一株高效抑制镰刀菌和炭疽菌的生防菌Kg2A及其应用

摘要

本发明属于微生物农药领域，具体涉及一株生防菌Kg2A及其在防治胡椒枯萎病和炭疽病的应用。该生防菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Kg2A，保藏编号为CGMCC No.10918。本发明还公开了上述菌株的分子生物学特性和生理生化特性、培养方法，并验证了其具有抑制胡椒枯萎病病原菌镰刀菌和炭疽病原炭疽菌的活性。

说明书

技术领域

本发明属于微生物农药领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌Kg2A及其在防治胡椒枯萎病和炭疽病的应用。

背景技术

胡椒是我国主要热带农产品，是海南广大农民创收的重要农作物，也是海南省经济发展的一大支柱，它在国民经济的发展过程中有着愈来愈重要的作用。这是因为，一方面，它的种子含有挥发油、胡椒碱、粗脂肪、粗蛋白等，是人们喜爱的调味品；另一方面，医学上胡椒可作为健胃剂、调热剂、利尿剂及支气管粘膜刺激剂，有散寒、健胃、温中之功效，可治疗消化不良、积食不消、胃寒疼痛、心腹冷痛、寒湿反胃、大肠寒滑、虚胀冷积、支气管炎、冷痢、梅毒、感冒、风湿骨痛和肺塞咳嗽痰多等多种疾病；此外，胡椒产业已成为海南岛农业经济发展的重要支柱和农民脱贫致富的主要经济来源。另一方面，在生产上，胡椒是一种重要的热带香辛植物，原产于印度西高止山脉的热带雨林中，目前我国海南、广东、广西、云南、福建等省(区)均有种植。海南岛作为我国主要胡椒生产区以及胡椒育种重点区域，植椒面积约占中国植椒总面积的90％以上，适宜种植胡椒的地域是有限的，海南省种植胡椒的气候和立地条件得天独厚，胡椒产品的质地较越南等周边传统生产国家好。然而，海南胡椒一般每亩每年可产干胡椒200－300市斤，管理良好的胡椒园每亩年产500－600市斤，小面积高产的亩产一年可达1200市斤，总体来说单位面积平均产量不高，究其原因恐怕是多方面的，但是有一点不可否认的是由胡椒病害所带来的严重影响。长期以来，海南岛胡椒品种单一化，以及长期连作均有利于各种病原菌的反复侵染，特别是胡椒瘟病等土传病害的发生给胡椒生产带来严重的危害。

生防细菌在植物病害的防治中占有十分重要的地位，其主要优势有：(1)生防细菌复杂多样的生防机制使病原菌不易产生抗药性。生防细菌的抑菌机理有多种，并且通常是两种以上的抑菌机制协同作用起到防治病害的效果。在植物病害防治实践中，普遍采用的方法是同时使用活菌体和其拮抗性代谢产物，这有利于各种抑菌机制互促互补，从而使生防细菌的生防潜力得到最大限度的发挥。此外，细 菌产生的抑菌活性物质(如细菌素)能同时影响敏感菌的多种代谢途径，如此以来，因病原菌发生突变而对细菌素产生抗性的可能性就不像抗生素那样容易。(2)生防细菌的活体应用使得其防效较之其它微生物更为持久是因为生防细菌大多由农田生态系统中分离出来，一般情况下具有与病原菌相同或相近的生态适应及对寄主植物的亲和性，定殖相对容易，再加上其繁殖迅速，使应用细菌活体防治病害成为可能。而用于生防的其他微生物类群，多数是利用它们的代谢产物防治病害。相比之下，生防细菌定殖后能大量繁殖并建立产生抑菌物质的“活工厂”防效会更持久。(3)代谢旺盛、产生拮抗物质周期短，与生防真菌或放线菌相比生防细菌繁殖速度快得惊人，在适宜的条件下，几十分钟就分裂繁殖一次，一天以后便产生数千万个后代。液体培养条件下，44小时即可达产拮抗物质的高峰期。这有利于节约时间，缩短生产周期，降低生产成本。(4)有利于维持有益微生物的生态平衡，由于生防细菌所产生的抑菌物质通常直接针对相应的病原菌起作用，特异性强，故此不会对农业生态系统其它有益微生物产生不利影响，有助于维持有益微生物的生态平衡。

