 该碱性溶液允许通过皂化反应消除W基团，且同时消除Z基团(包括例如 甲基或乙基基团)。

详述

本发明将通过以说明性和非限制性的方式给出的以下实施例，参考图 1和2更好地被理解，其中

-图1示出了叶酸-C4-酸(4-(4-((2-氨基-4-氧代-3,4-二氢蝶啶-6-基)甲氨 基)苯甲酰氨基)丁酸)和NHS-C4-叶酸的合成步骤，以及

-图2示出了叶酸-C6-酸(6-(4-((2-氨基-4-氧代-3,4-二氢蝶啶-6-基)甲氨 基)苯甲酰氨基)己酸)和NHS-C6-叶酸的合成步骤。

实施例1：4-(4-((2-氨基-4-氧代-3,4-二氢蝶啶-6-基)甲氨基)苯甲酰氨基)丁酸(叶酸-C4-酸)的制备

为清楚起见，称为“叶酸-C4-酸”的化合物是根据本发明的衍生物，对 应于以下通式(I)：

其中，X是包含3个碳原子的线性且饱和的脂肪烃链，且Y是对应于 通式(II)的亲电中心型的基团：

其中，L不存在且Gp是-OH。

1.1.引言

试剂蝶酸(目录号119-24-4)、三氟乙酸酐(目录号407-25-0)、4-氨基丁 酸甲酯(目录号3251-07-8)、氯甲酸异丁酯(isobutyl chloroformiate)(目录号 543-27-1)、氨基-6-己酸(目录号60-32-2，还称为6-氨基己酸)和无水二氯甲 烷(目录号75-09-2)购自Sigma-Aldrich。

在每个合成步骤中，高压液相色谱(HPLC)用于监测反应进展，并用于 分析产物。所用的柱是Vydac 218TP54，C18，250x4.6mm，5μm，且洗脱 液是梯度乙腈、水(0.1％三氟乙酸)混合物。

1.2.步骤1：获得N-三氟乙酰基蝶酸

将500mg(1.60毫摩尔)蝶酸引入进50mL装备有磁力搅拌器的烧瓶 中，所述烧瓶具有入口和出口用于氮气保护。10mL三氟乙酸酐在氮气保 护下经30分钟逐滴加入。将反应混合物在黑暗中在环境温度下搅拌24小 时。将反应介质在减压下在环境温度下蒸发，且将残余物在真空下干燥1 小时。获得的产物用5mL乙醚洗涤，且然后在真空下干燥。将产物通过 HPLC分析，并直接用于合成的继续。

1.3.步骤2：获得N-三氟乙酰基-叶酸-C4-Me

准备171mg(0.42毫摩尔)N-三氟乙酰基蝶酸、0.111mL三乙胺(目录 号121-44-8)和2mL干燥的二甲基甲酰胺(DMF，目录号68-12-2)的混合物 并在环境温度在氮气下搅拌45分钟以生成介质1号。在另一个10mL烧 瓶中，将150mg(0.98毫摩尔)4-氨基丁酸甲酯盐酸盐与2mL干燥的DMF 混合，并然后加入0.111mL三乙胺。搅拌30秒后，将获得的混合物在氮 气保护下加入至制备的介质1号中。搅拌在环境温度下保持3小时，且反 应通过HPLC监测。将反应介质在真空下不加热地干燥。残余物通过硅胶 60色谱法(0.040-0.063mm，Merck目录号109385)用二氯甲烷/甲醇洗脱液 5/1，v/v来纯化。获得85mg产物，其对应于40％产率。纯度为96％，通 过HPLC确定。

1.4.步骤3：获得叶酸-C4-酸

将85mg(0.168毫摩尔)制备的N-三氟乙酰基叶酸-C4-Me酸与6mL 甲醇混合。加入2mL的1N NaOH混合物。混合物在环境温度下并在黑暗 中搅拌16小时。反应介质在pH 2下用50％三氟乙酸中和，并然后在减压 下在环境温度下干燥。残余物用10mL去离子水洗涤，且在真空下干燥。 获得66mg叶酸-C4-酸，其对应于98％产率。纯度为97.2％，通过HPLC 确定。

