西番莲种子提取物及含有其的化妆品、药物、皮肤病学和营养学组合物

摘要

本发明涉及含有西番莲种子，优选紫果西番莲种子提取物的组合物。所述组合物有利地为化妆品、药物、皮肤病学或营养学组合物。本发明的主题还为提取西番莲种子优选紫果西番莲种子提取物的方法，以及还为可以通过所述方法获得的提取物。本发明还涉及所述组合物或所述提取物，其用于预防或治疗皮肤、粘膜或皮肤附属器的疾病或病理学病症，用于预防或治疗血管疾病，用于对抗氧化应激，或者用于预防或治疗脂肪组织改变。最后，本发明涉及皮肤、皮肤附属器或粘膜的化妆品护理方法，其目的是改善皮肤、皮肤附属器或粘膜的状况或外观，其包括施用所述组合物或所述提取物。

说明书

技术领域

本发明涉及含有粉色西番莲(Passiflora incarnata)或紫果西番莲(Passiflora  edulis)的西番莲种子，优选紫果西番莲种子提取物的组合物。所述组合物有利地 为化妆品、药物、皮肤病学或营养学组合物。本发明的另一个主题是提取西番莲 种子提取物的方法和利用所述方法能够获得的提取物。本发明还涉及所述组合物 或所述提取物，其用于预防或治疗皮肤、粘膜或皮肤附属器的疾病或病理学病症， 用于预防或治疗血管疾病，用于对抗氧化应激，或用于预防或治疗脂肪组织改变。 最后，本发明涉及皮肤、皮肤附属器或粘膜的化妆品护理方法，其目的在于改善 皮肤、皮肤附属器或粘膜的状况或外观，所述方法包括施用所述组合物或所述提 取物。

背景技术

西番莲

存在约500种西番莲(西番莲属Passiflora)。这些物种通常分布在温暖的、温 和的和热带的地区，特别是分布在美洲，但在亚洲、澳洲和热带非洲也有极少的 分布。

植物学

籽苗具有灌木或攀缘植物的形态。叶互生，有时为单叶、浅裂的叶或掌状复 叶。花可以达到直径9cm，为雌雄同体或雌雄异体，并且是整齐的。它们为白色 或紫色，并且具有被类似于基督的荆棘冠的丝状附属物覆盖的细瓣状附属物。果 实为4至5cm长，卵形，通常为黄色至橙色。最普遍的物种尤其是粉色西番莲(P. incarnata)和紫果西番莲(P.edulis)。

植物化学成分

研究最多的物种是粉色西番莲和紫果西番莲。

粉色西番莲：以黄酮类家族为代表的主要成分大量存在于叶中。其含有高浓 度的异牡荆素。其还含有少量的简单的吲哚生物碱(哈尔满、哈尔明等)，糖类例 如棉子糖、蔗糖、果糖和葡萄糖，以及精油和麦芽酚，其被描述为是该植物发挥 镇静和抗痉挛作用的分子。

紫果西番莲：一种特殊的化合物，西番莲花碱(环丙烷三萜皂苷)已经从干 燥叶子的甲醇提取物中确认(E.Bombardelli等人,1975)。

其含有异荭草素(一种在粉色西番莲中没有发现的黄酮类)和痕量的与粉色 西番莲一样的精油和生物碱。

果肉含有黄酮类，例如夏佛塔苷、异夏佛塔苷、异荭草素、荭草素、异牡荆 素和毛地黄黄酮衍生物(M.L.Zeraik,J.H.Yariwake–2010)，和抗坏血酸(约 60mg/100g)。

果肉还含有糖基化生氰衍生物：野黑樱苷、黑接骨木苷和苦杏仁苷，以及两 种最近确认的扁桃腈–β–芸香苷(D.Chassagne和J.Crouzet,1998；D.S.Seigler, 2002)。

毒理学

生氰成分主要存在于各种西番莲品种的地上部分。

种子性状

种子占紫果西番莲果实的6至12％并且含有：

-多酚，包括白皮杉醇(结构与白黎芦醇类似)和其二聚物荆三棱素B(S. Sano；K.Sugiyama；T.Ito,2011)，具有血管舒张和抗氧化作用的物质。

-油，通过溶剂获得含有18％植物甾醇(0.2％包含菜油甾醇、豆甾醇、谷甾 醇、燕麦甾醇)；60％至73％亚油酸(ω6)，14％至20％油酸和465ppm生育酚(G. Piobom,N.Barou等人,2006；R.de V.V.Lopes等人)。

-糖类和蛋白质

现有技术

用作食物

相信史前时代已经开始食用其果实。在16世纪的秘鲁，高尚的西番莲花已经 被认为是一种治疗剂，并且许多西番莲物种在许多国家仍然在常规治疗实践中使 用。

医药用途

西番莲(通常是地上部分，有时指果实)通常在世界范围内被用作抗焦虑剂、 镇静剂、利尿剂和止痛剂(在“Passiflora:review update.K.Dhawan,S.Dhawan,A. Sharma,2004”中的所有描述)。麦芽酚及其某些衍生物是镇静作用的来源。

对于粉色西番莲这种活性更加恒定和显著。

粉色西番莲的提取物能够逆转吗啡依赖性。

紫果西番莲叶提取物也显示抗炎作用。

各种多酚家族很可能明显有助于紫果西番莲地上部分的蛋白质的抗氧化和抗 糖化作用(M.Rudnicki等人,2007)。

还显示了紫果西番莲果皮的甲醇提取物的抗低血压作用和富含纤维的脱脂种 子提取物的低胆固醇血症作用。

果实的煎剂通过抑制肿瘤入侵、转移和血管生成中涉及的基质金属蛋白酶 (MMP2和MMP9)具有抗肿瘤作用(S.S.Patel,2009)。

护肤化妆品中的应用

在巴西，皮肤使用龙珠果(P.foetida)叶来治疗炎性皮肤疾病。在毛里求斯和 罗德里格斯岛，栓翅爬山虎(P.suberosa)的叶煎剂被用于沐浴以治疗皮肤疾病。

发明内容

申请人已经发现西番莲种子，特别是粉色西番莲和紫果西番莲种子，甚至更 有利地紫果西番莲种子的提取物具有之前没有公开过的化妆品和皮肤病学性质。 特别地，首次应用这种西番莲种子提取物本身的特殊性质。

本发明的主题是一种组合物，其含有西番莲种子，特别是粉色西番莲或紫果 西番莲种子，有利地为紫果西番莲种子的肽和糖的提取物作为活性剂，以及如果 需要，合适的赋形剂。所述组合物有利地为化妆品、药物或皮肤病学组合物。所 述组合物还可以为营养学组合物。所述组合物优选被配制成通过外部局部途径或 经口施用。

