一种金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄免疫球蛋白可变区单链抗体及用途

摘要

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)可变区单链抗体，所述特异性鸡卵黄免疫球蛋白可变区抗体具有SEQ ID NO：2核苷酸序列，和SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列。该单链抗体对金黄色葡萄球菌具有较高的结合能力，即所筛选抗体针对金黄色葡萄球菌生长具有明显抑制效果，其抑制效果和抑制行为相似于青霉素和链霉素，在制备金黄色葡萄球菌抗体药物或检测试剂中具有很好的应用前景。另外，该单链抗体对金黄色葡萄球菌的特异性强，从而能提高金黄色葡萄球菌实验室早期诊断和临床治疗水平。

说明书

技术领域

本发明涉及鸡卵黄免疫球蛋白可变区单链抗体，特别涉及新的金黄色葡萄 球菌特异性鸡卵黄免疫球蛋白可变区单链抗体，及其可变区的氨基酸序列和 DNA编码序列，还涉及所述抗体的制备方法和用途。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是人和动物的重要病原菌， 隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，是革兰氏阳性菌的代表，可引起心内膜炎、 肺炎、败血症等许多严重感染。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引 起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。目前，对金黄色葡萄球菌感染的治疗， 主要以抗生素为主，但其滥用导致耐药细菌频现，并且禽畜产品中抗生素残留 问题也对食品安全和人体健康造成严重威胁。因此，利用特异性抗体代替抗生 素将是解决细菌耐药性的新型绿色安全途径之一。

卵黄抗体(IgY)，是在特异性抗原刺激下由禽类B淋巴细胞产生并转移到 卵黄中的多克隆抗体。IgY以其性质稳定、特异性强、制备简单、成本低等优势 而成为最具有应用前景的抗生素替代品。已有报道证明，IgY可替代抗生素治疗 沙门氏菌、幽门螺杆菌等细菌引起的胃肠道疾病。虽然IgY有诸多优点,但是蛋 鸡免疫所获得的特异性IgY仅占IgY总含量的2-10％，且分离纯化过程繁琐， 即使纯化后获得了高纯度特异性IgY，也难以通过体外酶解等手段获得特异性 IgY活性肽。因此，如何获得高活性、性能稳定，甚至能通过基因工程菌大量表 达的IgY活性肽，是突破IgY难以大量提纯瓶颈的关键，也是研究IgY抗菌机 理必须解决的问题。

噬菌体抗体库技术(Phage Antibody Library Technology)是噬菌体展示技术 和多克隆抗体构建技术相结合的产物。通过噬菌体展示技术将多克隆抗体展示 于噬菌体的表面，构建成噬菌体抗体库，之后通过生物淘选、抗体活性检测等 手段获得特异性的抗体。相对于传统的单克隆多克隆抗体，噬菌体抗体库所包 含的抗体具有很多优点：1.含有完整的抗原结合位点，并且大小为完整抗体的 1/6，更易于基因操作；2.只有抗体的V区，所以免疫原性小；3.噬菌体展示抗 体库中的抗体都表达在噬菌体的表面，方便生物淘选；4.获得的抗体，后期大量 制备周期短，纯化过程简单、特异性的目的抗体收率高。5.可以获得抗体的核酸 序列，便于药物作用机理的研究。

综上所述，利用基因工程技术和噬菌体抗体库技术制备特异性IgY可变区 单链抗体(ScFv)，对于克服特异性IgY难以大量提纯，影响其产业化应用问题 有极其重要的意义。同时也为特异性IgY基因工程菌表达和其抑菌机理研究奠 定了关键基础。

