九种人肝CYP450酶体外抑制效应快速筛选方法

摘要

本发明公开了应用14种探针底物与16种探针反应全面评估9种人肝CYP450代谢酶体外抑制效应的快速筛选方法。本发明主要涉及采用体外混合探针孵育法与LC/MS/MS联用监测9种人肝CYP450酶的代谢活性变化，快速全面的评估受试化合物对代谢酶的抑制效应。该方法综合考虑了探针底物的专一性与多样性，探针底物之间的相互影响、温孵体系中不同孵育条件(有机溶剂、缓冲液、BSA的加入等)对探针反应的活性影响，以及16种探针反应在所选孵育条件下的酶动力学特征等各项因素，并结合高灵敏度、高选择性的LC-MS/MS技术，建立了一种全新的体外评估体系，以期在新药开发的高通量筛选中能更准确更全面的预测受试化合物对9种人肝主要代谢酶可能产生的抑制效应，提高后期代谢性相互作用的预见性。

说明书

技术领域

本发明涉及人肝CYP450酶体外抑制效应快速筛选的方法，具体涉及采用特异性探针底物表征酶活性，利用体外混合探针底物法(N-in-one)与LC-MS/MS联用同时测定多种特异性代谢产物，进而判别九种人肝CYP450酶活性变化，并以此作为体外代谢酶抑制效应的评判依据。

背景技术

长期以来，在药物安全性评价中细胞色素P450s酶系(CYP450)在药物代谢和药物代谢性抑制相互作用中占据了重要地位。在新药研发的早期阶段利用体外实验数据尽早预测新化学实体(NCEs)在体内潜在的药物相互作用，获取相关代谢信息，可以有效地提高新药筛选的成功率，减少开发成本。

体外混合探针底物法(N-in-one)与LC-MS/MS方法联用在新药研发早期快速评价NCEs对CYP450抑制相互作用中得到了广泛应用。混合探针底物法，也称Cocktail探针底物法，即一次实验给予两种或两种以上经不同酶代谢的底物，同时得到多个酶活性信息，加之高灵敏、高选择性的LC/MS/MS技术，实现了对多种探药代谢物的同时检测，即同时监测多个CYP450亚型酶活变化，从而提高筛选通量，提高效率，降低成本。在新药开发早期阶段使用N-in-one技术一直存在争议，原因在于采用此法需要考虑多种因素的影响，包括探针底物选择、避免底物间相互作用、孵育体系辅因子优化等等。而目前报道的方法仍存在不同程度的缺陷，如忽略底物之间的相互作用，将不同亚型的底物置于同一体系中孵育，从而导致假阴性结果的发生。

混合探针底物法一般选取一种特异性探针底物表征酶活性，但CYP3A4(Arch BiochemBiophys，2001，391(1)：49-55)和CYP2C9(Nature，2003，424(6947)：464-468)等亚型因存在多个结合位点，故有必要选择多个结构不相关的底物表征酶活性。近年来不断有CYPs同工酶被发现具有抑制效应的底物依赖性，如CYP2C8(Drug Metab Dispos，2011，39(9)：1546-1554)、CYP2C9(Drug Metab Dispos，2009，37(1)：59-65)、CYP2C19(Drug Metab Dispos，2008，36(3)：523-528)、CYP2D6(Drug Metab Dispos，2012，40(1)：47-53)等。因此，在药物抑制相 互作用的体外评价中，尤其是CYP2与CYP3，尽可能选择两种或者两种以上结构不相关的探针底物表征代谢酶活性，以提高体外结果的可靠性以及体内预测的准确性。

同一孵育体系中的不同底物之间可能存在药物相互作用，如CYP2B6探针底物安非他酮对CYP2C19介导的美芬妥英羟化代谢、CYP2D6介导的右美沙芬-O-脱甲基代谢有抑制作用(Drug Metab Dispos，2000，28(10)：1176-1183)，CYP1A2探针底物非那西丁在高浓度下可抑制CYP2C9介导的甲苯磺丁脲羟化代谢(Drug Metab Lett，2011，5(1)：17-24)。提示在进行体外混合探针底物共温孵时须避免同时应用此类存在相互作用的底物，或降低底物浓度或采取分组策略。

