一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法

摘要

本发明提供一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，包括如下步骤：转基因稻田和非转基因稻田布置和管理；稻田水层和淤泥中外源蛋白的测定，包括样本预处理和外源蛋白的抽提和测定；稻田水层中浮游生物的分离，包括水样采集、沉淀分离浮游生物；稻田水层中浮游生物种类和丰度的测定，包括活体鉴定和数量计数；转基因抗虫水稻的种植对浮游生物的安全性评价，利用分析软件对浮游生物种类、数量、发生时期进行统计分析，得出多样性指数、均匀性指数等参数，并和常规稻田进行比较，从而对转基因抗虫水稻水生环境安全性进行评价。本发明对于系统评估转基因抗虫水稻的水生环境安全性具有实际的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及转基因作物生态风险评价技术领域，具体涉及一种评价转基因 抗虫水稻水生环境安全性的方法。

背景技术

水稻是我国的主要农作物之一，通过转基因育种方法增强水稻自身的抗性 为病虫害防治提供了高效的解决途径。目前已经成功地培育出了一批具有高 产、抗病虫以及抗除草剂等性状的转基因水稻品种，其中一些转基因水稻品系 已经进入了环境释放试验等国家生物安全评价阶段，为我国的粮食安全保障提 供了技术储备。然而，转基因作物的种植可能会带来一系列的安全问题，因而 引起了全球的广泛关注和争论。由于水稻在我国的重要性，环保和农业等部门 对转基因水稻安全性的关注似乎超出任何一个其它转基因作物，有关转基因水 稻生态风险评价的研究受到了高度重视。

近年来，就一些转基因抗虫水稻品系的基因漂流、靶标害虫的抗性风险、 对非靶标生物和稻田节肢动物群落的影响以及毒蛋白在土壤中的残留等方面 已经取得了一些进展，为转基因水稻的安全性评价积累了一定的经验和技术。 以往的研究多数只限于考查转基因抗虫水稻对稻田节肢动物的影响，而很少对 稻田淡水生态系统中其它重要的类群——水生原生动物(鱼类的重要饵料)加 以关注。对于转基因水稻的大规模种植是否会对水体原生动物群落带来不利影 响，有多大的影响，目前这方面的研究报道和结果积累甚少。因此，在评价转 基因水稻环境安全的过程中，有必要补充和加强对水生环境安全影响的部分。

转基因作物对土壤生态系统的影响是近年来关注的一个焦点，因为土壤是 物质和能量循环的重要场所，外源蛋白最先进入土壤，理论上土壤生态系统最 可能受到潜在的负面影响。2000年，美国EPA(US Environmental Protection  Agency)将转基因作物对土壤生态系统的影响列为风险评价的重要组成部分， 转基因作物对土壤生态系统的影响是继转基因作物与近缘物种基因流、目标害 虫抗性问题和对非目标生物影响之后的又一个热点问题。一项新研究表明大面 积种植转基因玉米可能会对附近水生生态系统造成影响。该研究证明转基因玉 米的花粉及其他部分可以流入玉米地周围的沟渠中，并用试验揭示转基因玉米 的附产物可增加一种被称作石蛾的水生昆虫的死亡率，降低其增长率。

在我国的许多地方，稻田和鱼塘往往交织在一起，而且素有稻田养鱼、稻 鸭共生等传统生态种植模式，再加上水稻田的特殊灌溉方式，即从上游田到下 游田的串联灌溉。如果转基因水稻存在对水体生态系统存在类似转基因玉米的 安全性问题，则极易波及到下流的水田和鱼塘生态系统。因此，转基因水稻对 水田及下游水生生态系统是否有安全性问题更加值得注意。

中国专利CN104361251A中涉及转基因棉花对生物安全性评价的方法， 通过架设频振式杀虫灯诱集棉田昆虫的成虫；通过肉眼调查整株棉花上的体形 较大的节肢动物；采用吸虫器吸取棉花全株以及地面范围内的所有体形较小的 节肢动物；利用体式显微镜检验吸虫器收集回的节肢动物进行分类。没有涉及 对水生浮游动物安全性评价的内容。