发明内容

本发明的第一方面提供一种新的金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄免疫球蛋白 (IgY)可变区单链抗体(ScFv)，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，及 SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明采用如下方法得到一种金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄免疫球蛋白可 变区单链抗体，命名为SF_V6。通过鸡IgY重链和轻链可变区基因框架区1(FR1) 和框架区4(FR4)保守序列设计引物，扩增抗体V_H和V_L基因，利用Linker 序列将两者连接成S_CF_V基因，保证了抗体的多样性。所获S_CF_V基因与T7 select10-3b载体相连接，之后用包装蛋白包装构建成噬菌体抗体库，通过生物淘 选、测序等方法，从血液噬菌体文库获取了1个即含V_H又含V_L的S_CF_V全长抗 体，从脾脏噬菌体文库获取了2个S_CF_V全长抗体。三个全长S_CF_V连接到原核表 达载体，诱导表达后的可溶性蛋白经间接ELISA鉴定具有抗体活性。其中，脾 脏来源的噬菌体S14在阻断ELISA中表现出对阳性一抗的阻断率达50％以上； 其对应的可溶性蛋白SF_V6不仅在间接ELISA中表现出特别强的抗原亲和性，而 且在体外抑菌实验中表现出良好的抑菌效果。目前，尚未发现具有本发明序列 的噬菌体抗体。

本发明的第二方面提供含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的重组表达载 体，所述载体选自原核或真核表达载体，优选为pCold I。

本发明的第三方面提供含有所述重组表达载体的宿主细胞，所述的宿主细 胞优选为BLT5403。所述宿主细胞表达以上所述的金黄色葡萄球菌特异性鸡卵 黄免疫球蛋白可变区单链抗体。

本发明的第四方面提供金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄免疫球蛋白可变区单 链抗体(SF_V6)和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列在制备金黄色葡萄球菌抗体 药物或检测试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明提供了一种金黄色 葡萄球菌特异性IgY可变区单链抗体，该单链抗体对金黄色葡萄球菌具有较高的 结合能力，即所筛选抗体针对金黄色葡萄球菌生长具有明显抑制作用，其抑制 效果与使用青霉素和链霉素相近，在制备金黄色葡萄球菌抗体药物或检测试剂 中具有很好的应用前景。另外，该单链抗体对金黄色葡萄球菌的特异性强，从 而能提高金黄色葡萄球菌实验室早期诊断和临床治疗水平。

附图说明

图1为阻断ELISA检测单噬菌体活性。图1A为从第三轮淘选的血液文库 中随机选择12个克隆进行阻断ELISA检测；图1B为从第三轮淘选的脾脏文库 中随机选择14个克隆进行阻断ELISA检测。

图2为SDS-PAGE分析ScFv诱导表达产物。泳道M：蛋白Marker；泳道 1：B5噬菌体获取的全长S_CF_V基因片段表达的蛋白BF_V1；泳道2：S3噬菌体获 取的全长S_CF_V基因片段表达的蛋白SF_V2；泳道3：S14噬菌体获取的全长S_CF_V基因片段表达的蛋白SF_V6；泳道4：S4和S8(核酸序列相同)噬菌体获取的轻 链S_CF_V基因片段表达的蛋白SF_V5。

图3为Western blotting分析ScFv诱导表达产物。泳道M：蛋白Marker；泳道1： B5噬菌体获取的全长S_CF_V基因片段表达的蛋白BF_V1；泳道2：S3噬菌体获取的全 长S_CF_V基因片段表达的蛋白SF_V2；泳道3：S14噬菌体获取的全长S_CF_V基因片段 表达的蛋白SF_V6；泳道4：S4和S8(核酸序列相同)噬菌体获取的轻链S_CF_V基因 片段表达的蛋白SF_V5。

图4为间接ELISA检测ScFv表达蛋白的抗体活性。

图5为ScFv表达蛋白的体外抑菌效果。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明， 但不以任何方式限制本发明。本领域技术人员可以明白，根据本申请公开的内 容结合本领域技术常识，本申请公开的DNA序列和氨基酸序列可以按照本领域 常用的其他方法合成，例如通过化学合成的方法得到本申请公开的序列。而且， 本领域技术人员可以将本申请获得的新的DNA序列构建到任何合适的载体、宿 主细胞中。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技 术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明做出多种改变和修饰，而其也应 当属于本申请要求保护的范围之中。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施 例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条 件的实验方法，通常按常规条件，例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册(New  York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述条件，或按制造厂商所 建议的条件。