叶酸-C4-酸的合成概述于图1中。

实施例2：6-(4-((2-氨基-4-氧代-3,4-二氢蝶啶-6-基)甲氨基)苯甲酰氨基)己酸(叶酸-C6-酸)的制备

称为“叶酸-C6-酸”的叶酸衍生物是根据本发明的衍生物，对应于以下 通式(I)：

其中，X是包含5个碳原子的线性且饱和的脂肪烃链，且其中Y是对 应于以下通式(II)的亲电中心型的基团：

其中，L不存在且Gp是-OH。

叶酸-C6-酸(6-(4-((2-氨基-4-氧代-3,4-二氢蝶啶-6-基)甲基-氨基)苯甲酰 氨基)己酸)以与叶酸-C4-酸相似的方式来合成。在以上提及的步骤2中， 4-氨基丁酸甲酯(NH2-C4-Me)臂被替换为6-氨基己酸乙酯臂(NH₂-C6-Et， 氨基-6-己酸的乙基酯)。该化合物从氨基-6-己酸在乙醇和乙酰氯的存在下 制备。

60mg叶酸-C6-酸获自171mg N-三氟乙酰基蝶酸，其对应于34％的总 产率。纯度为96％，通过HPLC确定。

叶酸-C6-酸的合成概述于图2中。

通常，通式(I)的衍生物中的烃链X的长度可通过在步骤2中使用烷基 氨基链烷酸酯试剂来改变，其中链烷酸酯的烃部分的长度变化(4个碳原子 以获得称为“叶酸-C4-酸”的化合物；6个碳原子以获得称为“叶酸-C6-酸”的 化合物)。

实施例3：叶酸-C4-NHS的酯的制备

试剂，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，目录号6066-82-6)、1,3-二环己基碳 二亚胺(DCC，目录号538-75-0)、二甲基亚砜(DMSO，目录号67-68-5)和 四氢呋喃(目录号109-99-9)获自Sigma-Aldrich。

将实施例1中获得的66mg(0.166毫摩尔)叶酸-C4-酸、28.8mg(或1.5 x 0.166毫摩尔)NHS和4mL干燥的DMSO引入进烧瓶中。搅拌2分钟后， 将41.1mg(或1.2x0.166毫摩尔)DCC引入。搅拌在环境温度下在黑暗中保 持48小时。使用HPLC监测活化的进度。加入7mg NHS和/或4mg DCC， 且搅拌保持另外的72小时。

将反应混合物过滤，并将获得的溶液与5ml干燥的四氢呋喃混合，然 后加入170mL干燥的二氯甲烷。15分钟后，将混合物离心不搅拌以回收 沉淀物，然后将沉淀物在减压下无加热且在黑暗中干燥。获得42mg叶酸 -C4-NHS，其对应于51％产率。纯度为69％，通过HPLC确定。

叶酸-C4-NHS酯的获得示于图1中(参考最后的反应步骤)。

实施例4：叶酸-C6-NHS的酯的制备

关于叶酸的-C4-NHS酯，使用的试剂如下：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS， 目录号6066-82-6)、1,3-二环己基碳二亚胺(DCC，目录号538-75-0)、二甲 基亚砜(DMSO，目录号67-68-5)和四氢呋喃(目录号109-99-9)，以及获自 Sigma-Aldrich。

将实施例2中获得的60mg(0.14毫摩尔)叶酸-C6酸、DMF(2.5mL) 和DMSO(3mL)干燥溶剂和17.7mg(1.1x 0.14毫摩尔)NHS的混合物引入 进烧瓶。搅拌2分钟后，将32mg(1.1x 0.14DCC引入。搅拌在环境温度 下在黑暗中保持24小时。使用HPLC监测活化的进度。加入30mg NHS 和30mg DCC，且搅拌保持另外的96小时。

将反应介质以3000rpm离心3分钟，并将回收的液体与30mL溶剂 二氯甲烷/石油醚(1/1)的混合物混合，并然后再次离心以获得黄色沉淀物。 将产物在减压下无加热且在黑暗中干燥。获得21mg(29％产率)叶酸 -C6-NHS，HPLC纯度为83.1％。

叶酸-C6-NHS酯的合成概述于图2中(参考最后的反应步骤)。

实施例5：叶酸-C4-NHS-碱性磷酸酶和叶酸-C6-NHS-碱性磷酸酶缀合物的制备

将0.5mL的20mg/mL重组碱性磷酸酶(ALP)(Roche，参考03-535-452) 溶液在Spectra/管中针对500mL的100mM pH 8.3碳酸盐缓冲液透析 (临界水平6000-8000Da，Spectrum Laboratories，USA)，在+2/8℃下在磁 力搅拌下持续一晚。在透析出口处，蛋白的浓度通过读取280nm处的光 密度来确定，且将该浓度调整至4mg/mL。

