一种人源碱性成纤维细胞生长因子、烟草叶绿体表达载体及生产方法

摘要

本发明公开了一种人源碱性成纤维细胞生长因子，该基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了一种用于生产人源碱性成纤维细胞生长因子的烟草叶绿体表达载体，命名为pWX-Nt03；本发明还公开了一种携带并可扩增上述载体的宿主细胞Mach1；本发明还公开一种利用烟草叶绿体作为生物反应器生产人源碱性成纤维细胞生长的方法；利用叶绿体表达bFGF能够较传统的动物血液中分离提取法和现行生物工程制药中的微生物发酵法不仅大幅度降低成本，且由于植物中往往不含有或极少含有能够导致人及动物过敏反应的热源蛋白，因此，相对利用微生物生产bFGF具有更好的临床应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种人源碱性成纤维细胞生长 因子，本发明还涉及一种用于生产人源碱性成纤维细胞生长因子的烟草叶绿 体表达载体，本发明还涉及一种携带扩增上述的载体的宿主细胞，本发明还 涉及一种利用烟草叶绿体作为生物反应器生产人源碱性成纤维细胞生长因 子的方法。

背景技术

碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)是FGFs 家族中的一员，最初是由牛脑垂体和脑组织提取物中分离得到的一个肝素结 合多肽，其等电点为9.6，因为能促进成纤维细胞的分裂增殖而得名。bFGF 广泛分布于中胚层和神经外胚层来源的多种组织和器官，也存在于肿瘤组织 中，它具有促进细胞增殖、分化、迁移等多种生物学效应，并参与血管重塑、 骨骼形成、神经发育、肿瘤代谢等生理和病理过程。

bFGF作为内源性微量活性物质，在动物组织中含量极微，因此要作为 一种产品广泛应用于临床，仅依靠传统的组织提取方法是远远不够的，有必 要应用基因工程手段生产。自1986年Abraham等首次克隆了bFGF的cDNA以 来，bFGF基因的克隆和表达研究取得了重大的进展，在体内和体外均表现 出广泛的生物学活性。实验证明，人工重组的bFGF和天然的bFGF有着同样 的生物功能。最近几年随着生物工程技术的发展，已能大批量生产重组人 bFGF，并在临床上用于治疗某些疾病，诸如：退行性神经系统疾病、脑缺 血疾病、冠心病、烧创伤等。

由于叶绿体表达系统具有高效表达外源基因的特点，且其测算的生产成 本较传统的微生物发酵工艺更低廉，因而成为理想的生物反应器平台。此外， 叶绿体基因工程生产的大多数蛋白质可完成二硫键交联、正确折叠等转录后 修饰，具有正确的空间构象和生物活性，为商业化生产医用蛋白奠定了理论 基础。Staub等将人源的生长素基因导入烟草叶绿体基因组中,转基因烟草表 达出的人源生长素比核表达系统高300倍,而且具有正常的生物学活性。2004 年，Daniell等将胰岛素生长因子IGF21基因转入烟草叶绿体中，得到成熟 的IGF21，表达量占可溶蛋白的32％，更重要的是，在叶绿体中表达的IGF21 可以形成正确的二硫键，而在大肠杆菌中则不能形成。

发明内容

本发明的目的是提供一种人源碱性成纤维细胞生长因子基因，该基因序 列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一目的是提供一种用于生产人源碱性成纤维细胞生长因子 的烟草叶绿体表达载体。

本发明目的通过下述技术方案实现：一种用于生产人源碱性成纤维细胞 生长因子的烟草叶绿体表达载体，该载体表达框两侧序列分别为克隆自烟草 叶绿体基因组中的部分16S核糖体RNA基因与异亮氨酸转移RNA基因构成 的16S-trnI片段和丙氨酸转移RNA基因与部分23S核糖体RNA基因构成 的trnA-23S片段；在靠近trnA-23S片段的是上述的目的基因bFGF基因， 其由叶绿体特异性融合启动子PrrnPclpPrbcL驱动，并由烟草叶绿体终止子 TpsbA终止的表达框；而靠近16S-trnI片段的分别是作为报告基因的绿色荧 光蛋白基因GFP和作为筛选标记基因的壮观霉素抗性基因aadA，依次位于 烟草叶绿体启动子Prrn与烟草叶绿体终止子Trps16之间，构成多顺反子的 表达框；命名为pWX-Nt03。

本发明的第三目的是提供一种上述的载体的宿主细胞，该宿主细胞命名 为Mach1。

本发明的第四目的是提供一种利用烟草叶绿体作为生物反应器生产人 源碱性成纤维细胞生长因子的方法，解决了现有技术中存在的生产成本高、 无法正确折叠、生物活性低的问题。

