基于色谱-光谱仪联用和子空间夹角判据的丹皮酚含量的分析方法

摘要

本发明公开了一种基于色谱-光谱仪联用和子空间夹角判据的丹皮酚含量的分析方法，具体按照以下步骤实施：丹皮酚标准光谱库建立，待测样本的制备及紫外光谱采集，建模本底数据库的建立，待测样本中丹皮酚含量测定。本文通过液相-紫外可见光谱仪联用，应用子空间-夹角判据，建立了丹皮酚含量快速分析方法。对于同类样品的测定，而且只需一次建模便可批量检测。与高效液相色谱法相比，所建立的方法稳定可靠、操作简便，样品不需要复杂的前处理，为丹皮酚含量快速测定提供了一种比较实用的定量分析技术，并可推广应用于其它丹皮酚制品检测领域。

说明书

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种基于色谱-光谱仪联用和子空间夹角判据的丹皮酚含量的分析方法。

背景技术

丹皮酚是从中国的国花牡丹花的根皮中提取物出来的一种中药材。提取自毛茛科植物牡丹的干燥根皮。丹皮酚药理应用价值广泛，除用于医疗制剂原料外，还用于牙膏、护肤、美容等日化品中。丹皮酚的含量测定是各种制剂和产品质量控制的主要指标之一。目前丹皮酚含量分析多采用高效液相色谱法，该法敏度高，但分析成本高，操作强度大，大批量样本的分析效率低，需要建立一种丹皮酚含量快速分析新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于色谱-光谱仪联用和子空间夹角判据的丹皮酚含量的分析方法，解决了现有技术中存在的分析效率低、操作强度大以及分析成本高的问题。

本发明所采用的技术方案是，一种基于色谱-光谱仪联用和子空间夹角判据的丹皮酚含量的分析方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1、丹皮酚标准光谱库建立，

步骤2、待测样本的制备及紫外光谱采集，

步骤3、建模本底数据库的建立，

步骤4、待测样本中丹皮酚含量测定。

本发明的特点还在于，

丹皮酚标准光谱库建立具体为：配制系列浓度为0.2～20mg/L的丹皮酚标准溶液，以75％乙醇为空白，采集系列溶液的190nm-1100nm波长范围光谱；选择200nm-400nm波长范围光谱，经多变量最小二乘回归后得到丹皮酚标准光谱y_i＝a_ix+b_i，记为V。

待测样本的制备及紫外光谱采集具体为：取丹皮酚结晶母液，室温下，分别取0.15g上层溶液和下层晶体各一份，用75％乙醇稀释到浓度为10-20mg/L，得到样本S₁和S₂；

取不同生产批次的丹皮酚结晶母液两份，分别加热至50℃成熔融状态，分别称取1.2g和0.9g，用75％乙醇稀释到浓度为10-20mg/L，得到样本S₃和S₄；

称取丹皮酚结晶产品0.1g，用75％乙醇稀释到浓度为10-20mg/L，得到样本S₅；取S₁-S₅等体积混合得到样本S₆；

采集S₁-S₆的紫外光谱数据，得到待测样本数据库，记为D；积分时间15微秒，积分次数20次，波长200-400nm。

步骤3建模本底数据库的建立具体为：对待测样品S₁-S₆和丹皮酚对照品样本B₃，通过高效液相色谱与光谱仪联用，采集各样本经过色谱柱完全分离后的多波长光谱数据；从待测样品光谱数据中扣除待测组分丹皮酚的光谱数据，并经数据降维，得到本底光谱数据库N；

液相色谱条件:4.6mm×150mm C₁₈柱；梯度洗脱，流动相：0～30min，乙腈：水＝40：60(V/V)；30～55min，乙腈：水＝5：95(V/V)；55～80min，乙腈：水＝95：5(V/V)；流速1mL/min；进样量20μL；柱温20℃；色谱检 测波长270nm；光谱条件：流动比色皿1cm；积分时间：15微秒；积分次数：20次；紫外检测波长：200-400nm。

本底光谱数据库的降维中，所述本底光谱数据库W降低到适当的维数的方法如下：应用[U，S，V]＝svd(W)对本底光谱数据库W进行奇异值分解降维，分解后得到m阶行正交矩阵U、n阶列正交矩阵V和奇异值矩阵S，取U的前q列，为降维后的本底数据库N。