中国专利CN104133054A提供了一种评价转基因棉花对大草蛉影响的生 物测定方法，用取食转基因棉花叶片1-3天的棉铃虫幼虫饲喂大草蛉幼虫；观 察大草蛉幼虫生长发育情况，从而评价转基因棉花对大草蛉的影响，该生物测 定方法适用广泛，对利用“转基因植物-害虫-捕食性天敌”营养关系评价转基因 植物中高剂量蛋白对捕食性天敌的影响都能够进行有效测定。

中国专利CN102986462A涉及一种利用双斑青步甲评价转Bt基因棉花抗 虫性的检测方法。该方法利用棉田生态系统中的食物链关系、即双斑青步甲- 棉铃虫-棉花，以捕食者种群的数量反映转Bt基因棉花对靶标生物-鳞翅目昆 虫(棉铃虫)的致死程度。在多年种植转Bt棉花棉田和对照棉花棉田内，利用 陷阱法和引诱剂法相结合诱捕双斑青步甲，比较两种棉花棉田内的双斑青步甲 数量。没有涉及对水生浮游动物安全性评价的内容。

中国专利CN102948399A涉及一种水生生物大型蚤的饲养方法。克服了 传统大型蚤毒理实验技术的缺陷，建立了一套纯稻米饲养大型蚤的方法，包括： 营养液配置，米粉溶液配置，幼蚤的饲养和收集。本发明使用纯稻米饲养大型 蚤，克服了常规方法中大型蚤选择性摄取绿藻等天然食物而不取食或很少取食 稻米的缺陷；且消除了因绿藻营养成分不确定而易影响实验结果的不利因素， 为评价转基因水稻安全性提供了可靠的实验保障。此方法只适用于转基因植物 环境安全室内评价。

中国专利CN102169117A涉及一种基于模糊数学和典范对应分析方法来 评价转基因植物种植对土壤微生态影响的技术体系及其应用。提供了一种综合 考虑土壤微生物与物理化学指标的评价方法，应用该方法可有效评价转基因作 物种植对土壤微生态系统带来的影响。没有涉及对水生浮游动物安全性评价的 内容。

从以上分析可以看出，对转基因抗虫水稻环境安全评价仅强调了对地上生 态系统的影响，对土壤生物以及水生生物的影响研究较少。理论上，转基因抗 虫水稻的毒蛋白可以通过根系的分泌进入土壤和水体，也可以通过水稻的碎屑 甚至是地上部分的残体进入土壤，从而对地下或水生微小生物和小型动物产生 影响。因此，亟需发明一种适用于对水生生物安全评价的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，通 过设计稻田布置、水层和淤泥中外源蛋白的测定、浮游生物的分离与测定等步 骤，可以系统地评估转基因抗虫水稻的水生环境安全性。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，包括如下过程：

(1)转基因稻田和非转基因稻田布置和管理；

(2)稻田水层和淤泥中外源蛋白的测定；

(3)稻田水层中浮游生物的分离；

(4)稻田水层中浮游生物种类和丰度的测定；

(5)转基因抗虫水稻的种植对浮游生物的安全性评价。

根据以上方案，所述转基因稻田和非转基因稻田布置和管理包括如下步 骤：

1)选择地势平整、水源方便的田块3至5块(即用于环境安全评价的3 至5次重复)，田块面积400-600m²，长宽比范围2∶1至1∶1，田周边及水源 无生活污水污染；

2)将步骤1)中的田块划分成小区，田块周围筑不透水田埂及硬化沟渠； 为防止暴雨漫灌，田块周边建立良好排水沟；

3)在步骤2)中的上游小区种植转基因抗虫水稻，下游小区种植非转基 因水稻，中间两块非转基因小区用上游转基因小区的田水灌溉，两侧的两块小 区直接用水源中的水灌溉；

4)从移栽至成熟期，不施用化学农药，人工除草，中期不晒田。

根据以上方案，所述田块划分成小区的具体方案为：靠近水源的上游小区 并列设置两块转基因小区，位于转基因小区下游的下游小区并列设置4块非轩 基因小区；所述两块转基因小区的上游与水源之间分别设立连通沟渠、下游分 别与中间的两块非转基因小区通过沟渠连通；所述非转基因小区的外侧两块分 别通过沟渠与所述水源连通；所述4块非轩基因小区分别设置排水沟渠。