本发明目的通过下述技术方案实现：一种利用烟草叶绿体作为生物反应 器生产人源碱性成纤维细胞生长因子的方法，包括以下步骤：

1)、构建烟草叶绿体表达载体pWX-Nt03；

2)、bFGF基因的叶绿体转化及同质化筛选，得到烟草叶绿体转bFGF 基因的同质化植株；

3)、叶绿体转基因烟草植株中bFGF表达量分析；

4)、纯化重组人源碱性成纤维细胞生长因子，得到烟草叶绿体表达的碱 性成纤维细胞生长因子。

在上述技术方案中，步骤1中构建烟草叶绿体表达载体pWX-Nt03具体 为：

1.1)、在保持氨基酸序列不发生改变的前提下，利用Gene Designer将编 码基因的所有密码子采用烟草叶绿体密码子最适编码方式进行密码子替换， 对经修饰后的基因序列再通过DNAMAN7.0和VectorNTI 10.0软件分析其中 的酶切位点信息，将第35位氨基酸Ile的编码密码子由第1最适密码子TAT， 变更为第2最适密码子TAC以消除EcoR I酶切位点；将第104位氨基酸 Tyr的编码密码子由第1最适密码子TCT，变更为第2最适密码子TCA以消 除Psi I酶切位点；将第109位氨基酸Ser的编码密码子由第1最适密码子 ATT，变更为第2最适密码子ATA以消除Xba I和Bgl II酶切位点；优化 后的人源碱性成纤维细胞生长因子基因序列见SEQ ID NO.1所示；

1.2)、构建烟草叶绿体表达载体pWX-Nt03，经密码子优化后的人源碱 性成纤维细胞生长因子基因bFGF，由叶绿体特异性融合启动子 PrrnPclpPrbcL驱动，并由烟草叶绿体终止子TpsbA终止，构成目的基因表 达框。作为报告基因的绿色荧光蛋白基因GFP和作为筛选标记基因的壮观 霉素抗性基因aadA依次位于烟草叶绿体启动子Prrn与烟草叶绿体终止子 Trps16之间，构成筛选标记表达框；上述两个表达框化学合成后，通过酶切 连接导入来自烟草叶绿体基因组中的部分16S核糖体RNA基因与异亮氨酸 转移RNA基因构成的16S-trnI片段和丙氨酸转移RNA基因与部分23S核糖 体RNA基因构成的trnA-23S片段两段同源片段之间，最终获得用于生产人 源碱性成纤维细胞生长因子的烟草叶绿体表达载体，命名为pWX-Nt03。

步骤2中bFGF基因的叶绿体转化及同质化筛选具体为：

1)用PDS 1000/He基因枪进行叶绿体转化：金粉颗粒直径为0.6μm， 轰击距离为9cm，可裂膜采用1100psi，金粉微弹按每毫克金粉用0.2μg质粒 DNA包裹；

2)筛选：第一轮筛选：轰击过的叶片背面朝上在恢复养基上25℃暗培 养3天；暗培养后，将叶片切成5mm×5mm的小块，背面朝下放在筛选培养基 Ⅰ上，以16小时光照、8小时黑暗的光周期25℃培养，每20天更新一次培养 基。产生不定芽后，用365nm紫外灯检测，将产生绿色荧光的不定芽剪下， 置于生根培养基Ⅱ上；PCR检测选择性标记基因GFP、aadA以及目的基因 bFGF，其中，培养基Ⅰ具体为4.3g/L MS盐、30g/L蔗糖、2mg/L 6-BA、0.1mg/L  NAA、500mg/L壮观霉素和8g/L琼脂，pH5.8；生根培养基Ⅱ具体为：4.3g/L MS 盐、30g/L蔗糖、500mg/L壮观霉素和8g/L琼脂，pH5.8。

第二至多轮筛选：选取转基因植株中绿色荧光较强的植株，将其叶片切 成5mm×5mm的小块，背面朝下放在筛选培养基按照与第一轮相同条件重复 筛选，期间通过在PCR方式进行烟草转基因植株同质化进程的检测，重复 此筛选过程直至获得同质化的不定芽，将获得的同质化的不定芽在生根培养 基Ⅱ上生根、移栽，即获得同质化的叶绿体转基因植株。