从胡椒上分离筛选获得对胡椒病害枯萎病和炭疽病具有拮抗作用的生防菌株，对胡椒病害的防治具有重要的意义，但目前相关技术仍然很薄弱，至今有效防治胡椒病害的拮抗细菌未见正式报道，也没有防治胡椒病害的生物农药的报道。

发明内容

本发明的目的针对现有技术的空白提供一株生防菌Kg2A及其在防治胡椒枯萎中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

本发明采用的细菌是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏号为CGMCC.No.10918。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明的生产菌株Kg2A分离自海南省大坡镇的胡椒叶片，经菌落和形态的显微观察、染色反应、常规生理生化特性试验以及16s rDNA序列分析，该菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的一个新菌株，具有以下特征：(1)菌株呈直杆状，常以成对或链状排列，具圆端或方端；芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，无荚膜；革兰氏染色阳性；(2)通过吲哚实验、接触酶实验、氧化酶、柠檬酸盐生长实验等生理生化指标，并结合《伯杰细菌鉴定手册》，鉴定结果Kg2A属 于枯草芽孢杆菌属，结果与分子鉴定一致。

生防菌Kg2A的基本培养基为LB培养基或YEP培养基。

生防菌Kg2A的可利用碳源有：山梨醇、鼠李糖、维生素C、苏氨酸、半乳糖、脯氨酸、甘露醇、麦芽糖、胱氨酸、可溶性淀粉、葡萄糖、酪氨酸、果糖。

生防菌Kg2A对环境的适应能力比较强，可以在4℃-90℃的温度范围内生长，在盐浓度为0-10％均能生长。

本发明还研究了生防菌Kg2A对不同抗生素的敏感性，为化学防治打下基础。

本发明的菌株Kg2A对镰刀菌、镰孢炭疽菌和胶孢炭疽菌具有抑制作用。

本发明的菌株Kg2A或其发酵液可以作为生物防治制剂使用，用于防治植物真菌病害。

本发明还提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Kg2A的应用，该菌株可以用于防治橡胶树炭疽病、甘蔗赤腐病和胡椒枯萎病。

本发明还提供一种植物真菌病害的生物防治方法，向具有真菌病害的植物施用菌株Kg2A或其发酵液，也可以施用含有上述菌株或其发酵液的生物防治制剂，也可以与其他生物防治制剂联合施用。

本发明的菌株Kg2A具有广谱抗菌性，培养简单，适应性强，抗菌能力稳定，可以广泛应用于多种植物真菌病害的防治。

附图说明

图1为Kg2A和其他生防菌的16S rDNA PCR产物电泳图，泳道M为DNA marker，1为Kg1，2为Kg2，3为Kg2A，4为Kg4。

图2为生防菌Kg2A的革兰氏染色结果。

图3为生防菌Kg2A对镰孢炭疽菌的拮抗效果图。

图4为生防菌Kg2A对胶孢炭疽菌的拮抗效果图。

图5Kg2A对胶孢炭疽菌的拮抗效果图。

图6Kg2A对镰刀菌的拮抗效果图。

具体实施方式

实施例1

菌株Kg2A的分离培养和筛选纯化

1.采样

样品为海南省大坡镇的胡椒叶片，将采集好的叶片放入塑料袋中并记录。

1.2材料表面消毒与拮抗细菌分离

1.2.1清水冲洗与剪取病叶

用清水洗去叶片上的灰尘砂砾，晾干。用剪刀在病健交界处剪取大小为5×5mm的小叶片备用。

1.2.2样品消毒

将剪取的小病叶放入烧杯，用升汞浸泡30秒，在浸泡的过程中应注意不断轻轻搅动小病叶，然后用无菌水冲洗三次，晾干，备用。

1.2.3细菌分离培养 

用灭过菌的镊子将剪取的小叶片贴放到PDA固体培养基上，每皿均匀摆放4块，再将培养皿用保鲜膜密封。倒置放入恒温培养箱中，28℃培养。每隔12h进行观察48h后将长出的菌体转接至相同的培养基上，28℃培养48h后进行纯化；同时，将纯化后所得的细菌采用梯度稀释涂布LB平板培养基中，28℃培养48h后挑取单菌落接至相应培养基斜面上。