根据以上方案，所述稻田水层和淤泥中外源蛋白的测定，包括样本的预处 理和外源蛋白的抽提与通过酶联免疫吸附法(ELISA法)测定，具体包括如下 步骤：

1)水样采集及预处理：水样采集小区包括所有转基因小区和非转基因小 区，用10ml离心管进行田间水样采集，各小区分别取5管，取上层清水，拿 回室内，将每份样品转到新的10ml离心管中，然后进行冷冻，冷冻后封上封 口膜，用针头在膜上扎空，然后放入冷冻干燥机进行浓缩至干；将干燥后的样 品放入4℃低温保存，24小时内待测；

2)淤泥样品采集及预处理：土样采集小区包括所有转基因小区和非转基 因小区，各拔5蔸水稻取根围淤泥，装入50ml离心管，带回室内放入-20℃冰 箱冷冻，然后放入冷冻干燥机进行浓缩至干，将干燥后的淤泥碾碎，过80目 筛除去根毛，准确称取每份样品0.5g，转入到1.5ml离心管中，放入4℃低温 保存，24小时内待测；

3)外源蛋白抽提缓冲液配制：100mM Na₂CO₃，100mM NaCl，5mM乙 二胺四乙酸，10mM二硫苏糖醇，50mM Na₄P₂O₇·10H₂O，1％(v/v)聚乙二醇 辛基苯基醚，pH值为10，即为抽提缓冲液；

4)外源蛋白的抽提与测定：分别将步骤1)与2)中的样品加入到外源蛋 白抽提缓冲液中进行抽提，再用酶联免疫吸附试剂(ELISA试剂)盒进行外源 蛋白的测定。

根据以上方案，所述稻田水层中浮游生物的分离，包括水样采集、游生物 的沉淀分离，具体包括如下步骤：

1)确定调查时间：调查时间分别选在水稻的分蘖期、拔节期、孕穗期、 开花期及乳熟期；

2)水样采集及浮游生物的沉淀分离：采用5点取样法对所有转基因小区 和非转基因小区分别选取5个点，每个点用带柄量杯采田水10L，装入桶后， 先用25目过滤漏勺滤去水稻凋落物和其它大块杂物，再用23#生物网过滤， 将过滤网内的剩余物移入1L浮游生物沉淀器，用水定容至1L，沉淀4小时； 将沉淀后的水样用虹吸方法将上层清液转至1L容量瓶，虹吸时，注意将虹吸 管的一端放在液面稍下一点，控制流速，缓缓虹吸，以防吸出沉淀器底部的颗 粒沉淀物，再次定容至1L，制成含浮游生物水样(转移后的水样清澈透，浮 游生物清晰可见)，待测。

根据以上方案，所述稻田水层中浮游生物种类和丰度的测定，具体包括如 下步骤：

1)确定调查的浮游生物种类：调查种类包括：原生动物类、轮虫类、枝 角类、桡足类、水生昆虫类；

2)原生动物类的计数：将含浮游生物水样充分摇匀，吸出0.1ml注入血细 胞计数框中，盖上盖玻片，在光学显微镜下进行全片计数，每份样品计数5片， 取平均值，然后按浓缩的倍数换算成1L水中的数量；

3)轮虫类、枝角类和桡足类的计数：将含浮游生物水样充分摇匀，用1ml 自制的无高刻度玻璃移液管吸取水样(微小水生动物定量计数管)，并用自制 的封口器封口，在40倍以下体视显微镜下进行全管计数，每份样品计数5片， 取平均值，然后按浓缩的倍数换算成1L水中的数量；

4)水生昆虫类：用肉眼直接计数。

根据以上方案，所述转基因抗虫水稻的种植对浮游生物的安全性评价的方 法为：应用统计分析方法比较转基因稻田和非转基稻因田外源蛋白浓度差异、 浮游生物种类和数量差异，统计浮游生物多样性指数、均匀性指数等参数，并 和常规稻田进行比较，最终根据统计分析结果综合分析转基因抗虫水稻的种植 对水生生物的安全性。

大量研究表明转基因外源蛋白可从转基因作物根系和凋落物种释放到环 境中，水稻田间需要保持水层，而测定转基因水稻外源蛋白在水层中的浓度和 扩散动态尚存在空白。本发明的每个试验单位设计成上游小区和下游小区，上 游种植转基因水稻，下游种植非转基因水稻，下游非转基因水稻分为两类，一 类用源头水直接灌溉，另一类用流经转基因水稻小区的水灌溉。如此设计可即 可测定转基因稻田水层和淤泥中的外源蛋白，也可测定外源蛋白是否可随灌溉 水向下游扩散。