近年来，“BSA(牛血清白蛋白)效应”在校正体外酶动力学参数方面的报道越来越多，成为体外-体内相关性预测的热门话题，用BSA矫正后的体外表观K_m值进行体外-体内相关性分析所得到的体内肝清除率更接近于药物实测值(2～5倍)。Rowland等(J Pharmacol Exp Ther，2007，321(1)：137-147)研究发现生物膜在体外37℃孵育过程中会释放出一些抑制CYPs活性的长链不饱和脂肪酸(如油酸、亚油酸、花生四烯酸等)，而BSA的加入可以封闭这些不饱和脂肪酸在孵育过程中自生物膜的脱落，逆转抬高了的K_m值，俗称“BSA效应”。这种“BSA效应”还存在底物选择性和酶选择性。而目前尚无在混合探针底物体系中纳入BSA作为辅因子的报道。另外，多种有机溶剂及缓冲液对酶活性的影响亦不同。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是：选用多种不同探针底物表征代谢酶活性，并综合考虑缓冲液、有机溶剂、辅因子对酶活性的影响及底物相互作用等因素，优化混合探针底物孵育体系，以用于新药研发早期的代谢酶抑制效应快速筛选。

为解决上述问题，本发明提供如下技术方案，包括：

底物选择：依据各亚型酶特性选择一种或多种探针底物表征酶活性。

缓冲液考察：分别考察在Tris-HCl缓冲体系和PBS缓冲体系中CYP450各亚型酶活性。

溶剂效应考察：考察孵育体系中有机溶剂(甲醇、乙腈)的比例为0.5％和1％时，对各亚型酶活性的影响。

BSA效应考察：分别考察加入不同浓度BSA(0.5％，1％，2％)与不加BSA相比，各亚型酶的活性变化。

底物相互作用考察：据报道，CYP2B6探针底物安非他酮抑制CYP2C19介导的美芬妥英羟化代谢和CYP2D6介导的右美沙芬去甲基化代谢。由于安非他酮Km值(67-168μM)较高，故考察安非他酮(0，5，10μM)对CYP2C19的另一底物奥美拉唑、CYP2D6的另一底物丁呋洛尔是否存在抑制作用。

样品孵育、处理及测定：将不同亚型特异性探针底物根据上述溶剂效应、缓冲液、BSA效应以及底物相互作用等进行分组孵育20min后，冰浴终止反应并加入含内标的沉淀剂，离心后取各组上清等体积混匀后LC-MS/MS测定。

本发明的有益效果：

本发明所建立的方法综合考虑了底物的选择、底物之间的相互作用、缓冲液、有机溶剂以及一些温孵系统辅因子对酶活性的影响等，希望降低体外混合探针底物法预测药物相互作用的假阴性发生率，提高预测结果的准确性；且能同时筛选化合物对九种主要CYP450亚型的抑制效应，提高了筛选通量。

附图说明

图1：Tris-HCl缓冲体系和PBS缓冲体系中酶反应活性比较

图2：有机溶剂甲醇、乙腈对主要CYP450酶活性的影响

图3：BSA对不同底物表征的代谢酶反应速率影响

图4：安非他酮对丁呋洛尔和奥美拉唑表征的代谢酶反应速率影响

具体实施方式

本发明通过下面的实施例进行详细的解释，但并不意味着本发明仅限于此。

1底物选择

如前所述，混合探针底物法通常选取一种特异性探针底物表征酶活性，但对于CYP3A4和CYP2C9等存在多个结合位点的亚型而言，应选择多个结构不相关的底物表征酶活性。除多结合位点现象外，CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6等亚型还存在抑制效应的底物 依赖性。因此，本发明所建立的筛选方法中，尤其对于CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6与CYP3A4，选择两种或者两种以上结构不相关的探针底物表征代谢酶活性(详见表1)，以提高体外结果的可靠性以及体内预测的准确性。