本文所用术语“噬菌体抗体库”是指利用PCR技术从生物体内扩增编码抗 体的基因序列，克隆到噬菌体载体上，并以融合蛋白的形式表达到噬菌体表面， 形成噬菌体抗体，利用特异性抗原与抗体的结合从噬菌体抗体库筛选获得特异 性抗体及其基因。

本发明提供的金黄色葡萄球菌鸡卵黄免疫球蛋白可变区单链抗体(SFv6， Spleen variable fragment)的核苷酸序列为SEQ ID No：2，氨基酸序列为SEQ ID  No：1。

实施例1

1.抗原制备、蛋鸡免疫及血清效价检测

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CVCC 545菌株购自中国兽医微生 物菌种保藏管理中心。取适量金黄色葡萄球菌菌种转接到200ml TSB培养基中， 37℃过夜培养后，在4℃、5000rpm的条件下离心10min，收集菌体，用0.01mol/l  PBS重悬洗涤三次，然后用0.5％甲醛37℃灭活24h，取部分菌液用PBS调至 10⁹cfu/ml备用，其余进行冷冻干燥，获得菌体冻干粉。

将上述金黄色葡萄球菌灭活菌液与弗氏完全佐剂(初免)或弗氏不完全佐 剂(二免和三免)等体积混合，并采用双推法进行乳化，制成疫苗。采用120 日龄的健康来航蛋鸡进行免疫。每只鸡胸肌注射2点，颈部皮下注射1点。共 免疫3次，每次间隔10天，3次免疫剂量递增，分别为每只鸡1.0ml、1.5ml 和2.0ml。

免疫后，对鸡的血清进行效价测定。

2.血液及脾脏总RNA提取及cDNA合成

第三次免疫第10天，无菌收集免疫鸡血液和脾脏，使用TaKaRa RNAiso Plus 分别进行免疫鸡血液和脾脏Total RNA提取，然后用TaKaRaⅡ High  Fidelity RT-PCR Kit将RNA反转录生成cDNA。具体操作参见试剂盒说明书。

3.V_L基因和V_H基因片段的PCR扩增

(1)引物设计：依据已报道鸡IgY轻链和重链可变区基因框架区1(FR1) 和框架区4(FR4)保守序列设计引物，所用引物如表1：

表1.引物名称以及其序列

(2)PCR扩增：以上述步骤2得到的cDNA为模板，使用TaKaRa LAwith GC Buffer进行PCR扩增。以FR1-F和FR1-R作为上下游引物扩增V_L基因， 以FR4-F和FR4-R作为上下游引物扩增V_H基因。

PCR扩增反应体系为：上述步骤2得到的cDNA 2μl,dNTP Mixture(2.5mM  each)8μl,上游Primer(20pmol/μl)1μl,下游Primer(20pmol/μl)1μl,2×GC  Buffer 25μl,TaKaRa LA(5U/μl)0.5μl,dH₂O补充至50μl。PCR扩增反 应条件为：98℃变性10s，53℃退火30s，72℃延伸30s，终延伸5min；变 性、退火和延伸步骤为30个循环。

将V_L基因和V_H基因的扩增产物，用1％琼脂糖凝胶检测(其中V_L基因片 段约为340bp，V_H基因片段约为370bp)后，采用DNA凝胶回收试剂盒纯化 回收目的片段V_L基因片段和V_H基因片段。

4.ScFv基因组装

将纯化回收的V_L基因片段和V_H基因片段，与人工合成的Linker序列(其 片段的5’端有一部分序列和重链下游引物序列相同，3’端有一部分序列和轻 链上游引物序列相同，linker序列为GGAGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGG GTCGGGTGGCGGCGGATCT，使用TaKaRa Taq^TM HS Perfect Mix，进行重叠 PCR，得到ScFv基因。反应体系为：纯化回收的V_L基因片段1μl，V_H基因片段 1μl，人工合成的Linker序列(20pmol/μl)1μl，PrimeSTAR HS(Premix)14.5 μl，重链上游引物FR4-F(20pmol/μl)1μl，重链下游引物FR4-R(20pmol/μl) 1μl，dH₂O补充至50μl。反应条件为：94℃预变性1min，98℃变性10s，55 ℃退火5s，72℃延伸10s；变性、退火和延伸步骤为30个循环。