考虑到纯度，将实施例2中获得的活化的叶酸-C4-NHS酯和叶酸 -C6-NHS酯再次分别以0.39mg/mL和0.5mg/mL的浓度用于DMSO中。

对于键合类型(1-5)(一摩尔碱性磷酸酶-5摩尔叶酸酯)，将1.125mL  ALP溶液一方面与256μL叶酸-C4-NHS酯溶液混合，且另一方面与255μL 叶酸-C6-NHS酯溶液混合。DMSO在反应介质中的百分比是18.5％。将混 合物在棕色瓶中在+2/8℃，在转子上搅拌温育一晚。

然后，反应通过加入10mM以水稀释的赖氨酸来停止。加入的赖氨酸 的量与用于键合的酯的量是等摩尔的。因此，对于每个键合，加入20.5μL 的赖氨酸溶液。将混合物在+18/25℃在转子上温育20分钟。

终止反应后，将1mL各缀合物在Spectra/管(临界水平约7000Da) 中在+18/25℃在磁力搅拌下，针对500mL的50mM Tris pH 7.4、9g/L  NaCl、0.9g/L叠氮化物缓冲液透析3h。3小时后，将管再次转移进包含 500mL相同缓冲液的新浴(bath)中。透析在+2/8℃在磁力搅拌下持续过夜。

在透析出口处，将10x保护缓冲液(500mM Tris pH 7.4、90g/L NaCl、 50mM MgCl₂、1mM ZnCl₂、0.01％SDS、9g/L叠氮化物)加入至从管中回 收的体积。获得的体积大约是1mL/缀合物。透析后，仅半纯化缀合物： 透析允许消除游离、未反应叶酸，而不是游离的碱性磷酸酶。缀合物在此 阶段可用于免疫测定中，且这是在以下实施例6中进行的。

为消除游离的ALP，并因此获得具有改进的纯度的缀合物，使用安装 在色谱系统的RESOURCE苯基柱(目录号17-1186-01，GE Healthcare  Lifesciences)进行疏水性相互作用色谱法。泵的流速设定为2mL/min。TA 缓冲液是50mM Tris pH 7.4、9g/L NaCl、5mM MgCl₂、0.1mM ZnCl₂、 0.9g/L叠氮化物、1.6M(NH₄)₂SO₄。TB缓冲液是50mM Tris pH 7.4、9g/L  NaCl、5mM MgCl₂、0.1mM ZnCl₂、0.9g/L叠氮化物。RESOURCE苯基 柱用TA溶液来平衡。待纯化的缀合物是用于具有TB缓冲液的体积的混 合体积。然后，加入2体积的50mM Tris pH 7.4、9g/L NaCl、5mM MgCl₂、 0.1mM ZnCl₂、0.9g/L叠氮化物、3.2M(NH₄)₂SO₄缓冲液。这个步骤允许 缀合物存在TA缓冲液中。注射缀合物(对于叶酸-C4-NHS-ALP是628μL 和对于叶酸-C6-NHS-ALP是560μL，在5mL环中)，随后是在20mL TA 缓冲液中洗涤。然后施加0至57％梯度TB 30mL，然后在20mL的57％ 的TB缓冲液中洗涤。该步骤随后是施加第二梯度57％至100％的TB 30 mL，然后在20mL TB缓冲液中洗涤。最后的步骤存在于20mL 0至100％ 梯度的水中，并然后在20mL水中洗涤。色谱的进展通过在280nm处测 量光密度来监测。将来自74mL洗脱液的多达104mL的级分(或总计30mL) 回收、合并，并然后通过使用Amicon小室(Amicon stirred cells,Millipore)、 具有10 000Da的临界水平的Amicon PM膜和TB缓冲液的渗滤来浓缩。 在该步骤中，该缀合物溶液的体积减少到约0.5mL。将缀合物储存在+2/8 ℃，直到它们在免疫测定中使用。

实施例6：使用缀合物叶酸-C4-NHS-碱性磷酸酶和叶酸-C6-NHS-碱性磷酸酶的维生素B9测定及与AXSYM测定缀合物(AbbottLaboratories)比较

免疫学测定使用自动免疫测定分析系统(bioMérieux)来进行。 单次使用的锥体既用作用于反应的固相，又作为移液系统。盒包括覆盖了 铝密封和标签片的10个孔。第一孔包括先前切出的部分，以促进引入样 品。最后一孔是在其中测量底物荧光的光学杯。分析所需的不同试剂包含 在中间孔中。