“肽和糖的提取物”指主要或基本上含有肽类和糖类的提取物。天然存在于 种子中的蛋白质已经被水解为肽，有利地，所述水解为酶水解。

在本发明文本中，有利地通过酶水解，更有利地在至少一种蛋白酶和至少一 种碳水化物酶的存在下获得肽和糖的提取物。更有利地，能够通过本说明书进一 步描述的方法获得肽和糖的提取物。

在肽和糖的提取物中，肽有利地具有3500Da以下的分子量。这些肽包含存在 于提取物中的所有基于氨基酸的化合物。

根据本发明一个有利的变体，在肽和糖的提取物中，至少90％的肽具有1200 Da以下的分子量。

在肽和糖的提取物中，有利地至少30％的肽，更有利地至少40％的肽，具有 300Da以下的分子量。根据本发明一个有利的变体，30％至50％之间的肽具有300 Da以下的分子量。

有利地，根据本发明，提取物的30％至70％之间，更有利地40％至60％之间 的肽具有300至1200道尔顿之间的分子量。

肽的分子量分布表示为相对于总肽浓度的百分比。

典型地，根据本发明的肽和糖的提取物基本上不含有潜在引起过敏症的残留 蛋白。

根据本发明的提取物有利地含有按重量计10％至90％的肽和按重量计10％至 90％的总糖，该百分比以相对于所述提取物的总重量表示(在任选加入干燥载体 (support)之前)。

在肽和糖的提取物中，肽/糖的重量比有利地在0.75以上，优选在1至2之间。

所述肽和糖的提取物有利地包含按重量计20％至70％，有利地30％至65％， 典型地55％的肽，该百分比以相对于所述提取物的总重量表示。

所述肽和糖的提取物有利地包含按重量计20％至60％，有利地30％至55％， 典型地40％的糖，该百分比以相对于所述提取物的总重量表示。

特别地，所述肽和糖的提取物有利地包含按重量计20％至70％，有利地30％ 至65％的肽，和按重量计20％至60％，有利地30％至55％的糖，该百分比以相对 于所述提取物的总重量表示。

根据本发明的一个优选的方面，所述肽和糖的提取物包含按重量计55％的肽 和按重量计40％的糖，该百分比以相对于添加例如任选的干燥载体之前的所述提 取物的活性成分的总重量表示。余下的5％为矿物质(灰分)和其它各种分子。

根据本发明的一个有利的变体，所述组合物包含以干燥提取物的百分比表示 的，按重量计0.001％至10％，典型地0.01％至5％的提取物。

本发明的另一个主题是一种制备西番莲种子，特别是粉色西番莲种子或紫果 西番莲种子，有利地为紫果西番莲种子的肽和糖的提取物的方法，其包括至少一 个在最佳pH和温度条件下的酶水解步骤，所述酶水解步骤是本领域技术人员已知 的。分散物的酶处理之后可以是热处理(如果需要)以使酶变性。

有利地，根据本发明，所述制备西番莲种子的肽和糖的提取物的方法包括以 下连续的步骤：

a)将磨碎的种子分散于水相，然后

b)酶处理步骤a)中获得的水性分散体，然后

c)如果需要，热处理以使酶变性，和

d)在步骤b)或c)结束时，收集肽和糖的提取物。

在步骤a)中，水相有利地为水。

有利地，通过加入本领域技术人员已知的至少一种蛋白酶和至少一种碳水化 物酶，在最佳pH和温度条件下，进行酶处理(步骤b))。例如，pH在3.0至9.0 之间。温度典型地在20℃至90℃之间。特别地，酶处理接着包括加入碳水化物 酶的步骤b1)，所述碳水化物酶有利地选自果胶酶、纤维素酶、阿聚糖酶、半纤维 素酶、木聚糖酶和β–葡聚糖酶，然后包括加入碱性或酸性蛋白酶的步骤b2)。

根据本发明的方法的水解步骤非常重要，因为其能够将存在于西番莲种子中 的天然蛋白转变为或“切成”肽。该步骤还有利地能够将存在于西番莲种子中的 多糖转变为或“切成”寡糖或单糖。

在所述方法的一个有利的变体中，在步骤a)之前将西番莲种子脱脂。在被分 散(步骤a))前，可以特别在乙醇中将磨碎的种子脱脂。除去脂类改善随后的过 滤、超滤或纳滤步骤。优选地，还可以使用这些种子的油渣饼，即初步油提取的 残留物作为磨碎的种子。可以使用溶剂，使用超临界CO₂技术，或优选地通过机 械压榨，进行油提取。

在步骤d)期间，有利地通过振摇下，有利地在3.0至9.0之间的pH，并且有 利地在20℃至90℃之间的温度，提取在步骤b)结束时获得的分散体来收集肽 和糖的提取物。

在一个有利的变体中，所述方法在步骤b)，或者如果需要的步骤c)，和步骤 d)之间包括另外的过滤和离心步骤，任选地然后是超滤、渗滤或纳滤。

过滤或离心步骤(特别是在膜超滤或渗滤之后)除去残留蛋白。纳滤步骤除 去例如矿物盐或游离氨基酸。

根据本发明的方法有利地包括15kDa超滤步骤，有利地在10kDa至15kDa 之间，其除去任何潜在引起过敏症的残留蛋白。

在本发明一个特别的实施方案中，所述方法在超滤步骤后还包括具有例如100 道尔顿至300道尔顿之间的截留值，有利地130道尔顿至300道尔顿之间的截留 值，典型地200道尔顿至300道尔顿之间的截留值的纳滤步骤，以除去部分矿物 盐或游离氨基酸或单糖。

有利地，例如，可以通过干燥，利用本领域技术人员已知的方法，在麦芽糊 精或阿拉伯树胶纤维( société CNI)型载体存在或不存在下，稳定肽和 糖的提取物。所述载体的比例典型地在按重量计0％至80％的载体变化，该比例为 相对于在液体形式提取物中获得的干物质的重量百分比。优选地，通过冷冻干燥 来干燥提取物以获得细粉末。所述细粉末有利地包含按重量计30％至70％的提取 物的干物质，并用冷冻干燥载体填充至100％。更有利地，所述细粉末包含按重量 计50％来自提取物的干物质和50％的冷冻干燥载体。

