一种猪胃肠道内容物代谢组学提取方法

摘要

本发明公开了一种猪胃肠道内容物代谢组学提取方法，方法如下：称量解冻的胃肠道内容物1g，采用1M NaOH溶液和1M HCl溶液将pH值调整到8.0，然后称取0.1g混匀的内容物，加入0.1M磷酸盐缓冲液(pH值8.0)1mL，液氮速冻后，水浴锅中超声并解冻，置于组织破碎仪中(20Hz，30s)破碎，如此反复冻融、超声和破碎处理3个循环。最后，4℃，5 000rpm离心10min，取上清液0.6mL加入5mm核磁管备用。可检测代谢物51种，其中，氨基酸20种，短链脂肪酸7种，三羧酸循环代谢物5种，其他代谢物19种，整个提取过程仅需3h。谱峰漂移受pH值影响很小。因此，该方法不仅提高了代谢物的提取率，提高了核磁谱图的质量，而且简化了提取流程。

说明书

技术领域

本发明属于代谢组学技术领域。具体涉及一种猪胃肠道内容物代谢组学提取方法。

背景技术

应激与断奶综合症等因素引起的仔猪肠道健康问题是导致仔猪死亡和养猪生产效益 下降的重要原因。仔猪消化不良会引起腹泻和细菌感染，并引起免疫力下降，发病率增 加，甚至死亡。由于饲料到达肠道后首先会经过肠道菌群的作用，所以肠道菌群在饲料 消化、吸收和代谢以及菌群代谢物在影响宿主代谢中均扮演着重要角色。肠道菌群作为 定植在肠道中的特殊群落和肠黏膜细胞一起参与日粮碳水化合物、氨基酸、脂质等营养 物质的代谢，对饲料营养物质的代谢和利用产生深远的影响。比如，肠道微生物对肠腔 内尿素的水解和对日粮氨基酸的脱氨基作用会导致用于体蛋白质合成和沉积的日粮氨基 酸分解和损失，特别是必需氨基酸。猪肠道微生物与黏膜对氨基酸的竞争利用并共代 谢，肠道微生物和肠黏膜的蛋白质周转迅速且量大。受日粮因素和肠黏膜分泌物的刺 激，肠道微生物可通过调节自身的基因表达和蛋白分泌，以适应肠道内环境²。肠道微生 物可以代谢氨基酸产生氨和其他氨基酸等代谢物，也能利用氨态氮合成氨基酸。因此， 肠道微生物不仅对碳水化合物代谢具有影响，而且可以调节宿主的氨基酸池和氮周转。

随着代谢组学研究的不断深入和研究领域的不断拓展，肠道内容物代谢组学研究也 成为了目前代谢组学的热点应用领域之一。肠道内容物代谢组的研究方法，主要可以分 为菌群代谢足迹和代谢指纹的研究方法，菌群代谢足迹是对其微生物体外代谢产物的表 征和变化规律的研究，而代谢指纹是对其微生物体内所有代谢物的定性和定量研究，其 关系见图1所示。通过代谢指纹的表征可以得到微生物代谢的最直接证据，实时的反映其 代谢的过程和行为，而通过代谢足迹则可以得知其代谢的结果，而且往往代谢足迹有蓄 积的作用，这样就可以放大代谢指纹的结果，更加利于检测和表征。

目前关于肠道内容物代谢组的研究刚刚起步，尚有许多方法学的问题有待解决。一 方面，不同肠段的pH值变化非常大，成年猪胃内容物的pH值在2.0-3.5之间、空肠和回 肠pH值在6.0-7.5、盲肠pH值在4.5-6.0之间、结肠和直肠pH值在5.0-8.0之间。内容物 从胃到直肠被排出体外，pH值也从2变化到8左右。这主要与内容物中酸性和碱性物质 组成和比例相关。此外，pH值还会随着摄入食物的组成和胃肠道状态而出现变化。所 以，胃肠道内容物的pH值可能存在从2到8的一段较大的动态范围。而内容物中的不同 成分，对pH值的反应也会不同，这对内容物中化合物的提取造成了较大影响。并且基于 NMR的代谢组学分析方法中，NMR检测对pH值有着严格要求，因为pH值对化学物质 的化学位移有着大的影响。所以，对于基于NMR的代谢组学研究中，找到针对于胃肠道 内容物合适的pH值是十分必要的。其次，胃肠道内容物组成研究中，最为普遍的方法是 氨基酸和短链脂肪酸的检测方法。由于进行氨基酸检测时，需要高温(110℃)和强酸条件 下消解⁶，无法保留肠道内容物的原貌，特别是短链脂肪酸。而短链脂肪酸的检测方法也 不能检测氨基酸等其他的化合物。肠道菌群除了产生甲酸、乙酸、丙酸和丁酸等短链脂 肪酸外，还会产生其他重要的代谢物。比如，采用氯仿、甲醇和水提取法提取到枯草杆 菌包括糖酵解和三羧酸循环代谢物的上百种物质。