1.3拮抗细菌的筛选

1.3.1细菌的纯化 

将放置于8～10℃培养箱中的斜面试管取出，在无菌操作台中，将液体LB培养基分装到锥形瓶中，然后用接种针挑去少量的细菌于锥形瓶中，封口。28℃摇床上震荡培养约12小时，取出。然后用移液器吸取200μL于LB固体培养基上，涂抹棒涂抹均匀，于28℃培养箱培养。然后再通过无限稀释法处理获得单一菌株。

实施例2

菌株Kg2A的鉴定

1、微生物学特性：

对在37℃培养箱中划线培育的生防菌株进行形态特征观察，发现生防菌株Kg2A呈直杆状，较少成链，具圆端或方端；芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，无荚膜，为芽孢杆菌属。经革兰氏染色后菌体均呈现出蓝紫色，为革兰氏阳性菌。

2、分子生物学鉴定：

(1)DNA提取：采用本领域通用的试剂盒进行基因组DNA的提取；

(2)PCR反应：细菌通用引物8F和1492R，由英潍捷基(上海)贸易公司合成，结构如下：8F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 

1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，

生防菌株Kg2A的16S rDNA基因扩增结果如图1所示，扩增条带长度约1500bp，与预期大小一致；

(3)将PCR鉴定正确的重组菌送英潍捷基(上海)贸易公司基因测序。

通过在NCBI网上进行比对分析，结果显示与枯草芽孢杆菌属的同源性为99％，因此推断Kg2A菌株属于枯草芽孢杆菌属。

3、生防菌的生理生化鉴定

(1)吲哚试验

①培养基配制：取1％胰蛋白胨水溶液，调pH 7.2-7.6，分装于试管中，高度为试管的1/3-1/4，121℃灭菌20min；

②待培养基冷却后，取10μL供试菌株新鲜种子液接种于胰蛋白胨液体培养基；

③28℃培养，分别于2d、4d后观察结果；

④每次观察时，沿管壁慢慢加入3-5mm高的试剂于培养液表面，在液层界面出现红色，即为阳性反应。若颜色不明显，可在培养液中加入乙醚约1mL，充分震荡，静置片刻，待乙醚浮至液面后再加吲哚试剂，在乙醚和试剂液层界面出现红色，即为阳性反应。

结果均无红色产生，结果如表1所示，故分析生防菌在吲哚为生理生化指标情况下为阴性。

表1吲哚试验结果

注：“+”为阳性，“-”为阴性。 

(2)柠檬酸盐生长试验

①培养基配制：分别取NaCl 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NH₄H₂PO₄0.5g，柠檬酸钠2.0g，琼脂18.0g，0.04％酚红水溶液10mL；蒸馏水补充至1000.0mL， 调pH为7.0，然后加入指示剂，分装试管；

②121℃灭菌20min，摆斜面；

③挑取新鲜培养的供试菌株单菌落在斜面上划线接种，28℃培养3-7d；

④观察实验结果：培养基变蓝色或桃红色为阳性，否则为阴性。

除接生防菌Kg1不变色以外，接其他生防菌均变为桃红色，其余生防菌株为阳性如表2所示；

表2柠檬酸盐生长试验结果

注：“+”为阳性，“-”为阴性。 

(3)最适碳源利用测定

①选取可溶性淀粉、胱氨酸、抗坏血酸、脯氨酸、精氨酸、麦芽糖、酪氨酸、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、甘氨酸、鼠李糖、果糖、草酸、苏氨酸、半乳糖、等碳源利用测定；

②基本培养基：(NH₄)₂SO₄2.0g，NaH₂PO₄·H₂O 0.5g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄7H₂O 0.2g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，蒸馏水补充至1000.0mL，pH 6.5，分装于试管中(每支试管4mL)，121℃灭菌20min；

③将所得碳源配制成5％的水溶液，灭菌后加入试管中，使其终浓度为1％；

④取供试菌株种子液10μL分别加到不同碳源中，并设置空白对照，然后在28℃，200r/min条件下，摇培40h；

⑤若出现明显浑浊，说明该碳源可以被利用；若无，则需从中取出10μL，转接到相应的新的碳源试管中，同样条件下，连续培养3次；如果仍无浑浊，则证明此碳源不适合被供试菌株利用。

