一种从海洋微藻中生产DHA乙酯的方法

摘要

本发明涉及微生物应用技术领域，公开了一种从海洋微藻中生产DHA乙酯的方法：S1.收集发酵后的海洋微藻湿菌体，用酒精浸泡脱水，使得海洋微藻菌体的水分含量小于5%；S2.添加无水乙醇和催化剂并渗入脱水后的菌体内，在菌体内进行转酯化反应，提取、纯化、分离获得DHA乙酯；采用酒精对鲜湿的藻细胞脱水，使藻细胞干燥，避免遭受高温氧化，乙醇在干燥菌体的过程中，渗透入细胞内，在藻细胞内发生转酯化反应，使反应物处在微米尺度的分散水平，从而增加了反应的接触面积，避免采用细胞破碎的复杂工艺；工艺还把脂肪酸甘油酯的渗出改变为脂肪酸乙酯的渗出，从而提高了渗出的能力。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，更具体地，涉及一种从海洋微藻中生产DHA乙酯的方法。

背景技术

DHA（Docosahexaenoic acid）是二十二碳六烯酸，为n-3系多不饱和脂肪酸，含有6个不饱和键。DHA是人脑神经细胞膜中主要的脂质成分，也是大脑细胞优先吸收利用的脂肪酸成分。胎儿自身不能合成DHA，必须从母体中获得。胎儿DHA不足，可导致脑细胞生长与发育不正常，严重缺乏DHA可能导致胎儿无法正常进行中枢神经系统控制的代谢。DHA除了可提高膜的生理机能，还对维持脑的功能，调节人体血脂和脂蛋白的正常代谢，防止心血管疾病发生起到作用，DHA能明显抑制肿瘤的发生、生长和转移速度，降低致炎因子的活性对治疗风湿性关节炎、牛皮癣、哮喘、溃疡性结肠炎、偏头痛及多发性硬化等也有疗效；DHA在保健食品市场中也有广泛的应用，一些添加DHA的乳制品、饮料、糖果等已在市场出现，特别是婴幼儿配方食品受到市场欢迎。

在医药用途中，需要更高DHA含量的油脂，甚至要用纯的DHA油脂，这时需要通过转酯化生产DHA低级醇酯。其中，DHA乙酯可以直接应用于医药。DHA乙酯还可以进一步与DHA含量不高的甘油酯通过转酯化反应提高DHA的含量。因此，生产DHA乙酯也是市场的需要。

藻油相对于鱼油有诸多优点，所以现在已经有相当大市场份额的DHA油脂来自藻油。DHA藻油一般是通过培养裂殖壶菌或破囊壶菌等海洋微藻，然后从中提取油脂来生产的。藻油的生产工艺过程一般是通过异养培养或自养培养生产出藻细胞，通过离心生产出藻细胞浓浆，然后采用喷雾干燥的方法脱水得到干燥的藻细胞。或者在干燥前，采用酶法、高压均质或酶法与高压均质结合的工艺先破碎细胞，再喷雾干燥。在得到干燥的藻细胞后，用正己烷或石油醚等非极性有机溶剂萃取藻细胞中油脂，从而得到粗藻油，然后再按照传统的油脂精炼工艺净化藻油，得到精炼的藻油。这样的工艺由于采用了喷雾干燥，使藻细胞中的藻油特别容易氧化变质，这是传统工艺从海洋微藻中生产DHA乙酯的一个重要缺点。

另外，在藻油生产工艺中，从藻细胞内把油脂提取出来是工艺中一个重要的环节。海洋微藻，如裂殖壶菌细胞壁坚韧，细胞破碎很困难，而DHA是以甘油酯形式为主存在，其次是磷脂的形式。无论是甘油酯还是磷脂都难以透过正常的细胞膜和细胞壁。甚至即使细胞破碎后，这些脂质也不容易从细胞中分离。这是传统工艺从海洋微藻中生产DHA乙酯的另一个重要缺点。

最后，传统工艺中油脂的转乙酯化是将油脂、乙醇和催化剂通过激烈混合分散，形成由醇、油、催化剂组成的细微颗粒来增加反应物的接触面积，分散成微颗粒需要很大的机械动力，造成能耗非常大，这是传统工艺从海洋微藻中生产DHA乙酯的第三个重要缺点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有传统从海洋微藻中生产DHA乙酯所存在的上述缺陷，提供一种从海洋微藻中生产DHA乙酯的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

