利用级联的DNA链替换反应的细胞内非编码RNA检测方法

摘要

本发明公开了一种利用级联的DNA链替换反应的细胞内非编码RNA检测方法，其是一种新型的细胞内非编码RNA，尤其是microRNA(miRNA)的检测方法。其特征在于合理设计DNA分子探针，使细胞内的目标链能够触发级联的DNA链替换反应的发生，进而有效的释放具有荧光基团修饰的信号链，通过荧光显微镜观察肿瘤细胞的成像，最终实现基于级联的DNA链替换反应的细胞内miRNA检测。本发明具有操作简单，高效率的特点，同时也是在细胞内miRNA检测中一种新型方法。

说明书

技术领域

本发明属于细胞内非编码RNA分子检测技术领域，具体涉及利用级 联的DNA链替换反应有效的释放具有荧光基团修饰的信号链分子，从而 实现非编码RNA，尤其是microRNA(miRNA)的检测。

技术背景

在人体组织以及细胞中存在一些不翻译成蛋白，但是具有重要作用的 RNA分子，我们称之为非编码RNA。例如人体细胞中不可或缺的转运RNA (tRNA)和核糖体RNA(rRNA)，还有一些表达量相对较低的snoRNA, microRNA,siRNA,snRNA,exRNA,piRNA和long ncRNA。其中MicroRNA (miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链 RNA分子。由于miRNA能够很好的识别并配对后转录基因进而调控蛋白 的表达，所以它与动物体内的生物过程息息相关。目前已经有研究表明： miRNA的异常行为会导致疾病的出现，包括心血管疾病，神经发育失常， 甚至癌症。[Nature,2012,482,347.]所以在癌症的诊断以及治疗过程中 miRNA的浓度都是一个重要的生物指标。

目前为止，通用的miRNA检测方法包括：Northern Blotting,miRNA 微阵列,和qRT-PCR。[Chem.Rev.,2013,113,6207.]其中Northern Blotting 是最经典的miRNA检测手段，但是它本身检测灵敏度较低，并且需要大 量的样品。而miRNA微阵列具有高通量检测的优势，但是检测需要的时 间很长，并且精度不高。qRT-PCR检测手段具有高精度，高灵敏度的特点， 但是需要长时间的扩增步骤并且对操作人员具有一定的技能要求，这在实 时检测中是一个很大的问题。但是上述方法最大的一个问题是所有的实验 都是基于细胞裂解处理，无法实时的反映出细胞内部真实的miRNA的作 用机制。

然而为了能更加深入了解miRNA在细胞内调控基因表达的真实信息 以及探索miRNA在细胞内的反应的动态过程，实现细胞内的miRNA的检 测则尤为重要。现如今体内miRNA检测手段主要分为原位杂交技术和动 态成像技术。在动态成像技术中基于分子信标成像是一个非常重要的手 段。借助特殊的转染技术将荧光标记的分子信标导入细胞内，分子信标与 目标miRNA分子配对后发生结构的转变会导致荧光信号的出现，最终实 现miRNA的检测。[Biomaterials,2012,33,6430.]但是这些技术中存在一个 明显的问题就是每次的信号分子的输出都伴随着目标分子的消耗。而在细 胞中的miRNA分子表达非常的有限，所以上述的技术在实现细胞内 miRNA分子的检测具有很大的限制。

因此，为了克服现有技术中细胞内miRNA分子检测的困难，本发明 人进行了深入研究，发现利用级联的DNA链替换反应实现细胞内 microRNA检测具有简单操作，可以实现低浓度检测等特点，在现有的技 术文献的进一步检索中没有发现有关级联的DNA链替换反应在细胞内 miRNA检测的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的细胞内miRNA检测方法。该检测手 段无需严格的操作条件，操作简单。在该新的组装方法中首次将级联的 DNA链替换反应应用到细胞内microRNA检测。其原理见图1，首先在 DNA分子探针的制备中需要先将基底链与信号链杂交。在这种情况下信 号链末端的荧光基团(例如FAM)会与基底链末端的淬灭基团(例如 BHQ-1)非常的靠近，荧光基团被淬灭，没有信号的输出。需要导入到细 胞内的DNA分子探针中除了上述的双链DNA，同时也包括一条“燃料链”。 分子探针导入到细胞以后，目标miRNA序列首先与双链DNA上的裸露的 一端作用，进而发生链替换反应，释放出信号链分子。该反应的中间产物 与“燃料链”分子发生链替换反应，释放出miRNA。经过上述的级联的 DNA链替换反应，信号链被释放，而且miRNA链得到有效的回收，能够 用于触发新的一轮的反应。该发明充分利用了级联的DNA链替换反应在 信号放大上的能力，最终实现了细胞内miRNA分子的检测。