优选地，作为例子，可以根据以下方法获得所述肽和糖的提取物：

a)以水中10％干物质的浓度，制备通过压榨脱脂的西番莲种子油渣饼的溶液；

b)通过纤维素酶(例如，来自Lyven的Cellulyve)的作用酶水解碳水化物；

c)然后通过酸性蛋白酶(例如，来自Lyven的Prolyve PAC)水解；

d)热处理以使酶变性；

e)在15kDa膜上离心、超滤和渗滤。该步骤特别能够除去潜在引起过敏症的 残留蛋白；

f)在200Da膜上纳滤。该步骤特别能够除去例如矿物盐或游离氨基酸。

本发明的另一个主题是西番莲种子，特别是粉色西番莲或紫果西番莲种子， 有利地为紫果西番莲种子的提取物，其能够通过上述方法获得。所述提取物符合 如上所定义的规格。特别地，所述提取物有利地含有按重量计10％至90％的肽和 按重量计10％至90％的糖。更特别地，所述提取物包含按重量计20％至70％，有 利地30％至65％的肽和按重量计20％至60％，有利地30％至55％的糖。

所述提取物有利地用作在组合物例如化妆品、皮肤病学或药物组合物中的活 性成分，所述组合物可以包含一种或多种合适的赋形剂。所述组合物可以进一步 包含除西番莲水解物以外的至少一种其它活性化合物。该其它化合物可以选自所 有以下所述的化合物及其功能等价物：

该其它化合物可以特别地选自皮肤病学或化妆品中常规使用的活性剂，例如 润肤剂、保湿活性剂、角蛋白合成活化剂、角质调节剂、角质剥脱剂、重建皮肤 屏障的试剂(皮脂合成活化剂)、过氧化物酶体增殖剂-激活受体(PPAR)激动剂、 RXR或LXR激动剂、皮脂调节剂、抗刺激剂、舒缓剂、抗炎剂、抗氧化剂和抗老 化剂、脱色剂或低脱色剂(hypodépigmentant)、着色剂、脂解剂或脂肪生成抑制 剂或抗橘皮组织或还原剂、无机或有机滤光剂和防晒剂、抗真菌化合物、防腐剂、 抗细菌剂、益生元和益生菌、抗生素、免疫调节剂。

更特别地，在组合中能够使用的用于愈合和/或重建皮肤屏障的试剂有利地为 泛醇(维生素B5)、阿拉伯半乳聚糖、氧化锌、神经酰胺、胆固醇、角鲨烷和磷 脂。

在组合中能够使用的皮脂调节剂有利地选自5-α-还原酶抑制剂。锌(和锌衍 生物例如其葡糖酸盐、水杨酸盐和焦谷氨酸盐)和螺内酯也具有皮脂抑制活性。 其它作用于皮脂质量的脂质源的皮脂调节剂，例如亚油酸也是感兴趣的。

所述抗炎和/或抗刺激和/或舒缓剂可以是阿拉伯半乳聚糖。

在组合中能够使用的防晒活性剂有利地为UVB和/或UVA滤光剂和防晒剂， 例如本领域技术人员已知的无机和/或有机防晒剂或滤光剂，本领域技术人员能够 根据所要求的保护程度调整它们的选择和浓度。

在组合中能够使用的防腐剂例如为在化妆品中通常使用的那些，具有抗菌活 性的分子(伪防腐剂)例如辛酸衍生物，如，例如辛酰基甘氨酸和辛酸甘油酯； 己二醇、乙酰丙酸纳、以及铜和锌衍生物(葡糖酸盐和PCA)。

该其它化合物可以特别地选自植物提取物，特别为：

-植物油，例如大豆油和/或菜籽油、鳄梨油(WO2004/012496、 WO2004/012752、WO2004/016106、WO2007/057439)、羽扇豆油和有利地为甜白 羽扇豆油(WO98/47479)、或这些油的混合物；

-动物或植物油特别是向日葵的油蒸馏物或浓缩物，更有利地为向日葵的亚油 酸浓缩物，例如浓缩不皂化物的向日葵油(-WO2001/21150)，由 Laboratoires Expanscience销售，鳄梨油、菜籽油、玉米油型浓缩不皂化物的油， 特别使用它们的保湿和/或润肤、愈合和/或皮肤屏障重建、抗炎和/或抗刺激和/或 舒缓的活性；

-植物或植物油的不皂化物，有利地为鳄梨呋喃()，其能够 通过国际申请WO 01/21605中所描述的方法获得，鳄梨和/或大豆不皂化物，更特 别地为鳄梨呋喃不皂化物和大豆不皂化物的混合物，有利地分别以约1/3-2/3的比 例(例如)，大豆不皂化物(根据国际申请WO 01/51596中描述的方 法获得)，甾醇不皂化物(典型地，相对于不皂化物的总重量，甾醇、甲基甾醇 和三萜醇的含量在按重量计20％至95％之间，优选45-65％的不皂化物)，植物甾 醇、甾醇酯和维生素衍生物，特别使用它们愈合和/或皮肤屏障重建、抗老化、抗 炎的活性；

-肽或植物氨基酸复合物，特别是鳄梨(例如国际申请WO2005/105123中所 描述的那些)，羽扇豆肽(例如国际申请WO2005/102259中所描述的那些)，藜 麦肽(例如国际申请WO2008/080974中所描述的那些)，玛卡肽(例如国际申请 WO2004/112742中所描述的那些)，发酵或非发酵的大豆肽，大米肽(例如国际 申请WO2008/009709中所描述的那些)，特别使用它们的保湿和/或润肤(鳄梨)、 角质调节(羽扇豆、藜麦)、愈合和/或屏障重建(玛卡、藜麦、大豆)、抗炎和/ 或抗刺激和/或舒缓(羽扇豆、藜麦)、抗氧化(鳄梨)、抗老化(羽扇豆、玛卡) 或着色(大米)的活性，五味子属(Schisandra)肽(例如专利申请FR 0955344 中所描述的那些)，大穗金合欢(Acacia macrostachya)种子提取物(例如专利申 请FR 0958525中所描述的那些)，豇豆(Vigna unguiculata)种子提取物(例如专 利申请FR 0958529中所描述的那些)；

-植物糖类，特别是鳄梨糖类(例如申请WO2005/115421中所描述的那些)， 特别使用它们的角质调节、愈合和/或皮肤屏障重建、抗炎和/或抗刺激和/或舒缓的 性质；

-鳄梨油酸丁酯()、5-α还原酶抑制剂(WO 01/52837和WO 02/06205)和典型地在痤疮和头皮屑中观察到的增加的皮脂溢分泌物的调节剂；

-富含多酚的提取物，更特别是鳄梨果实提取物(例如申请FR 1 061 055中所 描述的那些)，玛卡叶子提取物(例如申请FR 1 061 047中所描述的那些)，和 白花菜(Gynandropsis gynandra)的地上部分提取物(例如申请FR 1 061 051中所 描述的那些)，