   一种从海洋微藻中生产DHA乙酯的方法，包括以下步骤：

S1. 收集发酵后的海洋微藻湿菌体，用酒精浸泡脱水，使得海洋微藻菌体的水分含量小于5%；

S2. 添加无水乙醇和催化剂并渗入脱水后的菌体内，在菌体内进行转酯化反应，提取、纯化、分离获得DHA乙酯。

在DHA的生产和应用过程中，氧化和异腥味是两大难题，这已成为其在食品中广泛应用的瓶颈。DHA 分子中含有6个碳碳双键，对氧气、光和热敏感，极易氧化。DHA 的氧化首先造成其含量降低，功效下降；其次，氧化产物有害健康，摄入体内会引起脂质过氧化，诱发各种生理异常而引发疾病。DHA氧化还会产生异腥味，多不饱和脂肪酸氧化的最终产物是各种具有挥发性的低级醛、酮，这些物质使食品出现鱼腥味、油漆味、青草味以及金属味等异味。

传统DHA制备过程中采用的喷雾干燥容易使得DHA氧化，海洋微藻，如裂殖壶菌具有很坚韧的细胞壁，油脂提取很困难，油脂提取后要靠充分乳化分散才能与乙醇反应实现转酯化生产出DHA乙酯。

本发明的工艺是基于通过酒精脱水来使藻细胞干燥从而避免遭受高温氧化的过程，乙醇在干燥菌体的过程中已经渗透入细胞内，采用在藻细胞内发生转酯化反应，避免细胞破碎，而且使反应物处在几微米或微米以下尺度的分散水平，从而增加了反应的接触面积；工艺还把脂肪酸甘油酯的渗出改变为脂肪酸乙酯的渗出，从而提高了渗出的能力。

实际上，本发明是对从海洋微藻中提取DHA乙酯工艺流程的改进，不同的海洋微藻都适用于本发明所述工艺，优选地，本发明所述海洋微藻为裂殖壶菌或破囊壶菌。

若选用裂殖壶菌，本发明所述DHA乙酯生产的工艺流程如下：

裂殖壶菌—→发酵—→离心或过滤收获菌细胞—→细胞泥—→酒精脱水—→在细胞内进行转酯化反应—→溶剂浸提法提取脂肪酸乙酯—→纯化—→分离—→DHA乙酯。

本发明所述裂殖壶菌用生产常用的培养基（一般是5%葡萄糖，1%蛋白胨，1%酵母提取物用陈海水配制），在通风搅拌发酵罐中培养，可以是批式操作或者流加操作，到达放罐时间，放罐，得到含有大量裂殖壶菌菌体的发酵液。采用离心、过滤或者离心和过滤相结合的方法收集菌体，得到含水量在65～90%的菌体。

对于用酒精浸泡菌体脱水工艺，可以是分批操作、连续操作或者是半连续操作。

对于分批操作，S1所述裂殖壶菌湿菌体用酒精浸泡脱水分三步进行：（1）用裂殖壶菌湿菌体和酒精混合均匀，使得酒精的终浓度为30～70%（质量分数），保持一段时间，离心收集获得一次脱水菌体；（2）用一次脱水菌体与酒精混合均匀，使得酒精的终浓度大于等于75%（质量分数），保持一段时间，离心收集获得二次脱水菌体；（3）用二次脱水菌体与二次脱水菌体质量的1～1.5倍质量的无水酒精混合均匀，保持一段时间，离心收集获得脱水后的菌体，其水分含量小于5%。

为了进一步提高DHA乙酯的得率，所述脱水后的菌体水分含量可以控制为小于2%。

对于半连续操作，S1所述裂殖壶菌湿菌体用酒精浸泡脱水为：将若干根柱串联，将裂殖壶菌湿菌体装柱，从第一根柱开始，用无水酒精以0.5～5个柱床体积/h的流速洗脱柱内菌体，每根柱的流出液作为下一根柱的进料液，当一根柱内流出液酒精含量高于97%（质量分数），收集该柱内菌体即得脱水后菌体。流程中最后一根柱流出液重新蒸馏，回收酒精，可以循环利用。