将组装得到的血液ScFv基因和脾脏ScFv基因，用1％琼脂糖凝胶检测，它 们的基因长度都约为850bp。

5.噬菌体抗体库的构建和鉴定

将纯化的血液S_CF_V基因和脾脏S_CF_V基因，用限制性内切酶EcoR I和Hind Ⅲ双酶切消化、回收后通过连接酶，分别与T7select10-3b载体相连接，之后用 包装蛋白包装连接产物。连接反应以及连接产物的包装均使用Novagen公司的 T7Select Cloning Kit和T7Select System试剂盒，具体方法参见试剂盒说明书。

取适量包装液转染大肠杆菌BLT5403(A₆₀₀＝0.6-1.0)，并涂布羧卞(carb) 抗性的LB平板，根据平板上生长的噬菌斑的个数计算所构建的血液和脾脏T7 噬菌体展示抗体文库的滴度分别为1.22x10⁷pfu/ml和1.00x10⁷pfu/ml，库容为 3.66x10⁶pfu和3.00x10⁶pfu。

挑取噬菌斑，使用T7 Select Cloning Kit中附带的引物T7 Select UP和T7 Select DOWN进行PCR扩增，扩增产物的电泳结果显示，95％的噬菌体包含目 的片段，选取20个PCR产物进行测序，测序结果显示噬菌体展示的抗体包含完 整的重链区和轻链区，且可变区的碱基略有差异，说明所构建的文库抗体多态 性良好。

6.噬菌体展示抗体文库(Phage Display Antibody Libraries，PDAL)的扩增 和淘选

ScFv PDAL的扩增：挑取LB/carb(50μg/ml)平皿上生长的BLT5403单克隆 于5ml LB/carb(50μg/ml)液体培养基中，在37℃过夜培养。取1ml此过夜培养 的BLT5403培养液于50ml LB/carb(50μg/ml)培养基中，37℃摇床培养，当 A₆₀₀＝0.6-1.0时，停止培养。根据滴度检测的ScFv PDAL的滴度，按照每10ml  BLT5403细胞添加1x10⁶pfu噬菌体的比例进行转染。取1ml噬菌体/细胞混合物， 向其中添加10ml冷却至45-50℃的顶层琼脂，涂布LB/carb(50μg/ml)平皿。 平皿于37℃烘箱生长至噬菌斑将要连接在一起时，添加10ml phage Extraction  Buffer(20mM Tris-HCL，PH8.0；100mM NaCl；6mM MgSO₄)，4℃平放过夜。 第二天，吸取phage Extraction Buffer于15ml离心管中，向其中添加0.5ml氯仿， 混匀，3000g离心5min，取上清，即为ScFv PDAL的扩增文库。取少量扩增后 的文库检测其滴度，剩余文库添加0.1体积的80％的甘油，-80℃保存。

ScFv PDAL扩增文库的淘选：将步骤1所制备的金黄色葡萄球菌菌体冻干 粉稀释为0.02mg/ml，每孔100μl包被ELISA平板，4℃放置过夜。然后倾倒包被 液，用去离子水洗涤三次，洗去ELISA板上未结合的金黄色葡萄球菌，用5％的 Blocking Reagent(Novagen)封闭，于37℃保温1h。倾倒封闭液，用去离子水 洗5次，每孔添加2x10¹⁰pfu的上述扩增后的噬菌体，混匀，室温静置30min。倾 倒液体，用1x TBST洗板5次，每次2min，甩干洗涤液。向每孔添加200μl T7 Elution Buffer(Novagen)，室温静置20min。吸取洗脱的噬菌体，取少量淘选出 的噬菌体进行滴度检测，再取100μl进行淘选文库的扩增，扩增方法同上。扩 增之后的ScFv PDAL再进行滴度检测(检测方法同上)，滴度检测之后进行下一 轮的淘选，共进行了三轮淘选。