-羽扇豆醇(FR 2 8 22 821、FR 2 857 596)，特别使用其促进愈合的活性；

-阿苏果油，特别使用其保湿的性质。

该其它化合物可以特别选自噁唑啉类，特别是选自2–十一烷基–4–羟甲基–4– 甲基–1,3–噁唑啉、2–十一烷基–4,4–二甲基–1,3–噁唑啉、(E)–4,4–二甲基–2–正十七 烷–8–烯基–1,3–噁唑啉、4–羟甲基–4–甲基–2–正十七烷基–1,3–噁唑啉、(E)–4–羟甲 基–4–甲基–2–正十七烷–8–烯基–1,3–噁唑啉、2–十一烷基–4–乙基–4–羟甲基–1,3– 噁唑啉(优选2–十一烷基–4,4–二甲基–1,3–噁唑啉，称为OX–100或 WO2004050052、WO2004050079、和WO2004112741)。特别使 用它们的抗炎和/或抗刺激和/或舒缓、抗氧化、着色、免疫调节的活性。

所有这些组合包含除西番莲种子提取物之外的至少一种其它的活性化合物， 并且可以包含两种、三种、四种或更多如上所述的活性化合物。

根据本发明的组合物可以被配制成各种适合于局部应用、口服、直肠、阴道 内、鼻内、耳内或支气管施用，和肠胃外施用的制剂。

根据第一个变体，所述各种制剂适合于局部应用并且特别包括霜剂、乳剂 (émulsion)、乳(lait)、软膏剂、洗剂、油、水性或水-醇或乙醇溶液、粉末剂、 贴剂、喷雾剂、洗发剂、指甲油或任何其它外用的产品。

所述含有具有所指出的规格的西番莲种子提取物的组合物特别旨在用于化妆 品、药物、皮肤病学或营养学用途。

在化妆品、药物或皮肤病学用途的语境中，所述组合物将有利地被配制成适 合于局部应用的制剂。含有肽和糖的提取物的组合物特别旨在用于化妆品、药物 或皮肤病学用途。

在用于食品的语境中，用于营养或美容目的(“美容食品”)，所述组合物将有 利地被配制成适合于口服施用的制剂。

本发明的另一个主题是具有以上所述规格的西番莲种子的肽和糖的提取物在 制备化妆品、药物或皮肤病学组合物、营养学组合物或功能食品中的用途。

功能食品是常规食品，或者看起来是正常饮食的一部分的食品，其具有能够 提供有益的生理学作用的特征，所述生理学作用超越了其常规营养学功能或减少 患慢性病的风险。

因此，本发明的一个主题是含有根据本发明的提取物的功能食品。

本发明的另一个主题是根据本发明的提取物或根据本发明的组合物，其用于 预防和/或治疗：

-皮肤和/或粘膜和/或皮肤附属器的疾病或病理学病症，

-血管疾病，

-脂肪组织改变，

-氧化应激。

特别地，根据本发明的组合物或提取物旨在用于预防和/或治疗过敏性、炎症 或刺激性反应或皮肤、皮肤附属器(头发和指甲)和/或不成熟的、正常或成熟的/ 老化的黏膜(牙龈、牙周膜、生殖粘膜)的屏障或内稳态的病理学病症或疾病。

有利地，根据本发明的组合物或提取物可以被用于预防和/或治疗以下部位的 反应、疾病或病理学病症：

-皮肤，例如痤疮、酒渣鼻或红肿(érythrocouperose)、银屑病、血管疾病、 尿布疹、异位性皮炎、湿疹、接触性皮炎、刺激性皮炎、过敏性皮炎、脂溢性皮 炎(乳痂)、银屑病、敏感性皮肤、反应性皮肤、干燥皮肤(干燥病)、脱水皮肤、 泛红皮肤、皮肤红斑、老化或光老化皮肤、光敏感皮肤、着色皮肤(黑斑、炎症 后色素沉着等)、脱色皮肤(白癜风)、具有蜂窝组织炎的皮肤、松弛皮肤、具有 妊娠纹的皮肤、头皮屑、皲裂、蚊虫叮咬、龟裂特别是乳房龟裂、晒伤、由所有 种类的光线引起的炎症、由化学试剂、物理试剂(例如孕妇的拉伸应力)、细菌试 剂、真菌或病毒试剂、寄生试剂(虱子、螨虫、皮癣、蜱螨、皮肤癣菌)、放射剂 或由先天性免疫缺陷(抗菌肽)或获得性免疫缺陷(细胞、体液、细胞因子)引 起的刺激，和/或

-粘膜，例如具有齿龈炎的牙龈和牙周膜(新生儿敏感性牙龈、由烟草使用引 起的卫生问题等)、牙周病、或具有男性或女性外生殖器或内生殖器区域的刺激的 生殖器粘膜，和/或

-皮肤附属器，例如不成熟的、正常或成熟的指甲(易碎、脆弱指甲等)和毛 发(秃头症、头皮屑、多毛症、皮脂溢皮炎、毛囊炎)，特别是头皮疾病例如雄性 激素的、急性的、局部的、瘢痕的或先天的秃头症，新生儿秃头症，由于化疗/放 疗引起的斑秃，静止期脱发、生长期脱发、毛发营养障碍、拔毛发癖、癣或油性 或干性头皮屑。

本发明还涉及皮肤和/或皮肤附属器和/或粘膜的化妆品护理方法，其目的是改 善皮肤和/或皮肤附属器和/或粘膜的状况和/或外观，所述方法包括在皮肤上施用根 据本发明的组合物或提取物。

特别地，所述化妆品护理方法能够有利地通过局部应用于皮肤和/或皮肤附属 器和/或粘膜来紧致皮肤和降低“桔皮”作用。

本发明涉及一种皮肤的化妆品护理方法，其目的为预防皮肤老化，所述方法 包括在皮肤上应用根据本发明的组合物或提取物。

根据本发明的组合物或提取物还可以有利地用于预防和/或治疗血管疾病，特 别是泛红和疹斑。

根据本发明的组合物或提取物还可以有利地用于预防和/或治疗脂肪组织改 变。脂肪组织改变特别为蜂窝组织炎或“桔皮”作用。根据本发明的组合物能够 紧致皮肤。

可以根据建立适合于患者或动物的药物治疗，特别是皮肤病学、化妆品或兽 医治疗所通常考虑的标准，例如患者或动物的年龄或体重、患者或动物的一般病 症的严重度、对于治疗的耐受性、显著的副作用和皮肤类型，来确定根据本发明 的化合物和组合物的施用模式、给药方案和最佳的药物形式。取决于所需要的施 用类型，根据本发明的组合物和/或活性化合物可以进一步包括至少一种药学上可 接受的载体，特别是皮肤病学上可接受的载体或化妆品学上可接受的载体。根据 第一个变体，使用适合于外部局部应用的载体。根据本发明的组合物可以进一步 包含至少一种本领域技术人员已知的药物或化妆品佐剂，其选自增稠剂、防腐剂、 芳香剂、着色剂、化学或无机过滤剂、保湿剂、温泉水等。