因此，由于代谢组学分析需要保持代谢物的原貌而且力图检测到尽量多的代谢物， 这就需要对目前存在的提取方法进行筛选和优化，避免温度过高、操作过于繁琐和提取 效率较低的提取方法，进而找到适合于胃肠道内容物代谢组学分析的提取方法。

现有尹富贵等采用的肠道内容物氨基酸提取方法：称取冻干回肠末端内容物0.5g置 于安培瓶中，加入6mol/L盐酸10ml后混匀，密封。110℃消化24h，定容至100ml，吸 取2ml经0.25m微孔滤膜过滤，用L-8800型全自动氨基酸分析仪测定15种氨基酸(Phe、 Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Gly、Asp、Glu、Cys、His、Lys、Arg、Thr和Ser)的含量， 然后乘以稀释倍数换算成内容物中氨基酸的含量。其缺点是采用浓硫酸和硝酸高温消解 肠道内容物蛋白质和氨基酸，具有耗时，环境污染大等缺点。

现有肠道内容物短链脂肪酸提取方法：高增兵等取盲肠内容物3g，用蒸馏水进行稀 释(质量体积比1：1)，振荡混匀至无明显结块的悬浮状。500×g离心10min，取上清 液2mL至新EP管中，12000×g离心10min，取上清液1mL，加入25％的偏磷酸0.2 mL，充分混匀，静置30min后12000×g离心10min，取上清液100μL，加入甲醇100 μL，充分混匀并12000×g离心10min，收集上清液于EP管中，-20℃冰箱保存待测。 采用气相色谱仪(VARIANCP-3800，美国)测定乙酸、丙酸、丁酸浓度进行。其缺点是采 用偏磷酸和甲醇提取短链脂肪酸，操作较为繁琐，具有耗时较长，环境污染大等缺点。 而且只能检测到3种短链脂肪酸。

另外，李春慧等称量解冻的盲肠内容物2g，加入蒸馏水10mL，4℃浸泡48h；然后 4℃，5000r/min离心10min，取上清液1mL，加入25％的偏磷酸去蛋白溶液0.2mL， 混匀，冰浴30min以上；冰浴后，立即4℃，10000r/min离心10min，取上清液备用。 用微量移液枪吸取0.6μL待测液进样，采用气相色谱测定乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊 酸、异戊酸和总VFA的含量。其缺点是提取程序耗时较长。虽然可以同时测定乙酸、丙 酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸的浓度，但由于仅仅针对性检测短链脂肪酸，不能同 时检测氨基酸以及其他的化合物。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种猪胃肠道内容物代谢组学提取方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述猪胃肠道内容物代谢组学提取方法包括如下步骤：

(1)用1M NaOH溶液和1M HCl溶液将解冻的猪胃肠道内容物的pH值调整到2.0 —12.0，优选为8.0；

(2)取猪胃肠道内容物加入0.1M或1M的磷酸盐缓冲液中，猪胃肠道内容物与磷酸 盐缓冲液的质量体积比为1:20至1:2，优选为1:10，质量体积比的单位为g/mL，经液氮速 冻后，于水浴锅中超声解冻，然后置于组织破碎仪中破碎；将破碎后的猪胃肠道内容物再 重复液氮速冻、超声解冻、破碎仪破碎处理2—3次，优选2次；