具体地，本发明提供以下各项：

本发明一方面提供一种DNA分子探针组合，所述DNA分子探针组 合包括双链DNA寡核苷酸和单链DNA寡核苷酸两部分，所述双链DNA 寡核苷酸由一端带有荧光基团修饰的信号链与一端修饰有淬灭基团的基 底链按照1:1的比例杂交而成，并且基底链比信号链在未修饰淬灭基团端 多5个碱基，形成裸露端。

在优选的实施方案中，所述荧光基团修饰在信号链的5’端，所述淬灭 基团修饰在基底链的3’端，相应的，基底链在5’端多出5个碱基，形成裸 露端。

在优选的实施方案中，所述荧光基团为FAM或Cy5，淬灭基团为 BHQ-1或BHQ-2。

另一方面，本发明提供一种检测生物体内非编码RNA分子的方法， 所述方法包括以下步骤：

1)根据待测非编码RNA分子设计互补的信号链和基底链，以及与基 底链部分互补的单链DNA分子，即燃料链，其中，待测非编码RNA分子 与基底链部分互补，且信号链在一端修饰有荧光基团，基底链在一端修饰 有淬灭基团，并且基底链比信号链在未修饰淬灭基团端多5个碱基，形成 裸露端；

2)将互补的信号链和基底链按照1:1的比例杂交形成双链；

3)将步骤2)中形成的双链与所述燃料链一起转入细胞；

4)成像并观察。

在优选的实施方案中，所述荧光基团修饰在信号链的5’端，所述淬灭 基团修饰在基底链的3’端，相应的，基底链在5’端多出5个碱基，形成裸 露端。

在优选的实施方案中，所述信号链的长度比被检测非编码RNA，尤 其是miRNA短1-2个碱基。

在优选的实施方案中，所述燃料链的长度比被检测非编码RNA，尤 其是miRNA长1-2个碱基。

在优选的实施方案中，所述部分互补是指除去末端多出的碱基，其余 部分完全互补。

在优选的实施方案中，所述非编码RNA分子为miRNA，优选为 miRNA-21、miRNA-122。

在优选的实施方案中，对于miRNA-21，所述DNA分子探针组合中， 所述基底链序列为BHQ-1-CCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA(SEQ  ID NO：1)，所述信号链的序列为 TATCAGACTGATGTTGATTGG-FAM(SEQ ID NO：2)，所述燃料链的序列 为CTTATCAGACTGATGTTGATTGG(SEQ ID NO：3)。

在优选的实施方案中，对于miRNA-122，所述DNA分子探针组合中， 所述基底链的序列为 BHQ-2-CTACCAAACACCATTGTCACACTCCA(SEQ ID NO：4)，所述信 号链的序列为TGTGACAATGGTGTTTGGTAG-Cy5(SEQ ID NO：5)，所述 燃料链的序列为AGTGTGACAATGGTGTTTGGTAG(SEQ ID NO：6)。

本发明的另一个方面提供所述DNA分子探针组合用于靶分子及靶分 子所在细胞在生物体内成像的用途。

在优选的实施方案中，所述细胞为肿瘤细胞，优选为Huh7细胞。

在优选的实施方案中，所述靶分子为非编码RNA分子，优选为miRNA 分子，更优选为miRNA-21、miRNA-122。

本发明的另一个方面提供一种非编码RNA分子的检测试剂盒，所述 试剂盒包含所述DNA分子探针组合。

本发明的另一个方面提供试剂盒，所述试剂盒包含所述DNA分子探 针组合。

在优选的实施方案中，所述靶分子为非编码RNA分子，优选为miRNA 分子，更优选为miRNA-21、miRNA-122。

本发明提供如下方案和技术效果：

<1>.合理设计DNA分子探针，使细胞内的目标链能够触发级联的 DNA链替换反应的发生，，进而有效的释放具有荧光基团修饰的信 号链，通过荧光显微镜观察肿瘤细胞的成像，最终实现基于级联的 DNA链替换反应实现细胞内miRNA检测。