实验结果：为了筛选特异性较高的S_CF_V抗体，用TBST洗板时，每次清洗时 间为2min。本研究每轮的噬菌体投入量相同，噬菌体淘出量逐轮增加，血液和 脾脏噬菌体淘出量分别由第一轮的6.52×10⁵pfu、5.40×10⁵pfu增加到第三轮的 5.80×10⁶pfu、6.52×10⁷pfu，血液文库和脾脏文库噬菌体的淘出量分别富集了9 倍和121倍。

实施例2：噬菌体抗体阻断ELISA检测

A.ScFv单噬菌体的扩增：

从上述最后一轮噬菌体滴度检测的平板上，随机挑取单噬菌斑于100μl大肠 杆菌BLT5403(A₆₀₀＝0.6-1.0培养液中，再添加2ml新鲜的TSB液体培养基，37℃ 培养4h，之后再添加200μl大肠杆菌BLT5403(A₆₀₀＝0.6-1.0))培养液过夜培 养。第二天，将扩增产物涂100mm LB/carb(50μg/ml)平皿，37℃培养3-4h， 用3ml phage Extraction Buffer(20mM Tris-HCL，PH8.0；100mM NaCl；6mM  MgSO₄)洗脱扩增后的噬菌体，添加氯仿离心之后，上清即为ScFv单噬菌体的 扩增产物。

B.阻断ELISA检测：

a)最佳抗原和抗体工作浓度的确定：

为了获得最佳的抗原包被浓度和最优的阳性/阴性抗体稀释浓度，将抗原(金 黄色葡萄球菌)进行0.2mg/ml、0.02mg/ml、0.002mg/ml的梯度包被，阳性对 照和阴性对照分别做1：10000、1：20000、1：40000、1：80000梯度稀释。取 阳性对照A₄₅₀>1，阴性对照A₄₅₀<0.1作为最佳抗原包被浓度和最优的阳性/阴性 抗体稀释浓度。

b)实验设计方法如表2所示，实验包括阳性对照、阴性对照、空载对照、 样品的阴性对照及样品。试剂的添加顺序如表2首列所示，先用100μl上述步 骤a确定的金黄色葡萄球菌的最佳包被浓度过夜包被ELISA平板；第二天，倾 倒包被液，使用100μl封闭液(0.1g BSA溶于10ml PBS中)37℃封闭1h； 倾倒封闭液，按表2所示，阳性对照和阴性对照不加阻断剂，空载对照加入100 μl T7空载体包装的噬菌体(T7phage)培养液，样品的阴性对照孔及样品孔加 入100μl相同的待检测的噬菌体(T7-B为血液来源的噬菌体，T7-S为脾脏来源 的噬菌体)培养液，37℃孵育1h；使用PBST清洗ELISA板三次，之后阳性 对照孔和阴性对照孔分别加入100μl 1:10000稀释的鸡源的阳性血清(即阳性的 一抗)和鸡源的阴性血清(即阴性的一抗)，空载对照孔和样品孔加入100μl 1:10000鸡源的阳性血清(即阳性的一抗)，37℃孵育1h；使用PBST清洗ELISA 板三次，接着每孔添加100μl 1:5000倍稀释的酶标二抗Anti-chicken IgG(whole  molecule-peroxidase antibody produced in rabbit)，37℃孵育1h；弃孔中溶液，用 PBST洗五次，加100μl TMB显色液，室温密闭显色20min，之后加入50μl 2M  H₂SO₄终止液，立即读取A₄₅₀值。计算每个待测样品(噬菌体)对阳性血清(即 阳性的一抗)阻断率。计算公式如下：阻断率(％)＝[1-(样品孔A₄₅₀值-阴性 对照孔A₄₅₀值)/(空载对照孔A₄₅₀值-阴性对照孔A₄₅₀值)]*100％。

