高效快速测定复杂组分中B族维生素含量的色谱分析方法

摘要

本发明公开了一种高效快速测定复杂组分中B族维生素含量的色谱分析方法，包括以下步骤：试液的配制；对照品溶液的制备；样品溶液的制备；液相色谱条件。本发明通过对色谱条件的优化，运用普通高效液相色谱仪就能快速而准确的同时分析多种B族维生素，包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺的含量，本发明不仅缩短了分析时间，同时也减少了溶剂用量降低了分析成本。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效快速测定复杂组分中B族维生素含量的色谱分析方法，特别一种运用高效液相色谱法（HPLC）高效快速测定复杂组分中维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺的方法。具体通过对色谱条件的巧妙选择优化，实现对复杂组分样品中维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺的分离和含量的准确测定。

背景技术

B族维生素也叫乙族维生素，也叫维他命B、维生素B族或维生素B复合群，主要包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酸、泛酸、叶酸等。B族维生素是维持人体正常机能与代谢活动不可或缺的水溶性维生素，它们推动体内代谢，把糖、脂肪、蛋白质等转化成热量。如果缺少维生素B，则细胞功能马上降低，引起代谢障碍，这时人体会出现怠滞和食欲不振。B族维生素广泛存在于米糠、麸皮、酵母、动物的肝脏、粗粮蔬菜等食物中，但由于食用方法不对，几乎摄取不到。而人体却无法自行制造合成维生素B，所以必须额外补充。

目前B族维生素的测定方法已有微生物分析法和高效液相色谱法，微生物法测定结果不太准确，且费时费力，操作复杂，对人员技术要求高；而目前的高效液相色谱法一般存在峰型不好，主峰难以分开，分离度达不到要求等情况，且分析时间过长。为了解决这一难题，本发明通过对色谱条件的优化，运用普通高效液相色谱仪就能快速而准确的同时分析多种B族维生素，包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺的含量。而且本发明不仅缩短了分析时间，同时也减少了溶剂用量降低了分析成本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效快速测定复杂组分中B族维生素含量的色谱分析方法，其可以简便、快速、准确的测定B族维生素（包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺含量），缩短分析时间，减少溶剂使用量，降低分析成本。

本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的：一种高效快速测定复杂组分中B族维生素含量的色谱分析方法，其特征在于，所述高效快速测定复杂组分中B族维生素含量的色谱分析方法包括以下步骤：

第一步、试液的配制

萃取溶液：称取无水柠檬酸或一水柠檬酸，加水溶解，再加含2,6-二叔丁基甲酚的二甲基亚砜溶液，混匀；

正己烷磺酸钠溶液：称取正己烷磺酸钠，加水溶解稀释；

第二步、对照品溶液的配制

精密称取对照品维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺至100ml容量瓶中，用萃取溶液溶解，冷却至室温后用萃取溶液稀释至刻度；

第三步、样品溶液的制备

精密称取样品适量，置125ml棕色具塞锥形瓶中，加萃取溶液，超声溶解,必要时置于70℃水浴中振摇；吸取上层液体于一离心管中，高速离心；取上清液经0.45μm滤膜过滤；

第四步、液相色谱条件

色谱柱：C18柱  50×4.6mm，2.7μm

流动相：A：7.2mmol/l正己烷磺酸钠:冰醋酸98.65:1.35；

B：甲醇；

流动相A、B在5min内按特定的梯度程序进行；

流速：1.0ml/min；      

检测波长：280nm；

进样量：3μl；    

柱温：30℃；

通过样品与对照品的保留时间和溶液峰面积关系计算样品中维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺的含量。

优选地，所述高效快速测定复杂组分中B族维生素含量的色谱分析方法通过对照品的保留时间对样品进行定性，外标法计算样品中B族维生素的含量，该计算公式为如下式：

其中，A样：为样品溶液中B族维生素峰面积；C标：为标准工作溶液的浓度，mg/mL；A标：为标准工作溶液中B族维生素峰面积；W样：为样品称重，g。

优选地，所述高效快速测定复杂组分中B族维生素含量的色谱分析方法对照品溶液的配制为：精密称取对照品维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺至100ml容量瓶中，用萃取溶液溶解，冷却至室温后用萃取溶液稀释至刻度。

优选地，所述第三步中的样品为固体样品则需先用研钵及研杵研磨成细粉后使用，若样品为液体样品则直接取用，若样品为胶囊样品则取若干胶囊的内容物，研磨混合均匀后使用。

优选地，所述高效快速测定复杂组分中B族维生素含量的色谱分析方法适用于含维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺的片剂、硬胶囊、粉剂、软胶囊、滴剂、丸剂、软糖及饮料，产品是保健食品、药品、普通食品或预混料。