具体实施方式

以下实施例阐明本发明。

实施例1：根据本发明的提取物

根据以下方法获得肽和糖的提取物：

a)以水中10％干物质的浓度，制备通过压榨脱脂的紫果西番莲种子油渣饼的 溶液；

b)通过纤维素酶(Cellulyve，来自Lyven)的作用酶水解碳水化物；

c)然后通过酸性蛋白酶(Prolyve PAC，来自Lyven)水解；

d)热处理以使酶变性；

e)在15kDa膜上离心、超滤和渗滤以除去潜在引起过敏症的残留蛋白；

f)在200Da膜上纳滤以除去矿物盐或游离氨基酸或单糖；

g)收集肽和糖的提取物。

由此获得的液体肽和糖的提取物具有以下特征：

1–物理化学分析(总干物质的百分比)

2–肽的分子量分布状况

实施例2：局部应用的组合物

下面呈现几种局部应用的组合物。可以将西番莲种子的肽和糖的提取物，实 施例1，合并入各种化妆产品中，例如洁面乳、水包油乳液、油包水乳液、油、乳、 化妆水、洗发剂、发泡产品和喷雾剂，其组成举例呈现如下。

保湿洁面乳

原料/商品名或INCI名称 ％ 净化水 适量至100％ 生物糖胶 1至5％ 丁二醇 1至5％ 透明质酸 0至5％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.001％至10％ 防腐剂 0至1％ 一水合柠檬酸 0至1％ 氨丁三醇 0至1％

针对敏感性皮肤的洁面乳

原料/商品名或INCI名称 ％ 辛酰基甘氨酸 0至1％ 氢氧化钠 0至1％ 螯合剂 0至1％

丁二醇 1至5％ β-胡萝卜素 0至2％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.001％至10％ 防腐剂 0至1％ PEG–32 1至5％ PEG–7椰油酸棕榈酯 1至5％ 葡萄糖酸锌 0至1％ 柠檬酸 0至1％ 净化水 适量至100％ 芳香剂 0至1％ 泊洛沙姆184 1至5％

抗老化乳液

原料/商品名或INCI名称 ％ 液体异链烷烃 5至20％ 异鲸蜡醇硬脂酸酯 5至20％ AL-MG羟基硬脂酸酯 5至20％ ABIL WE 09 1至5％ 甘油 1至5％ 矿物油 1至5％ 微粉化氧化锌 1至5％ 丁二醇 1至5％ 视黄醇 0至1％ 维生素C 0至5％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.01至10％ 异壬酸异壬酯 1至5％ 蜂蜡 1至5％ 酒石酸钠 1至5％ 氯化钠 0至5％ 甘氨酸 1至5％ 防腐剂 0至1％ 胆固醇 0至1％ 植物鞘氨醇 0至1％ 酒石酸 0至1％ 净化水 适量至100％

重建乳液

原料/商品名或INCI名称 ％ 氢化聚癸烯 5至20％ 月桂基葡糖苷–甘氨酸硬脂酸酯 1至5％ 碳酸二辛酯 1至5％ 甘油 5至20％ 卡波普 0至1％ 黄原胶 0至1％ 亚细亚酸 0至1％ 维生素B5 0至5％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.01至10％ 氢氧化钠 0至1％ 防腐剂 0至1％ 柠檬酸 0至1％ 净化水 适量至100％

纤体油

原料/商品名或INCI名称 ％ 增溶剂 0至1％ 甜杏仁油 5至20％ 椰子核辛酸酯/癸酸酯 适量至100％ 精炼夏威夷果 5至20％ 甘油辛酰基癸酸酯 5至20％ 天然α没药醇 0至1％ α生育酚 0至1％ 常春藤提取物 0至5％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.01至10％ 防腐剂 0至1％ 酯 0至1％

针对干燥、过敏性皮肤的乳

原料/商品名或INCI名称 ％ 甜杏仁油 1至5％ 玉米油 1至5％ 硬脂酸 1至5％ C16 C18鲸蜡醇 0至1％ 止泡剂70414 0至1％ 月桂醇11OE 1至5％

PEG 300单月桂酸酯 0至1％ 甘油单油酸酯 0至1％ 甘油单硬脂酸酯 1至5％ 维生素B12 0至5％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.1至10％ 防腐剂 0至1％ 柠檬酸 0至1％ 柠檬酸三钠 0至1％ 净化水 适量至100％ 芳香剂 0至1％ 花生油 1至5％ 氢化棕榈油 1至5％

泡沫

原料/商品名或INCI名称 ％ 净化水 适量至100％ 月桂酰两性基乙酸盐 5至20％ 椰油基葡糖苷 5至20％ 表面活性剂1 5至20％ 表面活性剂2 5至20％ PEG 6000二硬脂酸酯 1至5％ 防腐剂 1至5％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.001％至10％ 洋甘菊提取物 1至5％ 一水合柠檬酸 0至1％ 螯合剂 0至1％ 芳香剂 0至1％ 氢氧化钠 0至1％

舒缓喷雾剂

原料/商品名或INCI名称 ％ 净化水 适量至100％ 三月桂醇醚–4磷酸盐 1至5％ 碳酸二辛酯 1至5％ 丁二醇 1至5％ 赤藓醇基酯 1至5％ 液体矿物油 1至5％

乳木果油 0至1％ 植物油 0至1％ 防腐剂 0至1％ 番茄红素 0至5％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.01至10％ 氢氧化钠 0至1％ 芳香剂 0至1％ 黄原胶 0至1％ 卡波普 0至1％ 螯合剂 0至1％ 柠檬酸 0至1％

净化洁面霜

原料/商品名或INCI名称 ％ 净化水 适量至100％ ARLATONE 10至30％ 椰油基葡糖苷 5至20％ 羟丙基瓜尔胶 1至5％ 辛酰基甘氨酸 0至2％ 防腐剂 0至2％ 芳香剂 0至1％ 柠檬酸 0至1％ PCA锌 0至1％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.001％至10％