测定植物组织中外源蛋白表达量的通用方法为ELISA法，该方法特异性 好，灵敏度高，测定灵敏度高低关键因素之一抽提缓冲液。常用的抽提缓冲液 配制方法为：取500ml锥形瓶分别加入：ddH₂O 400ml，NaCl 4g，Na₂HPO₄0.72g， KH₂PO₄0.12g，KCl 0.1g至pH值为7.4，加ddH₂O至500ml，然后平均分配到 两个250ml锥形瓶，分别加入1.125ml Tween20，即为抽提缓冲液。此种抽提 缓冲液适用于从植物组织中提取外源蛋白，对土壤和水体中外源蛋白的提取效 率低下。本发明设计的外源蛋白抽提缓冲液[100mM Na₂CO₃，100mM NaCl， 5mM乙二胺四乙酸，10mM二硫苏糖醇，50mM Na₄P₂O₇·10H₂O，1％(v/v) 聚乙二醇辛基苯基醚，pH值为10]，提取效率可达60％以上。水样中和淤泥 中外源蛋白含量极微，达不到ELISA试剂盒的检测下限，本发明设计的对外 源蛋白进行浓缩的方法，使ELISA试剂盒的检测下限降低到原来的百分之一。

水田中浮游动物个体小、种类多，对环境变化敏感，是评价转基因抗虫水 稻水生环境安全性的理想指示生物。水生生物学中对水体浮游动物的取样和定 量为较成熟的技术方法，但实践表明这些方法不适用于水田浮游动物研究，原 因有二，第一水田水层浅，第二水田水层中颗粒杂质多，按通用的方法无法对 水生动物进行鉴定和定量；另外，常规水生生物学对水生浮游动物定量方法较 复杂、用具和设备的成本高。本发明根据水田水层的特别设计了取水体的方法， 通过初步除去杂质、沉淀和虹吸等步骤分离水中浮游动物，再用定制的移液管 在体视显微镜下进行种类鉴定和定量，方法简便成本低廉。

本发明的有益效果是：

1)本发明的田间设计方法适用于监测转基因抗虫水稻向环境释放的外源 蛋白的浓度、监测外源蛋白随水流扩散的范围；

2)本发明对外源蛋白抽提缓冲液进行了改进，配合样品中外源蛋白的浓 缩技术，可使ELISA试剂盒的检测精度提高100倍；

3)本发明设计了水田中微小浮游动物计数和定量方法，适用于水田水层 浅和颗粒杂质多的特点，自制的微小水生动物定量计数管，大大简化了微小水 生动物定量中的试剂和用具，降低了成本。

附图说明

图1是本发明的田块划分示意图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明的技术方案进行说明。

本发明提供一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，包括如下过 程：

(1)转基因稻田和非转基因稻田布置和管理，包括如下步骤：

1)选择地势平整、水源方便的田块5块(用于环境安全的重复评价)，田 块面积400-600m²，长宽比范围2∶1至1∶1，田周边及水源无生活污水污染；

2)将步骤1)中的田块划分成小区，田块周围筑不透水田埂及硬化沟渠； 为防止暴雨漫灌，田块周边建立良好排水沟；所述田块划分成小区的具体方案 为：靠近水源的上游小区并列设置两块转基因小区，位于转基因小区下游的下 游小区并列设置4块非轩基因小区；所述两块转基因小区的上游与水源之间分 别设立连通沟渠、下游分别与中间的两块非转基因小区通过沟渠连通；所述非 转基因小区的外侧两块分别通过沟渠与所述水源连通；所述4块非轩基因小区 分别设置排水沟渠(见附图1)；

3)在步骤2)中的上游小区种植转基因抗虫水稻，下游小区种植非转基 因水稻，中间两块非转基因小区用上游转基因小区的田水灌溉，两侧的两块小 区直接用水源中的水灌溉；

4)从移栽至成熟期，不施用化学农药，人工除草，中期不晒田；

(2)稻田水层和淤泥中外源蛋白的测定，包括样本的预处理和外源蛋白 的抽提与通过ELISA法测定，具体包括如下步骤：

1)水样采集及预处理：水样采集小区包括所有转基因小区和非转基因小 区，用10ml离心管进行田间水样采集，各小区分别取5管，取上层清水，拿 回室内，将每份样品转到新的10ml离心管中，然后进行冷冻，冷冻后封上封 口膜，用针头在膜上扎空，然后放入冷冻干燥机进行浓缩至干；将干燥后的样 品放入4℃低温保存，待测；