表1 九种主要CYP450酶亚型及其所选特异性探针底物

2体外孵育体系优化

2.1实验材料

人肝微粒体(HLM)购自瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司，微粒体蛋白浓度为10mg/500μl。Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、KCl、MgCl₂·6H₂O购自南京化学试剂有限公司，Tris-base购自Biosharp公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)、牛血清白蛋白(BSA)、邻甲苯海拉明(mephenamine)购自Sigma公司。甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)购自Merck公司。特异性探针底物非那西丁(phenacetin)、香豆素(coumarin)、紫杉醇(paclitaxel)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)、美芬妥英(S-Mephenytoin)、奥美拉唑(omeprazole)、丁呋洛尔(bufuralol)、氯唑沙宗(chlorzoxazone)、尼非地平(ni6edipine)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)；安非他酮(bupropion)购自Toronto Research Chemicals(Toronto，Canada)；双氯芬酸(diclofenac)、右美沙芬(dextromethorphan)购自 damas-beta(Adamas Reagent Co.Ltd)；睾酮(testosterone)购自International Laboratory USA；咪达唑仑(midazolam)购自中国药品生物制品检定所。

磷酸盐缓冲液(PBS)：0.1M KCl-磷酸盐缓冲液：含0.1M KCl、0.1M Na₂HPO4、0.1M NaH₂PO4；pH＝7.4。

Tris-HCl缓冲液：含Tris-base 0.1M，pH＝7.5。

NADPH能量再生系统(NRS)：含10mM G-6-P、1.0mM NADP⁺、2.0U/mL G6PDH

2.2缓冲液考察 

2.2.1实验方法

分别在Tris-HCl缓冲体系和PBS缓冲体系中考察CYP450各亚型酶活性。200μl孵育体系包括：人肝微粒体(蛋白终浓度0.2mg·ml^-1)、特异性探针底物、PBS(pH＝7.4)或Tris-HCl(pH＝7.5)缓冲液、MgCl₂(10mM)、10mM G-6-P、1.0mM NADP⁺、2.0U/mL G6PDH；先将底物与人肝微粒体在37℃水浴中预热5min，然后加入NRS溶液(37℃水浴预热)启动反应，待20min后加入100μl含内标(邻甲苯海拉明)乙腈(0℃冰浴预冷)终止反应并沉淀蛋白。随后充分振荡3min，以18000rpm离心10min沉淀蛋白，取上清液转移，进样分析。

2.2.2实验结果

缓冲液实验结果如图1所示，CYP2A6(香豆素-7-羟化)、CYP2C19(美芬妥英-4’-羟化)、CYP2B6(安非他酮-2-羟化)、CYP2C9(双氯芬酸-4’-羟化)这四种亚型酶活性在Tris-HCl缓冲体系显著高于PBS缓冲体系；而CYP3A4(奥美拉唑-S-氧化)、CYP2E1(氯唑沙宗-6-羟化)则是在PBS缓冲体系酶活性显著高于Tris-HCl缓冲体系；其余代谢酶亚型在两种缓冲体系中酶活性无明显差异。因此对于不同酶亚型而言，在体外温孵实验中建议依据各亚型对缓冲液的敏感度选取合适的缓冲液。

2.3溶剂效应考察 

2.3.1实验方法

分别考察有机溶剂甲醇、乙腈在温孵体系中的比例为0.5％或1％时对酶活性的影响。200μl孵育体系包括：人肝微粒体(蛋白终浓度0.2mg·ml^-1)、特异性探针底物(甲醇或乙腈配制， 控制有机溶剂比例为0.5％或1％，对照组以PBS代替)、PBS(pH＝7.4)缓冲液、MgCl₂(10mM)、10mM G-6-P、1.0mM NADP⁺、2.0U/mL G6PDH；先将底物与人肝微粒体在37℃水浴中预热5min，然后加入NRS溶液(37℃水浴预热)启动反应，待20min后加入100μl含内标(邻甲苯海拉明)乙腈(0℃冰浴预冷)终止反应并沉淀蛋白。随后充分振荡3min，以18000rpm离心10min沉淀蛋白，取上清液转移，进样分析。