抗痤疮乳液

原料/商品名或INCI名称 ％ PEG 40硬脂酸酯 1至5％ PEG 5甘油硬脂酸酯 1至5％ 石蜡 1至5％ 甘油单硬脂酸酯 1至5％ 失水山梨醇硬脂酸酯 0至2％ 鲸蜡醇 0至2％ DI–苹果酸酯醇 5至20％ 维生素E 0至1％ 维生素B3 0至5％ 亚油酸 0至1％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.01至10％

丁二醇 1至5％ PIROCTOLAMINE 0至1％ 防腐剂 0至1％ 甘油 1至10％ 黄原胶 0至1％ PCA锌 0至2％ 米淀粉 1至5％ 尼龙6 0至2％ 聚丙烯酰胺凝胶 1至5％ 维生素B6 0至1％ 芳香剂 0至1％ 净化水 适量至100％

抗泛红乳液

原料/商品名或INCI名称 ％ PEG 40硬脂酸酯 1至5％ PEG 5甘油硬脂酸酯 1至5％ 石蜡 1至5％ 甘油单硬脂酸酯 1至5％ 失水山梨醇硬脂酸酯 0至2％ 鲸蜡醇 0至2％ DI–苹果酸酯醇 5至20％ 马栗树糖苷 0至2％ 槐米(SOPHORA JAPONICA) 0至5％ 维生素E 0至1％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.01至10％ 丁二醇 1至5％ PIROCTOLAMINE 0至1％ 防腐剂 0至1％ 甘油 1至10％ 黄原胶 0至1％ PCA锌 0至2％ 米淀粉 1至5％ 尼龙6 0至2％ 聚丙烯酰胺凝胶 1至5％ 维生素B6 0至1％ 芳香剂 0至1％

净化水 适量至100％

修复护理

原料/商品名或INCI名称 ％ PEG 40硬脂酸酯 1至5％ PEG 5甘油硬脂酸酯 1至5％ 石蜡 1至5％ 甘油单硬脂酸酯 1至5％ 失水山梨醇硬脂酸酯 0至2％ 鲸蜡醇 0至2％ DI–苹果酸酯醇 5至20％ 维生素E 0至1％ 辅酶Q10 0至2％ 神经酰胺 0至5％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.01至10％ 丁二醇 1至5％ PIROCTOLAMINE 0至1％ 防腐剂 0至1％ 甘油 1至10％ 黄原胶 0至1％ PCA锌 0至2％ 米淀粉 1至5％ 尼龙6 0至2％ 聚丙烯酰胺凝胶 1至5％ 维生素B6 0至1％ 芳香剂 0至1％ 净化水 适量至100％

脱色乳液

原料/商品名或INCI名称 ％ 异壬酸异壬酯 1至10％ 异鲸蜡醇硬脂酸酯 1至10％ PEG 40硬脂酸酯 1至5％ PEG 5甘油硬脂酸酯 1至5％ 防腐剂 0至1％ C16 C18鲸蜡醇 0至2％ PPG/SMDI聚合物 0至1％ 水杨酸 0至2％

角鲨烷凝胶 0至2％ 二辛醚 1至10％ DI–苹果酸酯醇 1至10％ 向日葵提取物 1至10％ 氨丁三醇 1至5％ 丁二醇 1至10％ 柠檬酸三钠 0至1％ 菌核胶 0至1％ 米淀粉 1至10％ 聚丙烯酰胺凝胶 0至1％ 维生素C 0至2％ 甘氨酸 0至2％ 芳香剂 0至1％ 维生素E 0至2％ 柠檬酸 0至1％ 十一碳烯酰基苯丙氨酸 0至2％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.01至10％ 净化水 适量至100％

抗菌滚珠棒

原料/商品名或INCI名称 ％ 净化水 适量至100％ 丁二醇 1至5％ 过氧化苯甲酰 0至2％ 辛酰基甘氨酸 0至5％ PCA锌 0至5％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.1至10％ 卡波姆 0至2％ 防腐剂 0至1％ 柠檬酸 0至1％ 氨丁三醇 0至1％

磨砂膏

原料/商品名或INCI名称 ％ ARLATONE DUO 5至20％ 去角质剂 1至10％ 菌核胶 1至10％

防腐剂 0至1％ 辛酰基甘氨酸 0至1％ 苏打 0至1％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.01至10％ 螯合剂 0至1％ 柠檬酸 0至1％ 净化水 适量至100％ 芳香剂 0至1％

角质化液

原料/商品名或INCI名称 ％ 鲸蜡醇 1至5％ 硅酮345 1至5％ 抗氧化剂 0至1％ 净化水 适量至100％ 西曲氯铵 0至5％ 奎宁 0至5％ 维生素B5 0至5％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.01至10％ 水解小麦蛋白 0至1％ 防腐剂 0至2％ 芳香剂 0至1％ pH调节剂 0至1％

去头屑洗发剂

原料/商品名或INCI名称 ％ 净化水 适量至100％ 月桂酰两性基乙酸盐 5至20％ 椰油基葡糖苷 5至20％ PEG 6000二硬脂酸酯 1至5％ 防腐剂 0至2％ 维生素F 0至5％ 吡罗克酮乙醇胺盐 0至2％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.01至10％ 吡硫锌 0至1％ pH调节剂 0至1％ 螯合剂 0至1％

芳香剂 0至1％

柔顺液

强化毛细血管化妆水

原料/商品名或INCI名称 ％ 净化水 适量至100％ 甲基丙二醇 5至20％ 防腐剂 0至2％ pH调节剂 0至1％ 芳香剂 0至1％ 生物素 0至5％ 维生素B9 0至5％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.01至10％ β-谷甾醇 0至1％ 椰油酸乙基己基酯 0至5％ PEG–40蓖麻油 0至5％

光防护棒

原料/商品名或INCI名称 ％ 蓖麻油 适量至100％ 油醇 10至20％ 棕榈油 10至20％ 聚甘油–3–蜂蜡 10至20％ 小烛树蜡 10至20％ 水辉石 10至20％ 二氧化钛 0至5％

西番莲的肽和糖的提取物 0.01至10％ 乳木果油 0至5％ 维生素E 0至1％

SPF 50+防晒霜

原料/商品名或INCI名称 ％ B4净化水 适量至100％ 三氧化钛 10至20％ 环戊硅氧烷 5至15％ 棕榈酸辛酯 5至15％ C12–C15烷基苯甲酸酯 5至10％ 戊酸癸酯 5至10％ 氧化锌 5至10％ 甘油 1至5％ PEG–45/十二烷基乙二醇共聚物 1至5％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.01至10％ 氯化钠 1至5％ 环糊精棕榈酸酯 1至2％ 维生素E 0至2％ 防腐剂 0至2％ 羟丙基瓜尔胶 0至1％ 芦荟汁 0至1％ 氢氧化钠 0至1％ EDTA 2 Na 0至1％ 葡萄糖酸锌 0至1％

