一种含N-非取代葡萄糖胺硫酸类肝素二糖的分离分析方法

摘要

本发明公开了一种含N-非取代葡萄糖胺（GlcNH

说明书

技术领域

本发明属于药物、原料药检测领域，具体涉及一种含N-非取代葡萄糖胺（GlcNH₃⁺）硫酸类肝素二糖的分离分析方法。

背景技术

肝素是糖胺聚糖类药物，具有较强的抗凝作用，是目前治疗血栓栓塞性疾病的首选药物。硫酸类肝素和肝素是由己糖醛酸和葡糖胺以1~4糖苷键链接起来的重复的二糖结构单元构成，其中存在十二种具代表性的二糖单元，以含N-乙酰化葡萄糖胺（GlcNAc）残基、含N-硫酸化葡萄糖胺（GlcNSO₃）残基的硫酸类肝素/肝素二糖为主要存在形式，而含N-非取代葡萄糖胺（GlcNH₃⁺）残基的肝素二糖则比较罕见。肝素的抗凝作用与其结构中的一个独特的N-位高度硫酸化的五糖序列有关，因此肝素药物中含GlcNH₃⁺残基的二糖含量变化会显著影响肝素药物的抗凝效果[Robert>3⁺稀有结构出现高浓度的表达，GlcNH₃⁺结构具有抑制类肝素酶的活性，因此有希望成为抗肿瘤活性抑制剂[S.>3⁺硫酸类肝素和肝素二糖的定性定量分析，在肝素药物的质量控制与稳定性研究以及GlcNH₃⁺稀有结构的功能性研究等方面都具有重要的意义。

对于硫酸类肝素/肝素二糖分析检测方法，目前常用的有强阴离子交换高效液相色谱法（SAX-HPLC）、核磁共振法(NMR)、荧光标记法[R.J. Linhardt, et.al, Biochem. J. 322 (1997) 499–506.]、无机硫酸盐合成法[L. Liu, et.al, Carbohydr.Polym. 106 (2014) 343–350.】、亲水作用色谱质谱联用技术（HILIC-MS）[Robert J. Linhardt, et.al, Analytical Biochemistry 461 (2014) 46–48.]等。但这些方法主要用于分析含GlcNAc残基和GlcNSO₃残基的8种硫酸类肝素/肝素二糖，而由于含GlcNH₃⁺残基的硫酸类肝素/肝素二糖在生物样品中的含量微少、分离困难，对其的的定性定量分析检测方法的研究较少。Robert>3⁺残基的再乙酰化同位素标记法测定出了高温高压下肝素酶解产物中含>3⁺残基二糖的含量，但该方法样品前处理复杂，需要用到大型的同位素标记计数仪，且不是直接法测定样品中的含GlcNH₃⁺残基二糖的组分，在实际药物检测应用中有很大的限制。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种含N-非取代葡萄糖胺（GlcNH₃⁺）硫酸类肝素二糖的分离分析方法，能快速检测N-非取代葡萄糖胺硫酸类肝素二糖，其含量对临床药物肝素抗凝效果的影响研究及生物样品二糖组分检测等有重要的作用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种含N-非取代葡萄糖胺硫酸类肝素二糖的分离分析方法的具体步骤如下：

（1）将胺类离子对试剂溶解于去离子水中，用pH调节试剂调pH值至8-8.8，制得浓度为15mM-45mM的流动相A；

（2）将胺类离子对试剂溶解于体积百分比为80%的乙腈溶液中，用pH调节试剂调pH值至8-8.8，制得浓度为15mM-45mM的流动相B；

（3）将待测的含N-非取代葡萄糖胺硫酸类肝素二糖溶解于去离子水中，配制成浓度为250ng/mL的待测溶液，过滤，过ACQUITY UPLC BEH C18柱：流速为0.1mL/min，洗脱梯度为0-30min：100%-85%流动相A、0%-15%流动相B，30min-50min：85%-75%流动相A、15%-25%流动相B，50min-60min：75%-35%流动相A、25%-65%流动相B；PDA检测器在200nm-600nm全波段检测的条件下检测分离色谱图；

（4）通过质谱检测及紫外检测，分别得到紫外检测峰面积和质谱检测峰面积，计算出离子化效率和质谱峰面积校正因子，再计算出含N-非取代葡萄糖胺硫酸类肝素二糖的百分含量。

所述的胺类离子对试剂为己胺。

所述的pH调节试剂为甲酸。

步骤（4）中的质谱采用高效液相色谱串联电喷雾离子阱飞行时间质谱，设定参数为：负离子模式锥孔电压为-3.5kV，干燥气流速为1.5L/min，heatblock & CDL温度为100℃。

本发明的显著优点在于：首次提出了一种能同时分离分析包括四种N-非取代葡萄糖胺肝素二糖在内的12种硫酸类肝素二糖的方法，解决了目前硫酸类肝素二糖分离分析方法的样品前处理过程操作步骤繁琐，在实际样品分析过程中受实际样中杂质的干扰大，且对于带正电荷的含N-非取代葡萄糖胺肝素二糖的分离、定性定量困难，应用范围受限等问题。对于提高硫酸类肝素二糖的检测水平，保障药品安全等方面具有极大的实用价值。

附图说明

图1为十二种硫酸类肝素二糖标准品的紫外检测色谱图。

图2为十二种硫酸类肝素二糖的提取离子流色谱图。

具体实施方式

本发明利用离子对反向高效液相色谱串联电喷雾离子阱飞行时间质谱检测待测样品中的硫酸类肝素二糖组成。通过离子对反向高效液相色谱分离包括四种N-非取代葡萄糖胺肝素二糖在内的十二种硫酸类肝素二糖，并通过电喷雾离子阱飞行时间质谱对十二种硫酸类肝素二糖进行定性定量分析，得到各硫酸类肝素二糖的质谱峰面积校正因子，该校正因子可用于实际样品中硫酸类肝素二糖的定量检测。