(3)将经步骤(2)处理后的猪胃肠道内容物于4℃、12000rpm离心，取上清液，取 上清液0.6mL加入5mm核磁管待检，上清液即为猪胃肠道内容物的提取物。

优选地，内容物提取过程于冰上(0—4℃)或室温(25℃)条件下操作。

优选地，用水配制步骤(2)所述的磷酸盐缓冲液，所用的水中重水含量为10—100％， 优选100％，所用TSP内标浓度为0.005—0.1％，优选0.01％，配制后的磷酸盐缓冲液的 pH值为7.0—8.0，优选8.0。

优选地，用甲醇和水混合溶液配制步骤(2)所述的磷酸盐缓冲液，所用TSP内标浓 度为0.005—0.1％，优选0.01％，配制后的磷酸盐缓冲液的pH值为7.0—8.0，优选8.0。

优选地，用乙腈和水混合溶液配制步骤(2)所述的磷酸盐缓冲液，所用TSP内标浓 度为0.005—0.1％，优选0.01％，配制后的磷酸盐缓冲液的pH值为7.0—8.0，优选8.0。

本发明所述的提取方法是pH值校正后磷酸盐缓冲液提取新方法，不仅保证了胃肠道 内容代谢物组成的原貌，将核磁谱峰漂移减小到最低程度，提高了核磁谱图的质量，同 时简化了提取工艺流程。通过对提取工艺流程的优化，方法如下：称量解冻的胃肠道内 容物1g采用1M NaOH溶液和1M HCl溶液将pH值调整到8.0，然后称取0.1g混匀的内 容物(冰上操作，以保证在0-4℃)，加入0.1M磷酸盐缓冲液(pH值8.0，0.01％TSP， 100％重水)1.0mL，液氮速冻后，水浴锅中超声并解冻后，置于组织破碎仪中(20Hz， 30s)，如此反复冻融、超声和破碎处理3个循环。最后，4℃，12000rpm离心10min， 取上清液0.6mL加入5mm核磁管备用。可检测代谢物51种，其中氨基酸20种，短链脂 肪酸7种，三羧酸循环代谢物5种，其他代谢物19种，整个提取过程仅需3h。谱峰漂移 受pH值影响很小。因此，该提取方法不仅提高了代谢物的提取率，提高了核磁谱图的质 量，而且简化了提取流程，实现了内容物中代谢物的全谱检测。

现有技术包括氨基酸提取工艺、短链脂肪酸提取工艺等，提取操作程序复杂，耗时较 长，由于使用大量有机溶剂，成本高，环境污染较大，也无法实现内容物所有组分的同 时检测。为了在既保证猪胃肠道内容物提取率的前提下，又最大程度的简化提取工艺， 降低提取成本。本发明直接采用磷酸盐缓冲液提取法替代盐酸消解和偏磷酸提取法，同 时简化提取流程，尽量减少操作对实验结果的影响，保持内容物代谢物组成的原貌。并 在样品提取前对pH值进行校正，以保证核磁谱峰漂移最小，最终达到既保证水溶性代谢 物的提取效率最高，又能明显改善核磁谱峰的质量，为胃肠道内容物代谢组学研究提供 新的样品提取方案。

附图说明

图1为肠道菌群代谢指纹与代谢足迹的代谢组学研究方法示意图；

图2为NMR谱积分后主成分分析的得分图，箭头代表样品点在得分图上的分布变 化，椭圆形框则代表出现2个明显聚类，即pH值7.0到pH值8.5和pH值10.0到pH值 12.0；