待测样本中丹皮酚含量测定具体为：将上述标准光谱数据库V，本底光谱数据库N以及D导入计算平台，选取200-400nm波长段，应用向量-子空间夹角判据算法分别计算各待测样本中丹皮酚的含量。

待测样本中丹皮酚含量测定的具体步骤为：

步骤4.1、依据定量精度设定扣减步长Δ；

步骤4.2、在算式y_i＝a_ix+b_i中带入较大的x₁值，得到v₁；

所述的y_i表示在i波长下丹皮酚的吸光度值，a_i、b_i是常数，x表示对羟基苯甲酸的浓度，v₁表示在浓度为x₁时丹皮酚的多波长吸光度值y₁，v₁为所有的y_i值组成的矩阵；

步骤4.3、从待测样本光谱数据a中扣除v₁/Δ，扣除后的变量记为da；把本底光谱数据库N和变量da合并后记为对比空间M，计算对比空间M与v₁夹角；

步骤4.4、从待测样本光谱数据a中逐步扣除v₁后，重复步骤(3)；

步骤4.5、当待测样本中的丹皮酚完全被扣除后，比对空间M和丹皮酚的光谱向量v₁的空间夹角值会出现最大值θ_max，记录空间夹角最大值θ_max出现时对应的扣减步数λ，通过丹皮酚的浓度x₁和扣减步数估算待测样本中丹皮酚的含量Y₁，计算式为Y₁＝X₁×λ/Δ，得到的Y₁即为待测样本中丹皮 酚的含量值。

本发明的有益效果是：本文首先构建丹皮酚标准数据库，然后通过对不同批次丹皮酚结晶母液样品进行一次高效液相色谱-光谱仪联用，采集各样品经色谱分离后的光谱数据，经数据处理获得不含被测组分丹皮酚的本底数据，结合空间夹角判据算法可实现直接分析待测样本中丹皮酚含量。本文通过液相-紫外可见光谱仪联用，应用子空间-夹角判据，建立了丹皮酚含量快速分析方法。对于同类样品的测定，而且只需一次建模便可批量检测。与高效液相色谱法相比，所建立的方法稳定可靠、操作简便，样品不需要复杂的前处理，为丹皮酚含量快速测定提供了一种比较实用的定量分析技术，并可推广应用于其它丹皮酚制品检测领域。

附图说明

图1是丹皮酚母液和丹皮酚对照品的液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明提供一种基于色谱-光谱仪联用和子空间夹角判据的丹皮酚含量的分析方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1、丹皮酚标准光谱库建立，

配制系列浓度为0.2～20mg/L的丹皮酚标准溶液，以75％乙醇为空白，采集系列溶液的190nm-1100nm波长范围光谱；选择200nm-400nm波长范围光谱，经多变量最小二乘回归后得到丹皮酚标准光谱y_i＝a_ix+b_i，记为V。

步骤2、待测样本的制备及紫外光谱采集，

取丹皮酚结晶母液，室温下，分别取0.15g左右上层溶液和下层晶体各一份，用75％乙醇稀释到浓度为10-20mg/L，得到样本S₁和S₂。

取不同生产批次的丹皮酚结晶母液两份，分别加热至50℃成熔融状态，分别称取1.2g和0.9g，用75％乙醇稀释到10-20mg/L，得到样本S₃和S₄。

称取丹皮酚结晶产品0.1g，用75％乙醇稀释到10-20mg/L，得到样本S₅；取S₁-S₅等体积混合得到样本S₆。

采集S₁-S₆的紫外光谱数据，得到待测样本数据库，记为D。积分时间15微秒；积分次数20次；波长200-400nm。

步骤3、建模本底数据库的建立，

对待测样品S₁-S₆和丹皮酚对照品样本B₃，通过液相色谱与光谱仪联用，采集各样本经过色谱柱完全分离后的多波长光谱数据，从待测样品光谱数据中扣除待测组分丹皮酚的光谱数据，并经数据降维，得到本底光谱数据库N。

液相色谱条件:C₁₈柱(4.6mm×150mm)；梯度洗脱，流动相：0～30min，乙腈：水＝40：60(V/V)；30～55min，乙腈：水＝5：95(V/V)；55～80min，乙腈：水＝95：5(V/V)。流速1mL/min；进样量20μL；柱温20℃；色谱检测波长270nm。

光谱条件：流动比色皿(1cm)；积分时间：15微秒；积分次数：20次；紫外检测波长：200-400nm。

步骤4、待测样本中丹皮酚含量测定。

将上述标准光谱数据库V，本底光谱数据库N以及D导入Matlab计算平台，选取200-400nm波长段，应用向量-子空间夹角判据算法(简称VS法)分别计算各待测样本中丹皮酚的含量；