表2.阻断ELISA检测血液噬菌体和脾脏噬菌体展示文库中的噬菌体活性

备注：划“√”的单元格，表示对应的孔添加首列所示的试剂。

划“-”的单元格，表示对应的孔不添加首列所示的试剂。

HRP-Rabbit Anti-Chicken IgG即Anti-chicken IgG(whole molecule)

-peroxidase antibody produced in rabbit

实验结果：从最后一轮淘选的血液和脾脏文库中，分别随机挑取12个和14 个单克隆进行单噬菌体扩增，用扩增后的单噬菌体进行阻断ELISA，并读取A₄₅₀的值。实验结果显示，不加阻断剂的阳性对照A₄₅₀的值﹥空载体对照的A₄₅₀的 值﹥待测样品的A₄₅₀的值，并且阴性对照的A₄₅₀的值与样品阴性对照的A₄₅₀的 值都<0.1，这个值远小于阳性对照A₄₅₀的值和待测样品的A₄₅₀的值。根据公式 计算每个样品的阻断率，最终获取了6个阻断率≥10％的血液噬菌体和9个阻断 率≥10％的脾脏噬菌体(血液噬菌体记为B，脾脏噬菌体记为S)，结果见图1A 和图1B。其中，脾脏来源的S14噬菌体对阳性一抗的阻断率达50％以上，明显 高于其他的噬菌体。

实施例3：单链抗体序列分析

将鉴定阻断率﹥10％的噬菌体使用载体上的引物进行PCR扩增(扩增方法 同实施例1中步骤5的噬菌体的PCR扩增方法)获取S_CF_V，并将它们送宝生物 工程(大连)有限公司进行测序，测序的上游引物使用T7UP，下游引物使用 T7DOWN(引物为试剂盒中的T7噬菌体载体上的引物)，用Sequencher和Clustal  W等软件对测序结果进行分析，在NCBI上进行Blast，与鸡的抗体序列进行同 源比对，发现它们的保守序列与鸡的Ig alpha抗体序列相一致。结果说明，本研 究以金黄色葡萄球菌为抗原，所淘选到的噬菌体携带有鸡源的S_CF_V抗体。

实施例4：ScFv抗体诱导表达

根据测序和比对结果筛选和分类，将非重复的4种类型的血液ScFv和6种类 型的脾脏ScFv，设计infusion引物，引物序列为：

F Primer：GAAGGTAGGCATATGGCCGTGACGTTGGAC

R Primer：AGACTGCAGGTCGACTTATGGTTCCATGCAACAGCCG，进行 PCR扩增，通过infusion克隆方法连接至原核表达载体pCold I中，转化入大肠杆 菌JM109感受态细胞。从转化培养皿上挑取重组的菌体接种于LB/Amp (100μg/ml)培养基中，提取质粒，测序分析。将读码框架正确的质粒转入BL21 表达菌株中，挑取重组的菌株接种于LB/amp(100μg/ml)培养基中，过夜培养。 第二天，取过夜培养的菌液按1％的体积比接种于LB/Amp(100μg/ml)培养基 中，37℃培养至A₆₀₀＝0.6，添加1％100mM IPTG于15℃诱导培养22h。诱导后的 菌体收集、超声破碎后取少量进行SDS-PAGE电泳检测。将检测含可溶性蛋白的 菌体，使用AKTA prime Plus仪器，采用HiTrap^TMcrude，5ml TALON  Superflow^TM进行柱层析纯化、SnakeSkin^TM Pleated Dialysis Tubing；3500MWCO 进行透析处理，得到S_CF_V表达抗体。