<2>.根据<1>所述的基于级联的DNA链替换反应实现细胞内 miRNA检测的方法，其特征在于设计了一种特殊的DNA分子探针。 该分子探针包含两部分：首先是一种特殊的双链DNA，该双链由 带有荧光基团(例如：FAM)修饰的信号链与末端修饰有淬灭基团 (例如BHQ-1)的基底链杂交而成；另一部分则是称为“燃料链” 的单链DNA。

<3>.根据<1>所述的基于级联的DNA链替换反应实现细胞内 miRNA检测的方法，其特征在于设计的DNA分子探针能在细胞内 miRNA分子存在的条件下发生级联的DNA链替换反应。

<4>.根据<1>所述的基于级联的DNA链替换反应实现细胞内 miRNA检测的方法，其特征在于利用级联的链替换反应释放有荧 光标记的DNA信号链，实现肿瘤Huh7细胞的成像。

<5>.根据<1>所述的基于级联的DNA链替换反应实现细胞内 miRNA检测的方法，其特征在于通过肿瘤细胞的成像可以达到 miRNA-21的检测的目的。

<6>.根据<1>所述的基于级联的DNA链替换反应实现细胞内 miRNA检测的方法，其特征在于该检测方法适用于其他细胞或者 组织内各种类型的miRNA序列的检测，同时也适用于生物体内各 种非编码RNA分子的检测。另外一方面，包含有这些RNA分子的 目标链的细胞或者组织的成像能在该技术下得以实行。

本发明是首次利用级联的DNA链替换反应实现细胞内miRNA检测。 本发明是一种全新的miRNA分子检测手段，该检测手段无需严格的操作 条件，操作简单。特别是在miRNA分子低表达的细胞或者组织中具有非 常好的优势。解决了在之前的检测技术中存在检测体系中信号分子输出中 伴随着目标链损失的巨大困难。检测的范围也适用于其他类型的非编码 RNA分子。同样该技术也是细胞以及其他组织成像中的一种重要手段。

附图说明

图1为基于级联的DNA链替换反应实现细胞内microRNA检测方法原理 图。

图2为DNA分子探针在Huh7细胞内的miRNA-21实施检测的细胞荧光 成像图。其中，杂交链＝100nM，燃料链＝200nM。

图3为DNA分子探针在Huh7细胞内的miRNA-122实施检测的细胞荧光 成像图。其中，杂交链＝100nM，燃料链＝200nM。

图4为DNA分子探针在Huh7细胞内的miRNA-122实施检测的细胞荧光 成像图。其中，杂交链＝100nM，燃料链＝0nM。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进一步描述：

本实验中所使用到的Huh7的细胞购买于上海中科院细胞库。

所有的初始原料，DNA都从生工(上海)生物工程股份有限公司或 者Adamas公司购买，试剂除非说明都没有再次提纯。所有的化学试剂都 是分析纯或者更高纯度的，使用的转染试剂是X-tremeGENE HP，胎牛血 清购于ExCell公司。

紫外可见分光光度计：Cary 300。

荧光分光光度计：F-7000(Hitachi High-Techonologies Corporation  Japan)。

荧光显微镜：IX71(Olymapus Japan)。

本实例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了比较详细的实 施方式和过程。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于本发明保 护的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步的 调整，未注明的实验条件通常按照常规实验中的条件。

本实施例主要通过细胞成像验证级联的DNA链替换反应实现细胞内 microRNA检测的可行性，利用光学显微镜来监测反应的结果。本发明的 检测步骤如下：

第一步：DNA探针的准备：(1)基底链与信号链DNA分别溶解在10 mM Tris-HCl(pH 7.5,0.3M NaCl,5mM MgCl₂)缓冲液中，按照1:1的摩尔 比例混合后退火得到双链DNA；(2)燃料链DNA溶解在10mM Tris-HCl 缓冲液中。