其中，待测样本中丹皮酚含量测定具体为：

步骤4.1、依据定量精度设定扣减步长Δ；

步骤4.2、在算式y_i＝a_ix+b_i中带入较大的x₁值，得到v₁；

所述的y_i表示在i波长下丹皮酚的吸光度值，a_i、b_i是常数，x表示丹皮酚的浓度，v₁表示在浓度为x₁时丹皮酚的多波长吸光度值y₁，v₁为所有的y_i值组成的矩阵；

步骤4.3、从待测样本光谱数据a中扣除v₁/Δ，扣除后的变量记为da；把本底光谱数据库N和变量da合并后记为对比空间M，计算对比空间M与v₁夹角；

步骤4.4、从待测样本光谱数据a中逐步扣除v₁后，重复步骤4.3；

步骤4.5、当待测样本中的丹皮酚完全被扣除后，比对空间M和丹皮酚的光谱向量v₁的空间夹角值会出现最大值θ_max，记录空间夹角最大值θ_max出现时对应的扣减步数λ，通过丹皮酚的浓度x₁和扣减步数估算待测样本中丹皮酚的含量Y₁，计算式为Y₁＝X₁×λ/Δ，得到的Y₁即为待测样本中丹皮酚的含量值。

实施例1

1实验部分

1.1仪器与试剂 

高效液相色谱仪(LC-20AT，岛津)；紫外-可见光纤光谱仪(Maya2000，Ocean Optics)；电子分析天平(AL104，梅特勒-托利多)；超声波清洗机(上海之信仪器有限公司)；无水乙醇(AR)，甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，丹皮酚对照品(纯度99.9％)，丹皮酚结晶母液(广西亿康制药业有限公司)。

1.2试验方法

1.2.1丹皮酚标准光谱库建立

精确称取0.1010g丹皮酚对照品，用75％乙醇定容到100mL。依次配制 浓度为2mg/L、4mg/L、8mg/L、12mg/L、16mg/L、20mg/L丹皮酚-75％乙醇溶液B₁-B₆。采集各溶液200nm-400nm紫外光谱，经最小二乘回归得到标准光谱库V。

1.2.2待测样本的制备及紫外光谱采集

取生产企业提供的丹皮酚结晶母液，室温下，分别取0.15g左右上层溶液和下层晶体各一份，用75％乙醇稀释到一定浓度，得到样本S₁和S₂。

取不同生产批次的丹皮酚结晶母液两份，分别加热至50℃成熔融状态，分别称取1.2g和0.9g，用75％乙醇稀释到一定浓度，得到样本S₃和S₄。

称取丹皮酚结晶产品0.1g，用75％乙醇稀释到一定浓度，得到样本S₅。取S₁-S₅等体积混合得到样本S₆。

采集S₁-S₆的紫外光谱数据，得到待测样本数据库，记为D。积分时间15微秒；积分次数20次；波长200-400nm。

1.2.3建模本底数据库的建立

对待测样品S₁-S₆和丹皮酚对照品样本B₃，通过液相色谱与光谱仪联用，采集各样本经过色谱柱完全分离后的多波长光谱数据。从待测样品光谱数据中扣除待测组分丹皮酚的光谱数据，并经数据降维，得到本底光谱数据库N。

液相色谱条件:C₁₈柱(4.6mm×150mm)；梯度洗脱，流动相：0～30min，乙腈：水＝40：60(V/V)；30～55min，乙腈：水＝5：95(V/V)；55～80min，乙腈：水＝95：5(V/V)。流速1mL/min；进样量20μL；柱温20℃；色谱检测波长270nm。

光谱条件：流动比色皿(1cm)；积分时间：15微秒；积分次数：20次；紫外检测波长：200-400nm。

1.2.4待测样本中丹皮酚含量测定

将上述标准光谱数据库V，本底光谱数据库N以及D导入计算平台，选取200-400nm波长段，应用向量-子空间夹角判据算法(简称VS法)分别计算各待测样本中丹皮酚的含量。其中，待测样本中丹皮酚含量测定具体为：