图3为提取磷酸盐缓冲液中重水含量为5％、10％、50％和100％的压水峰核磁谱图(① 为5％重水，②为10％重水，③为50％重水，④为100％重水)；

图4为提取缓冲液中TSP浓度0.005、0.01、0.05到0.1％的TSP谱峰(①为0.005％， ②为0.01％，③为0.05％，④为0.1％)；

图5为提取缓冲液中TSP浓度为0.1％的TSP谱峰；

图6为不同提取温度NMR谱积分后主成分分析的得分图(□表示在冰上(0-4℃)提 取样品，▲代表在室温(25℃)提取样品)；

图7仔猪盲肠内容物NMR谱图；检测到代谢物包括：1,甲酸；2,乙酸；3,丙酸；4,丁 酸；5,α-酮甲基-正戊酸；6,酮异己酸；7,酮异己酸；8,异亮氨酸；9,亮氨酸；10,缬氨酸；11, 丙氨酸；12,苏氨酸；13,赖氨酸；14,胍氨酸；15,精氨酸；16,脯氨酸；17,谷氨酸；18,谷氨 酰胺；19,蛋氨酸；20,甘氨酸；21,天冬氨酸；22,天冬氨酰；23,酪氨酸；24,色氨酸；25,苯 丙氨酸；26,组氨酸；27,牛磺酸；28,三甲胺；29,肌酸；30,肌酐；31,胆碱；32,甲醇；33,α- 木糖；34,尿嘧啶；35,延胡索酸；36,尿刊酸；37,苹果酸；38,琥珀酸；39,5-氨基戊酸；40, 丙酮酸；41,α-酮戊二酸；42,二甲胺；43,胆盐；44,腺嘌呤；45,肌苷；46,α-半乳糖；47,β-半 乳糖；48,尿苷；49,3-羟基苯乙酸；50,3-羟基苯丙酸；51,乳酸。

具体实施方式

实施例1

1内容物样品

21日龄仔猪盲肠内容物样品。

2实验设备

分析天平(Sartorius BS110S)，德国Sartorius公司；微量加样器，美国Thermo公司； 酸度计(HANNA pH 211型)，意大利HANNA公司；漩涡振荡器(GL-8813型)，江苏 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；低温冷冻大容量离心机(Anke DL-4000B型)，上海 安亭科学仪器厂；超低温冰箱(SANYO Ultra low freezer)，日本SANYO公司；Bruker  Avance DRX-600高分辨核磁共振谱仪，德国Bruker Biospin公司。

3提取方法：

称量解冻的胃肠道内容物1g采用1M NaOH溶液和1M HCl溶液将pH值调整到8.0， 然后称取0.1g混匀的内容物，加入0.1M磷酸盐缓冲液(100％重水，TSP内标浓度为0.01％， pH值为8.0)1.0mL，液氮速冻后，冰浴锅中超声并解冻后，置于组织破碎仪中(20Hz， 30s)，如此反复冻融、超声和破碎处理3个循环。最后，4℃，12000rpm离心10min， 取上清液0.6mL加入5mm核磁管备用。

4本发明核磁共振检测方法：

采用Amix(V3.8.3,Bruker Biospin,Germany)软件对内容物提取液的¹H NOESY谱进 行自动积分。为了消除残余水峰对分析造成的影响，将水峰所在的δ4.54-5.20区间的积分 值去掉。将NMR谱的δ0.5-4.54和δ5.20-8.5ppm区间的积分值进行归一化处理(每个区 间的积分值与总积分值的比值)，积分间隔0.002ppm。随后将归一化的数据导入 SIMCA-P⁺11.0软件包(Umetrics,Sweden)进行多变量分析。通过主成分分析法对样品的 群体聚类情况进行分析，PCA结果用得分图来表示。

5pH值对内容物主要代谢物化学位移的影响评价

采用TopSpin 2.0软件观察并记录内容物中的主要代谢物，如，氨基酸类(亮氨酸、丙 氨酸、组氨酸、甘氨酸等)、有机酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和乳酸等)、葡萄糖(α- 葡萄糖和β-葡萄糖)的化学位移，研究他们随着pH的变化时的变化幅度。PCA的得分图 如图2所示，由于培养上清的成分一致，导致样品之间的不同聚类主要来至pH值的变 化，样品点之间的距离也就代表了pH值对内容物代谢物化学位移的影响，距离近则影响 小，距离远则影响大。

从图2中可知，随着pH值从2.0变化到12.0，样品在得分图的PC1维和PC2维表现 为分布的连续变化。如果以得分图上点的距离代表pH值对代谢物化学位移的影响，则可 发现如下变化：从pH值2.0到pH值6.5，样品点分布的变化较大，而从pH值7.0到pH 值8.5，则变化相对较小，从pH值9.0到pH值10.0之间变化又加剧，最后9.5-12之间变 化较小。而且，在得分图上明显出现两个聚类，即pH值7.0到pH值8.5和pH值10.0到 pH值12.0(如图2，虚线椭圆形框所示)。这可能与内容物组成中主要以酸性物质为主有 关，酸性物质在中性和碱性环境中，其核磁谱谱化学位移会比较稳定。