一种含N-非取代残基硫酸类肝素和肝素二糖的分离分析方法如下：

（1）将离子对试剂溶解于去离子水，用pH调节试剂调pH值至8~8.8，制得浓度15mM-45mM的流动相A。

（2）将离子对试剂溶解于体积百分比为80%的乙腈溶液，用pH调节试剂调pH值至8~8.8，制得浓度15mM-45mM的流动相B。

（3）将待测的硫酸类肝素二糖标准品溶解于去离子水，配制成浓度为250ng/mL的待测溶液，经过滤后，使用ACQUITY UPLC BEH C18柱（1.7μm，2.1*150mm）：在流速为0.1mL/min，洗脱梯度为0~30min，100%~85%流动相A，0%~15%流动相B，30min~50min，85%~75%流动相A，15%~25%流动相B，50min~60min，75%~35%流动相A，25%~65%流动相B。PDA检测器为全波段检测的条件下进行检测，得到检测器检测波长为232nm时的紫外检测色谱图。

（4）通过各标准二糖单一进样法，得到各标准二糖的出峰时间；

（5）通过紫外检测色谱图及各标准二糖的出峰时间，得到混合样品中各二糖的紫外检测峰面积S₂₃₂。

（6）然后，通过在负离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，提取目标物质分子量，得到提取离子流色谱图。

（7）通过目标分子量的提取离子流色谱图，得到各标准二糖的质谱检测峰面积S_MS。

（8）通过步骤（5）得到的标准物质的紫外检测峰面积S₂₃₂和步骤（7）得到的各标准二糖的质谱检测峰面积，经如下公式计算各标准二糖的离子化效率K和质谱峰面积校正因子f；

ki= S232i/SMSi（i=1、2、3……12)

fi=ki/kt （i=1、2、3……12； t=7）

其中：i为各二糖的编号：

i=1表示的二糖结构为∆HexA-GlcNH₃⁺

i=2表示的二糖结构为∆HexA-GlcNAc

i=3表示的二糖结构为∆HexA-Glc NH₃⁺(6S)

i=4表示的二糖结构为∆HexA(2S)-Glc NH₃⁺

i=5表示的二糖结构为∆HexA-GlcNS

i=6表示的二糖结构为∆HexA-GlcNAc (6S)

i=7表示的二糖结构为∆HexA(2S)-GlcNAc

i=8表示的二糖结构为∆HexA(2S)-Glc NH₃⁺(6S)

i=9表示的二糖结构为∆HexA-GlcNS(6S)

i=10 表示的二糖结构为∆HexA(2S)-GlcNS

i=11 表示的二糖结构为∆HexA(2S)-GlcNAc (6S)

i=12 表示的二糖结构为∆HexA(2S)-GlcNS(6S)

t为计算质谱峰面积校正因子时选取的计为1的二糖的编号，t=7即本方法中质谱校正因子是以∆HexA(2S)-GlcNAc为标准1时的质谱峰面积校正因子；

（9）然后，通过步骤（8）所获得的质谱峰面积校正因子及步骤（7）得到的各标准二糖的质谱检测峰面积S_MS，经如下公式计算待测样品中各二糖组分的百分含量P；

Pi=>MSi*fi/（S_MS1*f1+>MS2*f2+>MS3*f3+……S_MS12*f12）

下面通过具体实施示例对本发明的技术方案做进一步说明，但是并不能以此限制本发明的范围。以下实施例中各试剂若无特别说明，均为市售。

实施例1

利用本技术方案对牛肾硫酸类肝素生物样、市售药物用肝素钠及其经高温高压（121℃）处理的样品的二糖组分进行实例分析。

含N-非取代残基硫酸类肝素和肝素二糖的分离分析方法，步骤如下：

（1）将正己胺溶解于去离子水，用甲酸调pH值至8.8，制得浓度为30mM的流动相A；

（2）将正己胺溶解于体积百分比为80%的乙腈溶液，用甲酸调pH值至8.8，制得浓度为30mM的流动相B；

（3）分别取市售的牛肾硫酸类肝素、市售肝素钠和经高温高压（121℃）处理的肝素钠各20μg，经肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ的混合液彻底酶解后，过滤。使用ACQUITY UPLC BEH C18柱（1.7μm，2.1*150mm）：在流速为0.1mLmin，洗脱梯度为0~30min，100%~85%流动相A，0%~15%流动相B，30min~50min，85%~75%流动相A，15%~25%流动相B，50min~60min，75%~35%流动相A，25%~65%流动相B。质谱参数为：负离子模式锥孔电压：-3.5kV，干燥气流速为1.5L/min，heatblock & CDL温度为100℃。通过在负离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，提取目标物质分子量，得到提取离子流色谱图；

（4）通过目标分子量的提取离子流色谱图，得到各目标二糖的质谱检测峰面积S_MS。

（5）通过步骤（4）得到的各目标二糖的质谱检测峰面积S_MS，根据本发明提供的方法计算得到的质谱峰面积校正因子，分别计算牛肾硫酸类肝素、市售肝素钠和高温高压（121℃）处理后彻底酶解二糖的组成（Pi）。

表1 十二种硫酸类肝素二糖的质谱峰面积校正因子

（6）根据由本发明提供的质谱峰面积校正因子，分别计算牛肾硫酸类肝素、市售肝素钠和高温高压（121℃）处理后彻底酶解二糖的组成（Pi），二糖组分表如表2所示：

表2 各类肝素彻底酶解二糖组分表

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。