步骤4.1、依据定量精度设定扣减步长Δ(本实施例为1000)；

步骤4.2、在算式y_i＝a_ix+b_i中带入较大的x₁值，得到v₁；

所述的y_i表示在i波长下丹皮酚的吸光度值，a_i、b_i是常数，x表示丹皮酚的浓度，v₁表示在浓度为x₁时丹皮酚的多波长吸光度值y₁，v₁为所有的y_i值组成的矩阵；

步骤4.3、从待测样本光谱数据a中扣除v₁/Δ(本实施例是扣除Δv₁＝v₁/1000)，扣除后的变量记为da；把本底光谱数据库N和变量da合并后记为对比空间M，计算对比空间M与v₁夹角；

步骤4.4、从待测样本光谱数据a中逐步扣除v₁后，重复步骤4.3；

步骤4.5、当待测样本中的丹皮酚完全被扣除后，比对空间M和丹皮酚的光谱向量v₁的空间夹角值会出现最大值θ_max，记录空间夹角最大值θ_max出现时对应的扣减步数λ，通过丹皮酚的浓度x₁和扣减步数估算待测样本中丹皮酚的含量Y₁，计算式为Y₁＝X₁×λ/Δ，得到的Y₁即为待测样本中丹皮酚的含量值。

1.3回收率及精密度实验

分别取10ml S₂、S₄和S₅各三份，分别加入8mg/L、12mg/L、16mg/L三个浓度的丹皮酚对照品溶液10mL，混合均匀后采集其多波长紫外混合光谱。采用空间夹角判据计算含量值，计算该方法的回收率和精密度。

2.结果与讨论 

2.1丹皮酚标准光谱库的建立

配制系列浓度为0.2～20mg/L的丹皮酚标准溶液，以75％乙醇为空白，采集系列溶液的190nm-1100nm波长范围光谱。选择200nm-400nm波长范围光谱，经多变量最小二乘回归后得到丹皮酚标准光谱y_i＝a_ix+b_i，记为V，其中在270nm处的线性方程、相关系数为：y＝0.0792x-0.0636；r＝0.9992。

2.2本底数据库的建立

对丹皮酚对照品溶液B₃和混合样本S₆的液相色谱图进行分析。如图1所示，A为丹皮酚的出峰时间，对应为16.3～17.5min。从S₆的光谱数据中扣除与丹皮酚具有相同保留时间的光谱数据(如图1中A峰数据)，其余数据(B峰数据)则作为测定丹皮酚含量的本底数据。依次从样品S₁-S₅的光谱数据中分别扣除16.3～17.5min时间段的光谱数据所对应的列后存入本底数据库中，记为M₁～M₅。合并M₁～M₆数据构成数据库M。

液相-光谱联用获取的初始本底光谱数据M数据量大，若直接采用，运算时间长，影响了方法的时效性，因此需要对获取的数据进行降维以去除数据中的噪声和冗余的维数，保留效性数据、并能够提高算法的处理速度。选用主成分分析的方法判断体系主成份为8，将M经奇异值分解，取降解后U矩阵的前8列，即为降维后的本地数据库N，具体为：应用[U，S，V]＝svd(W)对本底光谱数据库W进行奇异值分解降维，分解后得到m阶行正交矩阵U、n阶列正交矩阵V和奇异值矩阵S，取U的前q列，为降维后的本底数据库N。

2.3样品中丹皮酚的测定

对样品样本S1～S5的紫外混合光谱数据按空间夹角判据的算法步骤计算丹皮酚的含量。同时和高效液相色谱计算出的丹皮酚含量值进行比对。通 过计算，不同待测样本中的丹皮酚的含量及误差分析如表1所示。

表1 两种不同方法测定结果

由表1可以看出采用空间夹角判据计算结果和采用高效液相色谱计算结果相接近。相对误差小于1.80％，方法的准确度较好。

2.4方法回收率 

回收率结果见表2。由表2可看出样品回收率范围在97.33％-102.5％，相对误差小于5.00％，RSD值为1.5218％(n＝9)。从结果可以看出，用向量－子空间夹角判据计算出来的丹皮酚的含量与实际添加量相接近，表明该方法的准确度较好。

表2 回收率实验

3结论

本文通过液相-紫外可见光谱仪联用，应用子空间-夹角判据，建立了丹 皮酚含量快速分析方法。对于同类样品的测定，而且只需一次建模便可批量检测。与高效液相色谱法相比，所建立的方法稳定可靠、操作简便，样品不需要复杂的前处理，为丹皮酚含量快速测定提供了一种比较实用的定量分析技术，并可推广应用于其它丹皮酚制品检测领域。