因此，本方法中内容物的pH值条件为2.0-12.0，更优选8.0，所述的磷酸盐缓冲液pH 值条件为7.0-8.5，更优选8.0。

6不同提取方法之间的提取效率比较

6.1提取溶液与内容物比例的优化

由于提取溶液与内容物的比例越大，提取代谢物的效率会越高，但是浓度会降低，从 而增加后期核磁检测的采样次数和时间。在采样次数为64次的前提下，通过核磁共振谱 图比较不同溶剂比例(提取溶液与内容物比例为20：1、10：1、5：1和2.5：1)之间的 信噪比。结果表明，提取溶液与内容物比例最优为10：1。

6.2破碎处理方式的优化

在提取溶液与内容物比例为10：1的基础上，进一步优化破碎处理方式。去除谱图中 的4.54—5.2ppm水峰后，以0.002ppm的积分区间采用Amix(Bruker,Germany)软件对 压水的NOESY ¹H谱的8.5—5.2ppm和4.54—0.5ppm以进行自动积分(绝对值)，并以 TSP的积分值(0.02ppm至-0.02ppm)为1进行归一化，以不同提取方法的归一化积分值 之和评价提取效率。冻融、超声和破碎循环次数不同的产量如表1所示，随着循环次数从 高至低依次为：循环4次>循环3次>循环2次>循环1次，说明随着循环次数的增加，提 取效率会增加，循环次数从1次增加到3次，提取效率有显著提高(P<0.05)，而循环次 数从3次增加到4次，没有明显差异(P>0.05)。说明循环3次可以达到最优化循环次数。 因此，所述的破碎处理方式为冻融、超声和破碎1—4个循环，更优选3个循环。

表1冻融、超声和破碎循环次数不同之间的产量比较

注：^a，与循环1次相比P<0.05；^b，与循环2次相比P<0.05；^c，与循环3次相比P<0.05； ^d，与循环4次相比P<0.05

6.3重水含量的优化

提取磷酸盐缓冲溶液中重水的含量直接与核磁检测过程中的压水的难易程度相关，水 峰面积小时，核磁谱图的质量较高。如图3所示，重水含量为10％和20％时压水峰面积较 大，重水含量为50％时压水峰面积较小，100％时面积最小。因此，提取缓冲溶液中重水的 含量最优选为100％。

6.4TSP内标含量的优化

TSP作为核磁检测过程中的内标物质，其浓度应该与提取液所含物质的浓度相匹配。 如图4所示，从TSP浓度0.005、0.01、0.05到0.1％，峰面积成比例增加，而TSP浓度为 0.005％时，采样次数为64次，谱峰信号较弱。而从图5可看出，TSP浓度为0.1％时，其 谱峰远远高于样品中的其他物质峰强度。因此，综合以上实验数据，更优选的TSP内标浓 度应为0.01％。

6.5提取温度的优化

对提取液中的主要代谢物，如：氨基酸类(组氨酸、丙氨酸、甘氨酸)、有机酸(乳 酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸)、葡萄糖(α-葡萄糖和β-葡萄糖)的积分值进行归 一化，比较他们在不同温度(冰上为0—4℃，室温为25℃)下提取时的变化。PCA的得 分图如图6所示，由于不同温度下内容物中微生物和酶的代谢活性不同，会对最终提取液 中的代谢物成分造成影响，导致样品之间的不同聚类主要来至温度的变化，不同样品出 现了明显的聚类。

因此，样品提取时在0—4℃(冰上)和25℃(室温)操作，更优选0—4℃。

7在上述最优化提取方法下得到内容物核磁谱图结果

仔猪盲肠内容物核磁谱图见图7所示，从盲肠内容物核磁谱图中指认大约51种代谢 物，其中包括20种氨基酸和7种短链脂肪酸。

采用本发明提取方法，不仅保证了胃肠道内容物的代谢物原貌，将核磁谱峰漂移减 小到最低程度，也简化了提取流程，提高了代谢物的提取效率，改善了核磁谱图的质 量。