SPF 50+防晒喷雾

原料/商品名或INCI名称 ％ 甘油辛酰基癸酸酯 5至20％ 环戊硅氧烷 10至20％ 碳酸二辛酯 5至20％ 天来施S 1至10％ 三氧化钛100 10至20％ 水辉石 0至5％ α生育酚 0至2％ 月桂基葡糖苷–甘氨酸硬脂酸酯 0至10％ B4净化水 适量至100％

柠檬酸 0至2％ 戊二醇 0至5％ 甘油 0至5％ 黄原胶 0至2％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.01至10％ 芦荟汁 0至1％ 葡萄糖酸锌 0至1％ 防腐剂 0至2％ 天来施M 1至10％

针对脆弱和易碎指甲的涂剂

原料/商品名或INCI名称 ％ 丙烯酸酯类共聚物 15至30％ 乙醇 适量至100％ 丙酮 5至20％ 西番莲的肽和糖的提取物 0.01％至5％

实施例3：用于口服施用的组合物

紫果西番莲提取物可以有利地合并入口服组合物中，典型地合并入允许每天 施用50mg至200mg紫果西番莲提取物的组合物中。

1/软胶囊形式的抗妊娠纹组合物

以每天四至六粒500mg胶囊施用该组合物。

2/抗脱发片剂

3/纤体粉末棒的实施例

该组合物每日施用两次。

该组合物每日施用两次。

4/巧克力味谷物棒的实施例

5/香草味谷物棒的实施例

6/果仁糖味乳类饮料的实施例

实施例4：根据本发明的提取物的生物活性的测试

实施例1的西番莲的肽和糖的提取物在以下实施例中被称为西番莲水解产物。

A–在正常人角质细胞(KHN)上的活性筛选

通过测试KHN培养物上基因表达的调变来评估西番莲水解产物的生物活性： 在含有43376个基因序列的安捷伦全基因组微阵列芯片上研究表达谱。

a–材料和方法

培养KHN 24小时，然后以0.05％干物质浓度用西番莲水解产物处理。以交错 方式处理角质细胞(72h、24h、6h)以使得每个分析点被培养相同的时间，72+24 小时。

通过定量RT–PCR评估所选择的基因的表达。

针对每个基因和每个处理条件计算处理样品对比于对照的强度比(R_i)。

b–结果

被认为是显著的结果是那些每个动力学时间点但也是在两个连续的时间3-6h 或6-24h处R_i>2的结果。

显示如下：

抗凋亡作用，表示为西番莲水解产物抑制转录因子ATF3，其本身为GADD 家族的促凋亡基因，和其它应激可诱导的促凋亡基因例如DDIT4、FANCE、IRS2 及其靶点FOXO3的转录因子。

对于细胞增殖的活化剂作用(effet activateur)，其通过诱导细胞周期蛋白 CCNB1、CCND1和细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1的基因而发生。该观察结果由 诱导在各种细胞活化相关机制中涉及的基因支持，所述细胞活化相关机制例如 DNA(法语缩写为ADN)复制(RFC4、TIPIN)、有丝分裂(CDCA7、CDCA8)、 剪接(SF3A3、SRSF7)、RNA(法语缩写为ARN)转录(POP1)和蛋白质翻译 (WDR3、NOP56、MRTO4)。

对于甾醇生物合成的活化剂作用，提示对于角质层且因此对于表皮屏障的保 护活性。其通过激活以下基因发生：ACAT1、ACAT2、HMGCS1、HMGCR、MVD、 FDPS、FDFT1、SQLE、LSS、MSMO1/SC4MOL、DHCR、EBP、DHCR7、LIPA 和SOAT1。

对于抗氧化机制的活化剂作用，其通过诱导金属硫因MT1A、MT1B、MT1E、 MT1F、MT1G、MT1H、MT1L、MT1M、MT1X、MT2A，刺激谷胱甘肽生物合 成中涉及的几种酶：GSTA4、GSTM3、MGST2、GPX1、GPX2、GPX8、GSS、 PRDX1或超氧化物歧化酶SOD1的基因，和刺激MAFB、ATF3和JUN编码的几 种转录因子的基因，刺激通过结合至抗氧化反应元件(ARE)和缺氧反应元件 (HRE)基序对于氧化应激反应很重要的因子的基因而发生。

B–在正常人纤维母细胞(FHN)上筛选活性

通过测试FHN培养物上基因表达的调变评估西番莲水解产物的生物活性。因 此，在西番莲水解产物的存在下于培养基中，通过qRT–PCR研究真皮生物学中涉 及的46个基因的表达、结蹄组织的重建和老化、以及表皮关键功能中涉及的46 个基因，所述表皮关键功能例如与皮肤含水量、抗氧化反应、或黑色素细胞着色 有直接关系的屏障功能。

a–材料和方法

将西番莲水解产物稀释于培养基中。用0.01％和0.05％西番莲水解产物处理 FHN培养物24小时(使用对照分子，TGFβ1)。应用结束时，通过qRT–PCR分析 基因表达的差别。由西番莲水解产物诱导的基因表达的改变表示为相对于对应于 未经处理的培养物的条件的相对数量(RQ)(如果RQ>1：刺激基因表达，和RQ<1： 抑制基因表达)。

b–结果

对于抗氧化机制的活化剂作用

0.01％西番莲水解产物诱导MSRA(线粒体肽蛋氨酸亚砜还原酶A)(一种已 知具有抗氧化能力的线粒体酶)的基因表达。

相似地，0.05％西番莲水解产物诱导NQO1(NAD(H)脱氢酶醌1)(一种具有 与超氧化物歧化酶相同活性的抗氧化酶)的基因表达。

通过增加MSQRA和NQO1，西番莲水解产物使得人真皮的纤维母细胞对于 氧化损伤更耐受，所述氧化损伤是细胞老化的原因从而使皮肤老化。

对于细胞外基质的化合物的作用

0.01％和0.05％西番莲水解产物诱导编码多配体聚糖1的SDC1基因的表达， 所述多配体聚糖1是组织内聚力中起决定性作用的跨膜蛋白聚糖。

表1

C–在黑化的重建皮肤上筛选活性

通过在黑化的重建皮肤上测试基因表达调变评估西番莲水解产物的生物活 性。因此，在西番莲水解产物的存在下于培养基中，通过qRT–PCR研究真皮生物 学中涉及的46个基因的表达、结蹄组织的重建和老化、以及表皮关键功能中涉及 的46个基因，所述表皮关键功能例如与皮肤含水量、抗氧化反应、或黑色素细胞 着色有直接关系的屏障功能。