步骤2中叶绿体转基因烟草植株的同质化检测具体为：高盐低PH值法 提取叶绿体DNA，其引物为：引物P1：5'-GGTCGGAACAAGTTGATAG-3'， 碱基序列如SEQ ID NO.2所示；引物P2： 5'-CAGTAGAGTCTTTCAGTGGC-3'，碱基序列如SEQ ID NO.3所示；PCR 程序为：95℃预变性5min；95℃变性20sec，56℃退火20sec，72℃延伸2 min，30个循环；72℃后延伸5min；取4μg叶绿体DNA用BamHI和KpnI 酶切，0.8％琼脂糖凝胶80V电泳3个小时后转移到硝酸纤维素膜上，紫外交 联两次，每次30秒，间隔2分钟；按照Roche公司试剂盒提供的方法进行 Southern杂交分析，探针为烟草叶绿体上trnI-trnA区段BamHI和KpnI内切 酶之间约1.4kb的PCR产物。

步骤4中叶绿体转基因烟草植株中bFGF表达量分析具体为：将野生型 烟草和同质化的叶绿体转基因烟草植株的叶片剪下，在液氮中研磨成粉末， 按1：2(W/V)比例加入PBS缓冲液，其中，PBS缓冲液为137mmol/L NaCl， 2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na₂HPO₄，2mmol/L KH₂PO₄，冰浴至完全融化； 涡旋30sec；在4℃条件下15000g离心20min，取上清即为总可溶性蛋白；

取10μL蛋白溶液与等量2×上样缓冲液混合，沸水温浴5min，然后进 行16.5％Tricine-SDS–PAGE电泳检测，并用考马斯亮蓝R250染色，将相同 条件下电泳后未进行考马斯亮蓝R250染色的凝胶，在200mA恒定电流条 件下通过半干转膜仪转印到0.2μm的尼龙膜上，用TBST缓冲液洗涤6次， 每次5min，其中，TBST缓冲液为20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl， 0.05％Tween 20；加入封闭液100mL，37℃封闭2h，其中，封闭液为5％脱 脂奶粉/TBST缓冲液；倒掉封闭液，按上述方法洗涤后加入100mL用封闭 液稀释的一抗鼠抗bFGF工作液，37℃包被1h；倒掉一抗工作液，如前述方 法洗涤，加入100mL用封闭液稀释的二抗碱性磷酸酶标记的羊抗鼠，包被 1h；倒掉二抗工作液，如前法洗涤，加入10mL显色剂BCIP/NBT，室温暗 光反应直至出现预期杂交信号后，用50ml双蒸水或TE缓冲液洗膜5min， 以终止反应。

步骤5中重组人源碱性成纤维细胞生长因子的纯化得到烟草叶绿体转 bFGF基因的同质化植株具体为：将总可溶性蛋白经0.22μm滤膜抽滤后，置 于截流分子量为30KD的超滤离心管中，4000g离心15min，取流出液再置 于截流分子量为10KD的超滤离心管中5000g离心60min后，截留部分液 体即为重组人源碱性成纤维细胞生长因子的初步纯化产物，即为烟草叶绿体 表达的碱性成纤维细胞生长因子。

本发明的有益效果是：利用叶绿体表达bFGF能够较传统的动物血液中 分离提取法和现行生物工程制药中的微生物发酵法不仅大幅度降低成本，且 由于植物中往往不含有或极少含有能够导致人及动物过敏反应的热源蛋白， 因此，相对利用微生物生产bFGF具有更好的临床应用前景。

附图说明

图1是烟草叶绿体表达载体pWX-Nt03的结构图；

图2是烟草叶绿体转化与筛选过程；

图3是烟草叶绿体转基因植株的PCR检查结果，其中，M：核酸分子 量标准；野生型烟草植株；1-4：经多轮筛选后的不同叶绿体转bFGF基因烟 草植株个体；

图4是烟草叶绿体转基因植株的Southern杂交结果，其中，M：核酸分 子量标准；野生型烟草植株；1-4：经多轮筛选后的不同叶绿体转bFGF基因 烟草植株个体；

图5是烟草叶绿体转基因植株的Western检测结果，其中，M：蛋白分 子量标准；P：商业化的bFGF标准品；wt：野生型烟草植株；1-4：经多轮 筛选后的不同叶绿体转bFGF基因烟草植株个体。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

实施例1：烟草叶绿体表达载体pWX-Nt03的构建

1)利用现代生物信息学技术对NCBI数据库中的人源碱性成纤维细胞生 长因子基因(GenBank:E05632.1)的核苷酸序列进行优化设计。在保持氨基 酸序列不发生改变的前提下，利用Gene Designer将编码基因的所有密码子采 用烟草叶绿体密码子最适编码方式进行密码子替换，对经修饰后的基因序列 再通过DNAMAN7.0和VectorNTI 10.0软件分析其中的酶切位点信息，将第35 位氨基酸Ile的编码密码子由第1最适密码子TAT，变更为第2最适密码子TAC 以消除EcoR I酶切位点；将第104位氨基酸Tyr的编码密码子由第1最适密码 子TCT，变更为第2最适密码子TCA以消除Psi I酶切位点；将第109位氨基 酸Ser的编码密码子由第1最适密码子ATT，变更为第2最适密码子ATA以消除 Xba I和Bgl II酶切位点。优化后的人源碱性成纤维细胞生长因子基因序列 见SEQ ID NO.1所示。