本发明的积极进步效果在于：本发明以二甲基亚砜溶剂溶解样品，二甲基亚砜是万能溶剂，能使复杂样品中所有B族维生素包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺彻底溶解出来。而且在优化的色谱条件下样品的杂质峰干扰很少，更重要的是本发明采用5cm C18柱代替传统的25cm C18柱，在5min之内按特定的梯度程序很好的完成4种维生素的完全分离，本发明提高检测准确度和检测速度，减少了溶剂用量，且分离度，回收率等良好。本发明提供了一种简便、快捷、准确测定复杂组分中B族维生素包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺含量的液相色谱分析方法。检测产品可以是保健食品、药品、普通食品或预混料，适用范围广，实用性强。

附图说明

图1为现有高效液相色谱法对第一实施例中标准品测定的结果。

图2为现有高效液相色谱法对第一实施例中样品测定的结果。

图3为应用本发明方法对第一实施例中的标准品测定的结果。

图4为应用本发明方法对第一实施例中的样品测定的结果。

图5为应用本发明方法对第二实施例中的标准品测定的结果。

图6为应用本发明方法对第二实施例中的样品测定的结果。

图7为应用本发明方法对第三实施例中的标准品测定的结果。

图8为应用本发明方法对第三实施例中的样品测定的结果。

具体实施方式

 下面通过实施例对发明作进一步详细的说明，分别以常规剂型：片剂、粉剂、软胶囊为例。

第一实施例：

江苏艾兰得营养品有限公司生产的儿童多维营养素片样品中维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺含量的测定。本发明所用试剂及配制：无水柠檬酸或一水柠檬酸：分析纯；2,6-二叔丁基甲酚：分析纯；二甲基亚砜：色谱纯；正己烷磺酸钠：色谱纯；冰醋酸：分析纯；甲醇：色谱纯。第一实施例的具体步骤如下：

第一步：萃取溶液，称取10.0g无水柠檬酸或11.0g一水柠檬酸，加100ml水溶解，再加含0.2% 2,6-二叔丁基甲酚（BHT）的二甲基亚砜（DMSO）溶液至1000ml，混匀。7.2mmol/l正己烷磺酸钠溶液：称取1.3g正己烷磺酸钠，加水溶解并稀释至1000ml。

第二步：对照品溶液的配制，精密称取对照品盐酸硫胺即维生素B1、维生素B2、维生素B6各约10mg，烟酰胺约100mg至100ml容量瓶中，用萃取溶液溶解，必要时可稍微加热，冷却至室温后用萃取溶液稀释至刻度，作为标准工作溶液。

第三步：样品溶液制备，取样品20片，研细，精密称取适量，置125ml棕色具塞锥形瓶中，加25ml萃取溶液，超声约30分钟,必要时置于70℃水浴中振摇约30分钟； 吸取上层液体于一50ml离心管中，高速离心约10分钟； 取上清液经0.45μm滤膜过滤，备用。

第四步：液相色谱条件的具体内容如下：

色谱柱：C18柱  50×4.6mm，2.7μm

流动相：A：7.2mmol/l正己烷磺酸钠:冰醋酸（98.65:1.35）。

B：甲醇的具体信息如表1所示。

             表1 甲醇的具体信息表 

时间（min）流动相A流动相B080%20%1.480%20%2.065%35%3.065%35%3.670%30%

流速：1.0ml/min      检测波长：280nm

进样量：3μl         柱温：30℃。

通过对照品的保留时间对样品进行定性，外标法计算样品中B族维生素的含量，计算公式如下式（1）：

 （1）

   式中 A样：为样品溶液中B族维生素峰面积；C标：为标准工作溶液的浓度，mg/mL；A标：为标准工作溶液中B族维生素峰面积；W样：为样品称重，g。样品检测结果如图1、图2、图3、图4所示：

图1、图2表示原有HPLC方法对实际样品和标准品分别进行测定的结果。其中A为标准品的测定结果，B为实际样品的测定结果。自右向左依次为维生素B1约10.8min、维生素B2约7.3min、维生素B6约5.7min、烟酰胺约4.2min的测定峰。其中维生素B6和烟酰胺的峰没完全分开，峰型也不好，分析时间至少需要15min。

图3、图4表示应用本发明方法对标准品和样品进行测定的结果。其中A为标准品的测定结果，B为实际样品的测定结果。自右向左依次为维生素B1约4.1min、维生素B2约3.5min、维生素B6约1.8min、烟酰胺约1.0min的测定峰。四个主峰峰型很好，分离度也很好，其中杂质峰也很少，而且分析时间只有5min。

第二实施例：

江苏艾兰得营养品有限公司生产的多种维生素矿物质固体饮料样品中维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺含量的测定。具体步骤同第一实施例。样品检测结果如图5、图6所示。

第三实施例：

江苏艾兰得营养品有限公司生产的多种维生素矿物质软胶囊样品中维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺含量的测定。具体步骤同第一实施例。样品检测结果如图7、图8所示。

以上所述的具体实施例，对本发明的解决的技术问题、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。