实验结果：诱导表达获得的可溶性蛋白透析后平行进行两组SDS-PAGE电 泳，电泳结束后一组凝胶用考马斯亮蓝染色，脱色后结果如图2所示，图2中，M 为蛋白Marker，泳道1为B5噬菌体获取的全长S_CF_V基因片段表达的蛋白，命名为 BF_V1；泳道2为S3噬菌体获取的全长S_CF_V基因片段表达的蛋白，命名为SF_V2；泳 道3为S14噬菌体获取的全长S_CF_V基因片段表达的蛋白，命名为SF_V6；泳道4为S4 和S8噬菌体获取的轻链S_CF_V基因片段表达的蛋白，命名为SF_V5；另一组凝胶， 经转膜仪将蛋白转至PVDF膜上，之后与His标签对应的一抗Antibody BSA free  Mouse monoclonal IgG和二抗HRP-Rabbit anti Mouse IgG反应，并使用True Blue  Peroxidase Substrate显色，显色后的Western blotting结果如图3所示，图3的Marker 与样品同图2，即M为蛋白Marker，泳道1为BF_V1，泳道2为SF_V2，泳道3为SF_V6， 泳道4为SF_V5。

由图2的结果可见，BF_V1、SF_V2和SF_V6均在约30KDa处有单一蛋白条带， SF_V5在约15KDa处单一蛋白条带，与理论值(BF_V1蛋白的大小为32KDa、SF_V2 蛋白的大小为31KDa、SF_V6蛋白的大小为32.5KDa、BF_V5蛋白的大小为16KDa) 基本一致。通过对图3的Western blotting结果与图2的SDS-PAGE凝胶脱色的结果 比对显示，两张图片显示的目的条带大小一致，且条带比较单一，说明目的抗 体得到了良好的表达，且表达的蛋白纯度较好。

实施例5 S_CF_V表达抗体间接ELISA检测

为了分析S_CF_V表达抗体的特异性，使用间接ELISA方法对其进行检测。实 验以PBS为阴性对照，每个待测的抗体稀释到同一浓度。首先，用100μl浓度 为0.02mg/ml的金黄色葡萄球菌过夜包被ELISA板，第二天，倾倒包被液，使 用100μl封闭液(0.1g BSA溶于10ml PBS中)37℃封闭1h，然后每孔加入 100μl浓度为0.016mg/ml可溶性的蛋白，于37℃孵育1h，弃孔中溶液，用PBST 洗三次；之后每孔加入100μl 1：1000稀释的抗His标签的单抗(Penta-His Mouse  monoclonal IgG，BSA-free，Qiagen)，37℃孵育1h，弃孔中溶液，用PBST洗 三次；再加入100μl 1：1000稀释的HRP-Rabbit anti Mouse IgG抗体，37℃孵育 1h，弃孔中溶液，用PBST洗五次；加100μl TMB显色液，室温密闭显色20min， 之后加入50μl 2M H₂SO₄终止液，立即在TECAN Infinite F200酶标仪上读取A₄₅₀值。可溶性蛋白的间接ELISA检测显示，SF_V6与抗原的亲和力最强，其次是 SF_V5、SF_V2和BF_V1(如图4)。SF_V6抗体不论是可溶性蛋白间接ELISA还是其 对应的噬菌体S14的阻断ELISA都表现出了最强的抗原亲和性。

实施例6 金黄色葡萄球菌S_CF_V表达抗体体外抑菌应用

将金黄色葡萄球菌接种于TSB培养基中，37℃，170rpm摇床培养，待生 长至对数期时，接种至新鲜TSB培养基，并将菌液浓度调至10⁶cfu/ml，分装到 六孔板中，每孔加入2ml。实验设置阳性对照和阴性对照，阳性对照加入青霉 素和链霉素(终浓度为100μg/ml)，阴性对照加入PBS，样品组加入S_CF_V表达 抗体(终浓度为20μg/ml)。37℃，170rpm摇床培养，每隔1h测各组的OD值， 诱导表达后纯化的蛋白SF_V6表现出对金黄色葡萄球菌有良好的抑菌效果(如图 5所示)，其抑菌效果接近于青霉素和链霉素，抑菌效果稳定。编码SF_V6抗体的 核苷酸序列为SEQ ID NO：2，氨基酸序列为SEQ ID NO：1。