2)利用化学合成法全基因合成表达框。表达框包含以下两部分：首先 是经密码子优化后的人源碱性成纤维细胞生长因子基因bFGF，由叶绿体特 异性融合启动子PrrnPclpPrbcL驱动，并由烟草叶绿体终止子TpsbA终止，构 成目的基因表达框。其次是作为报告基因的绿色荧光蛋白基因(GFP)和作 为筛选标记基因的壮观霉素抗性基因(aadA)依次位于烟草叶绿体启动子 Prrn(含核糖体结合位点T7g10序列)与烟草叶绿体终止子Trps16之间，构成 筛选标记表达框。该表达框中除人工设计的bFGF基因外，其他基因的序列 信息均来自NCBI。

3)人工合成的表达框利用Psi I进行酶切消化处理后产生的片段与相同 酶处理的携带克隆烟草叶绿体基因组中“16S核糖体RNA基因至23S核糖体 RNA基因”的大片段的克隆载体pWX-Nt进行连接反应，使人工合成的表达 框插入“部分16S核糖体RNA基因与异亮氨酸转移RNA基因构成的16S-trnI 片段”和“丙氨酸转移RNA基因与部分23S核糖体RNA基因构成的trnA-23S 片段”两段同源片段之间，最终获得用于生产人源碱性成纤维细胞生长因子 的烟草叶绿体表达载体，命名为pWX-Nt03(如图1所示)。

实施例2：bFGF基因的叶绿体转化及同质化筛选

bFGF基因的叶绿体转化按照Daniell的方法操作并略作修改。用PDS 1000/He基因枪(美国Bio-Rad公司)进行：金粉颗粒直径为0.6μm，轰击距离 为9cm，可裂膜采用1100psi，金粉微弹按每毫克金粉用0.2μg质粒DNA包裹。

第一轮筛选：轰击过的叶片背面朝上在恢复养基上25℃暗培养3天。暗 培养后，将叶片切成5mm×5mm的小块，背面朝下放在筛选培养基(4.3g/L MS 盐、30g/L蔗糖、2mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA、500mg/L壮观霉素和8g/L琼脂， pH5.8)上，以16小时光照、8小时黑暗的光周期25℃培养，每20天更新一次 培养基。产生不定芽后，用365nm紫外灯检测，将产生绿色荧光的不定芽剪 下，置于生根培养基(4.3g/L MS盐、30g/L蔗糖、500mg/L壮观霉素和8g/L 琼脂，pH5.8)上。PCR检测选择性标记基因GFP、aadA以及目的基因bFGF。

第二至多轮筛选：选取转基因植株中绿色荧光较强的植株，将其叶片切 成5mm×5mm的小块，背面朝下放在筛选培养基按照与第一轮相同条件重复 筛选，期间通过在PCR及southern杂交等方式进行烟草转基因植株同质化进 程的检测(分子检测详见实施例3)，重复此筛选过程直至获得同质化的不定 芽，将获得的同质化的不定芽在生根培养基(4.3g/L MS盐、30g/L蔗糖、 500mg/L壮观霉素和8g/L琼脂，pH5.8)上生根、移栽，即获得同质化的叶绿 体转基因植株，具体转化及筛选过程详见图2。

实施例3：叶绿体转基因烟草植株的同质化检测

利用分子生物学常规的CTAB提取野生型烟草和叶绿体转化烟草植株总 DNA，用于PCR和Southern杂交分析。引物P1： 5'-GGTCGGAACAAGTTGATAG-3'和P2： 5'-CAGTAGAGTCTTTCAGTGGC-3'在烟草叶绿体基因组上的位置见图1所 示。PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性20sec，56℃退火20sec，72℃ 延伸2min，30个循环；72℃后延伸5min。取4μg叶绿体DNA用BamHI和KpnI 酶切，0.8％琼脂糖凝胶80V电泳3个小时后转移到硝酸纤维素膜上，紫外交联 两次，每次30秒，间隔2分钟。按照Roche公司试剂盒提供的方法进行Southern 杂交分析，探针为烟草叶绿体上trnI-trnA区段BamHI和KpnI内切酶之间约 1.4kb的PCR产物。