实验结果如下：

可利用碳源有：山梨醇、鼠李糖、微C、苏氨酸、半乳糖、脯氨酸、甘露醇、麦芽糖、胱氨酸、可溶性淀粉、葡萄糖、酪氨酸、果糖；

不可利用碳源有：精氨酸、草酸、甘氨酸。

(4)最适生长温度的测定

①LB培养基配置：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水补充至1000.0mL，分装于试管，121℃灭菌20min后冷却；

②将菌株分别接入试管中，分别置于4℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、99℃摄氏度下培养10min(40℃温度培养12h)；

③划线培养：分别将上述不同温度下的菌株进行划线，37℃培养24小时，分别观察其生长情况。

对生防菌的生长温度进行测定，结果如下：

表3最适生长温度的测定结果

注：“+”为能生长，“-”为不能生长。

(6)拮抗菌耐盐性测定

培养24h后，取出观察各试管中菌株的生长状况，结果如下：

表4生防菌耐盐性测定结果

注：“+”为菌株生长，“-”为不生长。 

由表3-2可以看出，除菌株Kg1只能在盐浓度为0-7％时生长，其余4种拮抗菌在盐浓度为0-10％均能生长，且在盐浓度为0的环境中生长状况最佳，在实验范围内，随盐浓度的增加其生长趋势逐渐减弱，直至盐浓度为12％及以后，生防菌不再生长。

(7)接触酶试验 

①用液体培养基摇培菌株16h；

②接种环蘸取培养16h的新鲜菌液，涂在在已滴有3％过氧化氢水溶液的玻片上；

③观察结果：有气泡产生为阳性，无气泡为阴性。

结果发现Kg2A新鲜菌液涂在在已滴有3％过氧化氢水溶液的玻片上时，均有气泡产生；显示接触酶实验结果为阳性。

表5接触酶试验结果

注：“+”为阳性，“-”为阴性

(8)氧化酶试验 

①用液体LB培养基摇培菌株16h；

②在干净培养皿里放一张滤纸，滴加1％二甲基对苯撑二胺盐酸盐水溶液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿；

③用接种环取培养16h的新鲜菌液，涂抹在湿润的滤纸上；

④观察结果：在10s内涂抹的菌苔现红色者为阳性，10-60s现红色者为延迟反应，60s以上现红色者不计，按阴性处理。

结果显示：在涂抹菌苔后的60S内均未产生颜色的变化；全部显示阴性。

表6氧化酶试验结果

注：“+”为阳性，“-”为阴性

(9)对抗生素的敏感性研究

用滤纸片法测定菌株Kg2A对不用抗生素的敏感性，用打孔器制备直径7毫米的滤纸片，高温灭菌。在溶化后冷却至50摄氏度～55摄氏度的LB固体培养基 中加入1毫升供试菌株种子液，摇匀后倒平板，将灭菌后的滤纸片置于平板中，然后在滤纸上添加抗生素溶液，添加量相当于氨苄青霉素Amp 50微克每毫升、卡那霉素Kana 50微克每毫升、氯霉素Chl 50微克每毫升、链霉素Str 50微克每毫升、四环素Tet 50微克每毫升、红霉素Ery 50微克每毫升、利福平Rif 50微克每毫升、头孢霉素Cef 50微克每毫升。放置于28摄氏度恒温培养箱内培养，分别于24小时、48小时观察结果。结果如下：

表7抗生素抗性实验结果

注：“+”为出现抑菌圈，“-”为不出现抑菌圈。

实施例3

生防菌Kg2A对病原菌的抑菌试验

在事先备好的PDA平板中央，接种直径为6mm的供试病原菌菌块，同时在距PDA平板中心25mm的对称两点处接种待测细菌，每株菌重复3次，28℃恒温倒置培养，6d后观察抑菌状况。

实施例4

形态对峙试验 

培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂粉20g，蒸馏水补充至1000.0mL，121℃灭菌20min。

通过对生防菌Kg2A进行对峙培养试验，结果显示Kg2A的第1-10代稳定拮抗镰孢炭疽菌和胶孢炭疽菌。

以上所披露的仅为本发明的较佳实施例，不能以此来限定本发明的权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。