第二步：细胞的培养。

第三步：利用商业转染剂将DNA探针导入到细胞内。

第四步：细胞成像。

在本发明中所选择的癌症细胞是Huh7细胞，被检测序列是 miRNA-21。

以下实例进一步验证级联的DNA链替换反应实现细胞内microRNA 检测的可行性，并且对Huh7细胞内的miRNA-21实施检测。

实施例1：

第一步，DNA探针的准备：

①寡核苷酸溶解在10mM Tris-HCl(pH 7.5,0.3M NaCl,5mM MgCl₂) 缓冲液中，溶液中单链的浓度利用260nm波长紫外吸收值进行标定；

②基底链与信号链等摩尔浓度混合，在90°下保持15分钟，然后再 逐渐降温至室温，退火过程超过2小时。杂交双链DNA在4°保存；

所得双链DNA浓度为10μM，燃料链DNA浓度为20μM。

第二步，细胞培养：

将Huh7细胞种到十二孔板中，每孔约5000个细胞，使用含有10％牛 血清蛋白的DMEM培养基在细胞培养箱中进行培养24小时，其中需要 5％CO₂的潮湿空气，温度控制在37℃。

第三步，利用商业转染剂将DNA探针导入到细胞内：

a.转染混合液的准备：将5微升双链DNA，5微升双链燃料链和1微升 罗氏X-tremeGENE HP转染试剂溶解在500微升Opti-Mem中，轻轻漩 涡震荡1分钟待用,混合液杂交链浓度为100nM，燃料链浓度为200 nM。

b.十二孔板中的Huh7细胞使用无菌的pH为7.4PBS(phosphate buffered  saline)缓冲液进行冲洗三次，每次2mL。再加入a步骤中的转染混合 液。

c.放置在37°细胞培养箱中培养4小时。

第四步，细胞成像：

1)将被转染处理4小时的Huh7细胞使用无菌的pH为7.4PBS缓冲液进 行冲洗三次，每次2mL。再加入500微升PBS进行荧光成像试验；

2)选择被扫描区域，拍摄细胞图像。

对于miRNA-21的检测，

基底链的序列(从左到右为5'—3')为

BHQ-1-CCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA(SEQ ID NO：1)

信号链的序列(从左到右为5'—3')为

TATCAGACTGATGTTGATTGG-FAM(SEQ ID NO：2)，

燃料链的序列(从左到右为5'—3')为

CTTATCAGACTGATGTTGATTGG(SEQ ID NO：3)

通过细胞图像可以得到验证。在图2中可以清楚的看到细胞呈现绿色， 本实例的操作简单，现象非常的明显。

实施例2：

采用同实施例1相同的操作步骤，只是设计的DNA分子探针是为了 检测Huh7细胞中miRNA-122的表达，各种DNA链的序列发生变化，信 号链的末端修饰有Cy5。同样可以在细胞图像中看到明显的颜色，见图3。

对于miRNA-122的检测，

基底链的序列(从左到右为5'—3')为

BHQ-2-CTACCAAACACCATTGTCACACTCCA(SEQ ID NO：4)

信号链的序列(从左到右为5'—3')为

TGTGACAATGGTGTTTGGTAG-Cy5(SEQ ID NO：5)

燃料链的序列(从左到右为5'—3')为

AGTGTGACAATGGTGTTTGGTAG(SEQ ID NO：6)

通过图像可以验证该检测策略适合检测细胞内各种类型的miRNA分 子。

实施例3：

采用同实施例2相同的操作步骤，只是DNA分子探针中的燃料链DNA 浓度为0nM。在细胞图像中只能看到非常微弱的颜色，见图4。

基底链的序列(从左到右为5'—3')为

BHQ-2-CTACCAAACACCATTGTCACACTCCA(SEQ ID NO：4)

信号链的序列(从左到右为5'—3')为

TGTGACAATGGTGTTTGGTAG-Cy5(SEQ ID NO：5)

燃料链的序列(从左到右为5'—3')为

AGTGTGACAATGGTGTTTGGTAG(SEQ ID NO：6)

通过图像可以验证该检测策略在检测细胞内各种类型的miRNA分子 中，参数设计的重要性。

上述实例只为说明本发明的技术构思以及特点，其目的在于让熟悉此 项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的 保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或者修饰，都应涵盖在 本发明的保护范围之内。