含有bFGF基因的叶绿体表达框位于克隆自烟草叶绿体上同源片段的 BamHI和KpnI内切酶之间，因此使得BamHI和KpnI内切酶之间的物理距离由 原来的2.4kb增加至5.2kb，而用于PCR检测的引物之间的距离由原来的1.4kb 增加至4.2kb。由图3和图4中可以看到，样品2和样品3中不仅有插入表达框后 的转化型条带，还有与野生型大小一致的条带，表明其叶绿体DNA分子同时 存在野生型和转化型两种状态，称之为杂合状态。处于杂合状态的植物，在 今后的种植过程中，由于没有了筛选压力，会出现转化型叶绿体DNA分子逐 步丢失的现象，因此将其淘汰，而选择处于纯合状态的样品1和样品4所代表 的植株作为进一步表达人源bFGF的转基因材料，保存种质资源。

实施例4：叶绿体转基因烟草植株中bFGF表达量分析

将野生型烟草和同质化的叶绿体转基因烟草植株的叶片剪下，在液氮中 研磨成粉末，按1：2(W/V)比例加入PBS缓冲液(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L  KCl，10mmol/L Na₂HPO₄，2mmol/L KH₂PO₄)，冰浴至完全融化。涡旋30sec； 在4℃条件下15000g离心20min，取上清即为总可溶性蛋白。

取10μL蛋白溶液与等量2×上样缓冲液混合，沸水温浴5min，然后进行 16.5％Tricine-SDS–PAGE电泳检测，并用考马斯亮蓝R250染色。将相同条件 下电泳后未进行考马斯亮蓝R250染色的凝胶，在200mA恒定电流条件下通 过半干转膜仪转印到0.2μm的尼龙膜上，用TBST缓冲液(20mmol/L  Tris-HCl，150mmol/L NaCl，0.05％Tween 20)洗涤6次，每次5min；加入 封闭液(5％脱脂奶粉/TBST缓冲液)100mL，37℃封闭2h；倒掉封闭液， 按上述方法洗涤后加入100mL用封闭液稀释的一抗(鼠抗bFGF)工作液， 37℃包被1h；倒掉一抗工作液，如前述方法洗涤，加入100mL用封闭液稀释 的二抗(碱性磷酸酶标记的羊抗鼠)，包被1h；倒掉二抗工作液，如前法洗 涤，加入10mL显色剂BCIP/NBT，室温暗光反应直至出现预期杂交信号后， 用50ml双蒸水或TE缓冲液洗膜5min，以终止反应。

结果如图4所示，同质化和非同质化的烟草叶绿体转基因植株均在17kD 处检测到与商业化的人源碱性成纤维细胞生长因子相同的杂交信号，而非转 基因植株总蛋白中无此条带。经Image-Pro Plus分析结果表明，同质化的烟草 叶绿体转基因植株4的表达量最高为18.36ng/g*FW，约占可溶性总蛋白的 0.106％。

实施例5：重组人源碱性成纤维细胞生长因子的纯化

将总可溶性蛋白经0.22μm滤膜抽滤后，置于截流分子量为30KD的超 滤离心管中，4000g离心15min，取流出液再置于截流分子量为10KD的超 滤离心管中5000g离心60min后，截留部分液体即为重组人源碱性成纤维细胞 生长因子的初步纯化产物。ELISA检测结果表明，其中重组人源碱性成纤维 细胞生长因子的纯度达到60％以上，纯化过程中目的蛋白的损失率小于20％。 再将经初步纯化的蛋白用肝素-Sepharose亲和层析柱进行纯化，获得纯度为 99.5％的重组人源碱性成纤维细胞生长因子蛋白，纯化过程中目的蛋白的损 失率小于30％。

实施例6：烟草叶绿体表达的重组人源碱性成纤维细胞生长因子的细胞活性 分析

胰酶消化处理处于对数增殖期的Balb/c 3T3细胞并制备成细胞悬液，接 种于96孔板内，37℃，5％浓度的CO₂培养12h后，加入终浓度为100ng/mL的 烟草叶绿体表达的bFGF稀释液，该稀释液用无血清DMEM培养基稀释，设 置相同稀释浓度的bFGF商业化标准品作为对照，继续培养48h，用MTT法检 测烟草叶绿体表达的bFGF刺激3T3细胞增殖的生物活性。结果如表1所示， 相同浓度的条件下，叶绿体表达的bFGF较商业化标准品对细胞增殖的生物 活性更强。

表1叶绿体表达的bFGF促3T3细胞增殖作用(MTT法)A₅₇₀值

注：P＜0.05