2.3.2实验结果

实验结果如图2所示，有机溶剂(甲醇、乙腈)对不同亚型酶活性影响不同，甲醇和乙腈(1％)对大多数底物代谢反应活性几乎无影响，如非那西丁、安非他酮、紫杉醇、美芬妥英、右美沙芬、丁呋洛尔、咪达唑仑、睾酮所表征的代谢酶活性几乎不变。而CYP2E1(香豆素-7-羟化)和CYP2E1(氯唑沙宗-6-羟化)对有机溶剂则较为敏感，1％甲醇可显著降低CYP2E1介导的氯唑沙宗羟化反应活性(33.9％)，1％乙腈可显著降低CYP2A6介导的香豆素羟化反应活性(40％)。提示不同酶亚型对有机溶剂的敏感度不同，且与有机溶剂种类相关。

2.4BSA效应

2.4.1实验方法

分别考察BSA在体系中的浓度为0％，0.5％，1％，2％时，对酶活性的影响。200μl孵育体系包括：人肝微粒体(蛋白终浓度0.2mg·ml^-1)、特异性探针底物、PBS(pH＝7.4)溶液、MgCl₂(10mM)、BSA(浓度0％，0.5％，1％，2％)、10mM G-6-P、1.0mM NADP⁺、2.0U/mLG6PDH；先将底物与人肝微粒体在37℃水浴中预热5min，然后加入NRS溶液(37℃水浴预热)启动反应，待20min后加入100μl含内标(邻甲苯海拉明)乙腈(0℃冰浴预冷)终止反应并沉淀蛋白。随后充分振荡3min，以18000rpm离心10min沉淀蛋白，取上清液转移，进样分析。

2.4.2实验结果

BSA效应实验结果如图3所示，BSA对CYP450的影响存在酶选择性和底物选择性，BSA可加速紫杉醇、甲苯磺丁脲、丁呋洛尔、右美沙芬、香豆素、S-美芬妥英、奥美拉唑(5-羟化反应)、非那西丁、安非他酮等底物的代谢反应速率，降低咪达唑仑、尼非地平、睾酮、双氯芬酸等的代谢反应速率，对奥美拉唑(S-氧化)及氯唑沙宗的代谢反应则无影响。其中尼非地平氧化代谢、睾酮-6β-羟化代谢反应仅在加入高浓度BSA(2％)时降低其反应速率，而对 于双氯芬酸羟化代谢而言，低浓度BSA(0.5％)即可显著降低其反应速率，本研究团队推测这可能与双氯芬酸的高蛋白结合率有关。

2.5底物相互作用考察

2.5.1实验方法

据报道，CYP2B6探针底物安非他酮抑制CYP2C19介导的美芬妥英羟化代谢和CYP2D6介导的右美沙芬去甲基化代谢(Drug Metab Dispos，2000，28(10)，1176-1183；Rapid Commun Mass Spectrom，2005，19(18)，2651-2658)。由于安非他酮Km值(67-168μM)较高，故考察安非他酮(0，5，10μM)对CYP2C19的另一底物奥美拉唑、CYP2D6的另一底物丁呋洛尔是否存在抑制作用。200μl孵育体系包括：人肝微粒体(蛋白终浓度0.2mg·ml^-1)、安非他酮(0μM，10μM，20μM，50μM)、丁呋洛尔(5μM)或奥美拉唑(5μM)、PBS(pH＝7.4)缓冲液、MgCl₂(10mM)、BSA(2％)、10mM G-6-P、1.0mM NADP⁺、2.0U/mL G6PDH；先将底物与人肝微粒体在37℃水浴中预热5min，然后加入NRS溶液(37℃水浴预热)启动反应，待20min后加入100μl含内标(邻甲苯海拉明)乙腈(0℃冰浴预冷)终止反应并沉淀蛋白。随后充分振荡3min，以18000rpm离心10min沉淀蛋白，取上清液转移，进样分析。