a–材料和方法

将西番莲水解产物稀释于培养基中。用0.01％和0.05％西番莲水解产物处理 皮肤样品24小时(使用对照分子，TGFβ1)。应用结束时，通过qRT–PCR分析基 因表达的差别。由西番莲水解产物诱导的基因表达的改变表示为相对于对应于未 经处理的培养物的条件的相对数量(RQ)(如果RQ>1：刺激基因表达，和RQ<1： 抑制基因表达)。

b–结果

对于真皮/表皮内聚力中涉及的基因的作用

0.05％西番莲水解产物诱导LAMC2(编码层粘连蛋白C2的基因)的表达； 因此西番莲水解产物能够有助于加强真皮-表皮接合并因此促进皮肤的紧致。

对于皮肤屏障功能中涉及的基因的作用

0.05％西番莲水解产物诱导编码外皮蛋白(IVL)的基因的表达，所述外皮蛋 白是一种在角质细胞启动和成熟中涉及的角膜包膜的结构蛋白，因此其在皮肤屏 障功能中起重要作用。其还刺激水合作用和屏障功能中也涉及的丝聚合蛋白(FLG) 基因的表达。

对于其它基因的作用

西番莲水解产物减少黑色素生成过程中涉及的MC1R的表达，炎症应答中涉 及的PTGS2的表达，和BIRC5，抗凋亡因子和干细胞标记物的表达。

表2

D.对于人脂肪组织脂类分解的作用

人白色脂肪组织通过向生物体的其它组织提供由脂肪细胞脂类分解过程释放 的脂肪酸形式的能量分子而发挥基本代谢功能。脂肪细胞通过储存在脂肪酸中的 三酸甘油酯的水解和甘油调动其能量储备。因此，血液中释放的脂肪酸可以被其 它组织用作能量来源。

通过分析在三维系统中培养的储存在成熟人脂肪细胞中的三酸甘油酯水解期 间释放的甘油来评估西番莲水解产物对于脂肪细胞脂类分解的作用。

a)材料和方法

在西番莲水解产物的存在下，于37℃孵育从四名正常体重或超重女性供者的 皮下脂肪组织的活组织检查分离的成熟脂肪细胞4小时。使用比色法分析释放的 甘油，并且将获得的值归一化为DNA的量。通过单因素方差分析和随后的邓尼特 检验(Dunnett’s test)对结果进行统计学上比较。

b)结果

结果呈现于下表中：

表3

0.005％西番莲水解产物显著刺激甘油释放，显示对于脂肪细胞脂类分解的活 化剂作用。

E.抗酪氨酸酶活性

酪氨酸酶是黑色素合成中的关键酶。该酶的特异性抑制剂能够导致黑色素合 成的抑制，因此产生脱色作用。

评估西番莲水解产物对于从人黑色素细胞提取的酪氨酸酶的活性(无细胞试 验)。

a)材料和方法

将西番莲水解产物和测试标准物(曲酸)与酶提取物(酪氨酸酶)放在一起 并在冰上孵育10分钟。在孵育结束时，加入底物L–DOPA(2mM)并将样品于 37℃孵育1小时。通过比色法(在540nm处读取光密度)评估酶活性。结果表示 为酪氨酸酶活性的百分比并且使用学生t检验对结果进行统计学上比较。

b)结果

结果呈现于下表：

表4

西番莲水解产物以清楚且浓度依赖的方式抑制酪氨酸酶的酶活性 (IC₅₀＝0.16％)。

F.对抗氧化应激的保护作用

无论是内源性诱导还是外源性诱导(烟草使用、大气污染、UV辐射)的氧化 应激均是很多皮肤疾病的原因。事实上，通过产生自由基，氧化应激能够改变皮 肤细胞的各种成分：蛋白质、脂质、细胞核和线粒体DNA。在经历氧化应激的细 胞中通过首先评估西番莲水解产物调节自由基产生的能力和其次评估其对抗脂质 的过氧化反应的保护作用，来确认西番莲水解产物的抗氧化作用。

1.对角质细胞中活性氧产生的作用

通过测量产生的活性氧的量评估西番莲水解产物对于由角质细胞中的过氧化 氢(H₂O₂)产生的氧化应激的抗氧化作用。该测试基于破坏活性氧(ROS)并与 活性氧接触发荧光的探针(DCFH–DA)的使用。因此，发射的荧光与对于氧化应 激反应的细胞产生的ROS的量成比例。

a)材料和方法

在西番莲水解产物或参照分子：10μM槲皮素或500μM维生素C的存在下， 将正常人角质细胞预孵育24小时。然后，仍然在西番莲水解产物或参照分子的存 在下，在探针DCFH–DA存在下将细胞孵育1小时，然后用100μM H₂O₂处理20 分钟。通过测量发射荧光进行ROS分析。将结果归一化为使用平行进行的中性红 摄入试验确定的活细胞数目。因此发射的ROS的量表示为荧光强度(DFU)/由性红 试验产生的光密度(OD₅₄₀)(法语缩写为DO₅₄₀)。通过单因素方差分析和随后的图 基检验(Tukey’s test)对结果进行统计学上分析。

b)结果

结果呈现于下表：

表5

西番莲水解产物强烈地且以非常显著的方式抑制由H₂O₂应激诱导的ROS的 产生。

2.对于脂质过氧化反应的保护作用

在UV-辐射的Jurkat细胞中评估西番莲水解产物对于脂质过氧化反应的保护 作用。

a)材料和方法

在西番莲水解产物或参照物(50μM BHT)存在或不存在下，在特异性测量 脂质过氧化物的荧光探针(C11–氟)的存在下，孵育Jurkat细胞45分钟。该荧光 探针是融入膜的脂质类似物并且当被过氧化时其荧光强度降低。然后，在西番莲 水解产物或参照物存在下，用UV辐射(UVB 240mJ/cm²+UVA 3.5J/cm²)细胞。 辐射结束时，在用流式细胞术分析前，于37℃孵育细胞30分钟。获得的荧光强 度结果表示为被辐射对照的百分比。

b)结果

结果呈现于下表中：

表6

  脂质过氧化物的量(被辐射对照的％) 保护(％) 对照(无辐射) 46 100 被辐射的(UV)对照 100 0 UV+BHT 83 31 UV+0.05％西番莲水解产物 87 24

0.05％西番莲水解产物保护细胞免于由UV辐射诱导的脂质过氧化反应(24％ 保护)。