具体地，所述半连续操作是先将鲜湿菌体装柱，柱的高径比一般为10～50：1，将4～8根柱串联连接，然后从第一根柱开始，用无水酒精以0.5～5个柱床体积/小时的流速洗脱柱内菌体，第一根柱的柱后流出液作为第二根柱的进料液，第二根柱的流出液进入第3根柱，如此串联，当流出液酒精含量小于20%时这根柱的流出液就不作为下一根柱的进料液，而是排放到储罐等待后续蒸馏回收酒精。而当一根柱流出液酒精含量高于97%后，这根柱内的菌体被判断为完成脱水，停止进酒精，并卸料回收菌体用于后续的胞内转酯化。将无水酒精直接流入下一根柱，继续后续几根柱的脱水操作。卸料的柱再装新鲜湿菌体，串联到连续操作的最后，参与到脱水操作中。

完成酒精脱水后的菌体进行下一步乙酯化反应，优选地，S2所述无水乙醇的质量为脱水后的菌体的质量的5～30倍；S2所述催化剂的质量为脱水后的菌体的质量的0.2～5倍；S2所述反应温度为70～90℃，反应时间为1.5～4h。

在乙酯化反应完成，过滤后即可进行有机溶剂提取，S2所述有机溶剂为正己烷、乙醚、石油醚等油脂工业中常用的溶剂；所述催化剂为氢氧化钠或者浓硫酸。

溶剂提取后得到的是脂肪酸乙酯和少量甘油酯以及磷脂的混合溶液，通过蒸发回收溶剂后得到以脂肪酸乙酯为主的粗酯。粗酯可以按照传统的油脂精炼和分离工艺操作。最终得到DHA乙酯。例如，脂肪酸乙酯的分离可以采用尿素包合法、层析法或者分子蒸馏法等工艺进行。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种从海洋微藻中生产DHA乙酯的方法，采用酒精对鲜湿的藻细胞脱水，或者说是用乙醇替换细胞内的水分，而留在细胞中的乙醇正是后续流程转酯化的反应物。该方法至少有以下5个优点：（1）酒精脱水工艺中海洋微藻细胞一直处于酒精的浸没状态，不易与空气接触，避免了高温和与氧气接触的干燥过程，有利于获得高质量的藻油；（2）酒精脱水过程中，由于酒精引起细胞壁和细胞膜中镶嵌的蛋白变性，以及引起细胞壁和细胞膜变形，增加了细胞的通透性，这有利于酸碱等催化剂渗透进入细胞内催化油脂转酯化反应；（3）转酯化反应在细胞内进行，海洋微藻细胞大小在1～7μm之间，属于微米颗粒尺度，而在细胞内，油脂分散度更高，脂质粒的大小甚至小于1微米，所以反应物的混合尺度小，比起传统转酯化工艺是提取油脂进行转酯化反应时酒精和油脂混合的两相分散颗粒尺寸小得多，所以反应物有更大的接触表面，因此反应效率高；同时也避免了传统工艺中需要高强度乳化的缺陷，降低生产成本；（4）反应后，脂肪酸甘油酯变成了脂肪酸乙酯，甘油酯的分子量更大、粘度也更大，乙酯粘度小流动性好得多，乙酯透过细胞壁的能力比甘油酯强得多，所以可以不必破碎细胞直接提取脂肪酸乙酯；（5）从经济效益看，由于用酒精替换了细胞中的水，工艺中由通过加热蒸发去除细胞中的水分的物理化学过程，变成了通过蒸馏使酒精水溶液中的酒精和水分离的过程，也就是原来的工艺是除去水分需要提供高于水的汽化潜热的热量，变成了只要提供酒精的汽化潜热的热量，而在常压下酒精的蒸发潜热是水的蒸发潜热的1/3，所以比传统工艺更加节能。

附图说明

   图1为酒精半连续脱水工艺流程图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

    从裂殖壶菌发酵液离心得湿菌体，经测定菌体水分含量为70%，取湿菌体1g，冷冻干燥去除水分，称重后按照GB/T17376-2008的方法测定脂肪酸组成，DHA含量为0.2g/g干菌体。