2.5.2实验结果

实验结果如图4所示，安非他酮对CYP2D6介导的丁呋洛尔-1’-羟化反应和CYP2C19介导的奥美拉唑-5-羟化反应存在不同程度抑制作用，对后者抑制作用显著(图4)，且安非他酮对奥美拉唑代谢反应的这种抑制作用还存在立体选择性，即对CYP2C19介导的奥美拉唑-5-羟化反应存在抑制作用，而对CYP3A4介导的奥美拉唑-S-氧化作用无影响。因此，在体外孵育N-in-one实验中安非他酮与奥美拉唑、丁呋洛尔不能共存于同一孵育体系。

3底物分组及温孵体系确立

3.1底物分组

根据上述底物相互作用的考察结果并结合缓冲液、有机溶剂、BSA等对酶活性的影响，对九种主要CYP450亚型的特异性探针底物作分组孵育，其中Group I中底物包括甲苯磺丁脲、S-美芬妥英、睾酮和右美沙芬，Group II中底物包括尼非地平、香豆素、咪达唑仑、安非他酮和双氯芬酸，Group III中底物包括氯唑沙宗、非那西丁、奥美拉唑、紫杉醇和丁呋洛 尔。底物浓度的选择依据“在Km值附近或小于Km值”的原则，在保证检测灵敏度的前提下，尽可能选取较低的底物浓度，避免产生药物相互作用。

3.2温孵体系确立 

根据上述缓冲液、有机溶剂、BSA等对酶活性的影响，各组孵育体系分别选取不同缓冲液、不同浓度有机溶剂及BSA，详见表2，至此确立了混合探针底物温孵体系。

表2 九种主要CYP450酶亚型的特异性探针底物分组

4样品孵育、处理及测定

4.1实验材料

人肝微粒体(HLM)购自瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司，微粒体蛋白浓度为10mg/500μl。Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、KCl、MgCl₂·6H₂O购自南京化学试剂有限公司，Tris base购自Biosharp；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)、牛血清白蛋白(BSA)、邻甲苯海拉明(Mephenamine)购自Sigma公司。甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)购自Merck公司。非那西丁(phenacetin)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)、香豆素(coumarin)、紫杉醇(paclitaxel)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)、4-羟基甲苯磺丁脲(4-hydroxytolbutamide)、美芬妥英(S-Mephenytoin)、4’-羟基美芬妥英(4’-hydroxymephenytoin)、奥美拉唑(omeprazole)、丁呋洛尔(bufuralol)、氯唑沙宗(chlorzoxazone)、6-羟基氯唑沙宗(6-hydroxychlorzoxazone)、尼非地平(nifedipine)、氧化尼非地平(oxidizednifedipine)、1’-羟基丁呋洛尔(1’-hydroxybufuralol)、4’-羟基双氯芬酸(4’-hydroxydiclofenac)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)；安非他酮(bupropion)、2-羟基 安非他酮(2-hydroxybupropion)、6α-羟基紫杉醇(6α-hydroxypaclitaxel)购自Toronto Research Chemicals(Toronto，Canada)；5-羟基奥美拉唑(5-hydroxyomeprazole)购自J&K Scientific Ltd；双氯芬酸(diclofenac)、右美沙芬(dextromethorphan)购自damas-beta(Adamas Reagent Co.Ltd)；睾酮(testosterone)、6β-羟基睾酮(6β-hydroxytestosterone)购自International Laboratory USA；咪达唑仑(midazolam)购自中国药品生物制品检定所。1’-羟基咪达唑仑(1’-hydroxymidazolam)、4’-羟基咪达唑仑(4’-hydroxymidazolam)购自Fluka.7-羟基香豆素(7-hydroxycoumarin)购自ChemService Srl.(USA)；奥美拉唑砜(Omeprazole sulfone)购自TLCPharmaChem Inc；右啡烷(dextrorphan)购自BD Biosciences Discovery Labware(Bedford，USA)。醋酸、醋酸铵购自damas-beta(Adamas Reagent Co.Ltd)。