2)淤泥样品采集及预处理：土样采集小区包括所有转基因小区和非转基 因小区，各拔5蔸水稻取根围淤泥，装入50ml离心管，带回室内放入-20℃冰 箱冷冻，然后放入冷冻干燥机进行浓缩至干，将干燥后的淤泥碾碎，过80目 筛除去根毛，准确称取每份样品0.5g，转入到1.5ml离心管中，放入4℃低温 保存，待测；

3)外源蛋白抽提缓冲液配制：100mM Na₂CO₃，100mM NaCl，5mM乙 二胺四乙酸，10mM二硫苏糖醇，50mM Na₄P₂O₇·10H₂O，1％(v/v)聚乙二 醇辛基苯基醚，pH值为10；

4)外源蛋白的抽提与测定：分别将步骤1)与2)中的样品加入到外源蛋 白抽提缓冲液中进行抽提，再用ELISA试剂盒进行外源蛋白的测定；

(3)稻田水层中浮游生物的分离，包括水样采集、游生物的沉淀分离， 具体包括如下步骤：

1)确定调查时间：调查时间分别选在水稻的分蘖期、拔节期、孕穗期、 开花期及乳熟期；

2)水样采集及浮游生物的沉淀分离：采用5点取样法对所有转基因小区 和非转基因小区分别选取5个点，每个点用带柄量杯采田水10L，装入桶后， 先用25目过滤漏勺滤去水稻凋落物和其它大块杂物，再用23#生物网过滤， 将过滤网内的剩余物移入1L浮游生物沉淀器，用水定容至1L，沉淀4小时； 将沉淀后的水样用虹吸方法将上层清液转至1L容量瓶，虹吸时，注意将虹吸 管的一端放在液面稍下一点，控制流速，缓缓虹吸，以防吸出沉淀器底部的颗 粒沉淀物，再次定容至1L，制成含浮游生物水样(转移后的水样清澈透，浮 游生物清晰可见)，待测；

(4)稻田水层中浮游生物种类和丰度的测定，具体包括如下步骤：

1)确定调查的浮游生物种类：调查种类包括：原生动物类、轮虫类、枝 角类、桡足类、水生昆虫类；

2)原生动物类的计数：将含浮游生物水样充分摇匀，吸出0.1ml注入血细 胞计数框中，盖上盖玻片，在光学显微镜下进行全片计数，每份样品计数5片， 取平均值，然后按浓缩的倍数换算成1L水中的数量；

3)轮虫类、枝角类和桡足类的计数：将含浮游生物水样充分摇匀，用1ml 自制的无高刻度玻璃移液管吸取水样，并用自制的封口器封口，在40倍以下 体视显微镜下进行全管计数，每份样品计数5片，取平均值，然后按浓缩的倍 数换算成1L水中的数量；

4)水生昆虫用肉眼直接计数；

(5)转基因抗虫水稻的种植对浮游生物的安全性评价：应用统计分析方 法比较转基因稻田和非转基稻因田外源蛋白浓度差异、浮游生物种类和数量差 异，统计浮游生物多样性指数、均匀性指数等参数，并和常规稻田进行比较， 最终根据统计分析结果综合分析转基因抗虫水稻的种植对水生生物的安全性。

(6)具体的评价结果：

以转cry1Ab/1Ac和cry2A基因的2个明恢63水稻为材料，在常规田间管 理模式下评价了Bt稻对水生浮游动物的安全性。对Bt和非Bt稻田水层中的 轮虫、枝角和桡足3类浮游动物进行了2次多样性和丰度调查，第一次调查显 示Bt田中发现21个浮游动物物种，而在非Bt田中仅鉴定了4种，第二次在 Bt田中鉴定到24个浮游动物物种，而非Bt田中鉴定了16种；在两次调查中 浮游动物丰度在Bt田和非Bt田之间均出现了极显著差异，非Bt田中的丰度 分别比Bt田中的丰度少95％和80％。

表1 转基因和非转基因水稻小区浮游动物种类与丰度调查结果

以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本 发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修 改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖 在本发明的权利要求范围内。