    取100g湿菌体（相当于干菌体30g）置于500ml三角瓶中，加入150ml 95%酒精，摇匀，每隔20分钟摇匀一次，浸泡1小时，离心，收集上清液（酒精水溶液），取沉淀（菌体）再置于原三角瓶中，加入95%酒精150ml重复上述操作，再次离心取得菌体，用100ml无水酒精浸泡1小时后离心得到菌体，此菌体含水量为1.87%。将酒精脱水后的菌体置于500ml烧瓶中，加无水酒精50ml，再加98%浓硫酸5ml，在70℃水浴中回流反应4小时。反应完毕后，过滤，收集滤液，菌体用50ml无水酒精重悬，再过滤收集滤液，重复1次。合并所有滤液，于500ml分液漏斗中，加75ml蒸馏水，再加50ml正己烷，震荡15分钟后静止30分钟，收集上层正己烷层，再分别用50ml正己烷萃取2次，合并正己烷提取液共得150ml提取液，取样用气相色谱法（气相色谱条件同GB/T17376-2008）测定提取液中的DHA乙酯含量为35mg/ml，计算转化和提取得率为89%。正己烷提取液经过旋转蒸发回收正己烷溶剂后得到脂肪酸乙酯和少量甘油酯的混合液，可以采用尿素包合法、分子蒸馏、层析法等方法分离DHA乙酯。

实施例2

从裂殖壶菌发酵液离心得湿菌体，经测定菌体水分含量为70%，取湿菌体1g，冷冻干燥去除水分，称重后按照GB/T17376-2008的方法测定脂肪酸组成，DHA含量为0.2g/g干菌体。

取1000g湿菌体（相当于干菌体300g）分别装入5根Φ2.5cm×50cm的玻璃柱（称为脱水柱）内，装柱高度约40cm。从1^#柱上端注入无水酒精，注入速度为3ml/分钟，最初20ml流出液收集到储液罐中，然后将流出液管接入2^#柱的上端入口让其流入2^#柱，注入200ml无水酒精后，无水酒精转注入2^#柱，然后2^#柱按照1^#柱的操作方法延续。拆下1^#柱，取出柱内的菌体，空柱可再装填新的菌体，并入脱水流程中循环操作。从脱水柱中取出的菌体含水量为1.5%，此为脱水菌体。将1^#柱卸下的脱水菌体置于500ml烧瓶中，加无水酒精100ml，再加98%浓硫酸10ml，在70℃水浴中回流反应4小时。反应完毕后，过滤，收集滤液，菌体用100ml无水酒精重悬，再过滤收集滤液，重复1次。合并所有滤液，于1000ml分液漏斗中，加150ml蒸馏水，再加100ml正己烷，震荡15分钟后静止30分钟，收集上层正己烷层，再分别用100ml正己烷萃取2次，合并正己烷提取液共得300ml提取液，取样用气相色谱法（气相色谱条件同GB/T17376-2008）测定提取液中的DHA乙酯含量为37mg/ml，计算转化和提取得率为88.9%。正己烷提取液经过旋转蒸发回收正己烷溶剂后得到脂肪酸乙酯和少量甘油酯的混合液，可以采用尿素包合法、分子蒸馏、层析法等方法分离DHA乙酯。

本发明的工艺的优点主要表现在DHA油脂质量更高、更加稳定，粗油色值更低，工艺更加简化，油脂提取率更高。传统工艺与本发明工艺各项指标比较如下表：

*注：传统方法乙酯化率的计算基础是以提取并精炼后的油脂转酯化反应所得数据，传统方法油脂的提取率一般为90%左右（最高为可达到95%），本专利DHA乙酯化率包含了提取率在内，是提取和转酯化的综合得率。

对比例1

实验方法同实施例2，唯一不同的是注入无水酒精的速度为15ml/分钟，因此不同的是注入200ml无水酒精后卸柱所得脱水菌体的含水量为10.1%。最终提取液中的DHA乙酯含量为33.41mg/ml，计算转化和提取得率为80.23%。

对比例2

实验方法同实施例2，唯一不同的是，乙酯化反应温度为60℃，反应时间为1小时。最终提取液中的DHA乙酯含量为30.40mg/ml，计算转化和提取得率为73.01%。