磷酸盐缓冲液(PBS)：0.1M KCl-磷酸盐缓冲液：含0.1M KCl、0.1M Na2HPO4、0.1MNaH2PO4；pH＝7.4。

Tris-HCl缓冲液：含Tris-base 0.1M，pH＝7.5。

NADPH能量再生系统(NRS)：含10mM G-6-P、1.0mM NADP⁺、2.0U/mL G6PDH

4.2样品孵育、处理

200μl孵育体系包括：50μl人肝微粒体(蛋白终浓度0.2mg·ml^-1)，1μl探针底物，1μl抑制剂(NCEs或特异性抑制剂)，98μl PBS(pH＝7.4)或Tris-HCl缓冲液，10μl MgCl₂(10mM)，10μl BSA(0％或1％或2％)，30μl NRS溶液；先将底物与人肝微粒体在37℃恒温水浴中预热5min，然后加入NRS溶液(37℃水浴预热)启动反应，待20min后加入100μl含内标(邻甲苯海拉明)乙腈(0℃冰浴预冷)终止反应并沉淀蛋白。随后充分振荡3min，以18000rpm离心10min沉淀蛋白，分别取三组孵育液一次离心上清各100μl等体积混匀后再离心两次，取上清进样分析。

4.3LC-MS/MS测定

仪器：高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(含岛津超快速液相色谱系统(UFLC-30AD)、岛津8050质谱系统(Shimadzu，Japan)、电喷雾离子源、及LabSolution LCMS Ver.5.6工作站。

色谱条件：色谱柱：Phenomenex Luna C18柱(2.0×150mm，5μm)；柱温：40℃；流动相：水相(A)：含5mmol/L醋酸铵和0.01％醋酸的超纯水；有机相(B)：甲醇∶乙腈(1∶1)；流速：0.5ml/min，分析时间：10.0min，梯度洗脱程序如下：0～0.5min(2％B)、0.5～4.0min(2～45％B)、4.0～6.5min(45～60％B)、6.5～6.8min(60～80％B)、6.8～7.2min(80～80％B)、7.2～7.5min(80～2％B)、7.5～10.0min(2％B)。

质谱条件：正负极高速切换(5msec)，设定源参数分别为：雾化气流量(Nebulizing Gaw Flow)3L/min，加热气流量(Heating Gas Flow)15L/min，接口温度(Interface Temperature)350℃，脱溶剂温度(DL Temperature)250℃，加热块温度(Heat Block Temperature)400℃，干燥器流量(Drying Gas Flow)5L/min。选用多重离子反应监测(MRM)模式，各特异性探针底物代谢物MRM参数见下表3。

本发明建立了各底物相对应的特征代谢产物同时检测的LC-MS/MS方法，其中4-羟基甲苯磺丁脲、4-羟基美芬妥英、6-羟基氯唑沙宗和7-羟基香豆素等四种代谢物采取负离子检测模式，其余代谢物均采用正离子检测模式。6-羟基氯唑沙宗、4-羟基甲苯磺丁脲和4-羟基美芬妥英在负离子模式下响应显著高于正离子模式，因本法尽可能选择较低的底物浓度以期降低底物相互作用的干扰，所以这三种代谢产物选择负离子模式检测。而7-羟基香豆素虽然在正负离子模式下都有良好的质谱响应，但是负离子检测模式下的背景噪音远低于正离子检测模式，所以7-羟基香豆素亦选择负离子检测模式。本实验所建立的方法能够同时测定九种CYP450亚型的酶活性，能够快速筛选化合物对CYP450活性的影响，既省时高效，又经济可行。

5九种人肝CYP450酶体外抑制效应快速筛选方法

对上述所建立的混合探针底物体系进行特异性抑制剂验证试验，通过将结果与单底物体系及已有文献报道数据比较，发现均具有较好的一致性，相关性良好，见表4，表明所建体系可靠可行。利用这种混合探针底物共孵育的方法代替传统单探针底物预测CYP450酶亚型的做法可以很好的满足药物研发早期的高通量要求，适用于对大量候选药物的抑制效应筛选，同时综合考虑底物选择、底物相互作用、溶剂敏感度、缓冲液以及辅因子优化等因素，使这种混合探针底物预测方法更为可靠，为新药开发提供快捷便利的检测手段。

表3.各代谢产物质谱检测MRM参数

表4 特异性抑制剂抑制IC50值：单底物、混合探针底物、文献报道值