a)锥体的致敏和钝化

锥体用300μl在0.2M tris，pH 6.2缓冲液中稀释至5μg/mL的“抗叶 酸结合蛋白”单克隆小鼠抗体(克隆P8C5E4,)致敏。在+18/25℃温育6小时 后，用1M NaCl溶液进行洗涤。然后，将300μL“叶酸结合蛋白”(FBP， 目录号F0524,Scripps Laboratories)溶液以包含人白蛋白的100mM、pH 7.4 NaCl 0.15M磷酸盐缓冲液稀释至6ng/mL，并加入糖。致敏/钝化在+18/25 ℃持续过夜。将锥体清空、干燥并然后储存在+4℃下直到使用。

b)来自生物样品的范围的制备

从Biomnis laboratory(Lyon,France)获得包含不同叶酸浓度的人血清样 品。将具有相同的浓度的样品混合，以增加每范围点的可用体积。然后将 混合物以120μL等分，并冷冻在-20℃直到使用。各点的标称浓度是：1.3 ng/mL-4.4ng/mL-10ng/mL-20ng/mL。通过将10％人血清白蛋白溶解在 10mM pH 8.5,0.15M NaCl磷酸盐硼酸缓冲液中制备范围点0ng/mL。

c)样品的提取

提取步骤的目的是从它的结合配对物分离血清叶酸并使其对于测定 可及。向250μL样品加入50μL的62.5mg/mL TCEP(tris2-羧乙基)膦)溶 液和215μL的0.8N NaOH+0.005％KCN溶液。将混合物在黑暗中在+18/25 ℃下温育15分钟。该阶段后，加入1mL的1M pH4甘氨酸缓冲液。

d)免疫测定反应的运作方法

将根据c)中描述的方案提取的待测定的样品(200μL)引入进盒的第一 孔。然后所有的测定反应步骤由自动进行。根据a)中描述的方案 制备的锥体由1M pH 10，0.1M NaCl甘氨酸和2％蔗糖缓冲液润湿。将待 测定样品与200μL的缀合物的稀释液混合，所述缀合物是用碱性磷酸酶标 记的叶酸衍生物。样品/缀合物混合物在锥体中温育约20分钟，期间，在 样品中存在的叶酸和锥体上存在的FBP蛋白位点的缀合物的叶酸衍生物 之间发生竞争。然后，用100mM Tris pH7.4，0.15M NaCl，0.1％20 缓冲液进行连续3次洗涤，以消除未固定的化合物。在最后的揭露步骤中， 抽吸4-甲基伞形酮磷酸盐(4-methylombelliferyl phosphate)底物，并然后排 进锥体中；缀合物的酶催化该底物为4-甲基伞形酮(4-methylombelliferone) 的水解反应，在450nm处测量其发射的荧光。荧光信号的值与样品中存 在的叶酸浓度成反比。

在表1中呈现的实验中，已比较了三种缀合物。这些是实施例3中获 得的两种缀合物，且，Abbot Axsym叶酸试剂盒(目录号B7K460，Abbot  Laboratories)中使用的缀合物作为参考。

(i)将叶酸-C4-ALP和叶酸-C6-ALP缀合物以缀合物稀释缓冲液稀释至 0.50ng/mL-0.75ng/mL之间的浓度，所述缀合物稀释缓冲液包含100mM 的Tris pH 8.5、0.15M NaCl、20mg/L的小鼠IgG、稳定剂、防腐剂和其 他添加剂。

(ii)叶酸Axsym试剂盒的缀合物是蝶酸(叶酸类似物)和碱性磷酸酶的 缀合物。在中使用之前，将该缀合物用缀合物稀释缓冲液稀释至 1/80。

b)中制备的范围点用各测定格式来测量。以下表1概括了用RFV(＝相 对荧光值)信号获得的结果和B/B0％比率。B/B0％比率是对测试的范围点获 得的信号，除以对叶酸的范围点0ng/mL获得的信号，乘以100。

表1

以本发明的叶酸-C4-ALP和叶酸-C6-ALP缀合物，在1.3ng/mL叶酸 下观察到信号减少87％，而以参考缀合物，信号减少几乎不开始。

因此，使用叶酸-C4-ALP和叶酸-C6-ALP缀合物的测定比使用参考缀 合物的测定更为灵敏，并允许更好地检测和定量小于4.4ng/mL，和甚至小 于1.3ng/mL的浓度。

应该注意，关于根据本发明的叶酸衍生物和缀合物，特别是响应以上 提及的通式(I)、(I’)、(III)、(III’)、(III”)、(VI)、(VI’)、(VIII)和(IX)的那些， 尽管这些的蝶呤部分以其酮的形式概略地示出，本发明非常明显地覆盖能 够在所述蝶呤部分被获得的所述叶酸衍生物和缀合物的互变异构形式的 全部-和每一个，且特别是2-氨基-4-羟基-甲基蝶啶形式。

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