一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法

摘要

本发明提供一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法，包括以下步骤：（1）待鉴定茶树种质基因组DNA提取；（2）特定的SSR荧光标记引物合成；（3）以待鉴定茶树种质基因组DNA为模板，利用特定的SSR荧光标记引物进行PCR扩增；（4）PCR扩增产物检测，获得待鉴定茶树种质特定位点上的基因型；（5）分析待鉴定茶树种质基因型。本发明通过简单的实验操作和分析即可筛选出适制乌龙茶的茶树种质，整个过程仅需1-2个工作日即可；在乌龙茶品种选育中应用本发明进行分子标记辅助选择育种，一定程度上可以实现乌龙茶品种定向育种，减少乌龙茶新品种选育的盲目性；应用本发明可初步掌握多个待鉴定茶树种质间的遗传背景与亲缘关系。

说明书

技术领域

本发明属于茶树种质鉴定利用与品种选育领域。具体涉及一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法。

背景技术

简单重复序列（simple sequence repeat，SSR），具有等位变异高、共显性、简便、快速、稳定的特点，目前SSR是茶树种质鉴定、遗传多样性、亲缘关系等研究的主要分子标记之一。从NCBI公共数据库中下载茶树EST序列，利用软件获取EST序列微卫星（SSR）信息，并利用软件将微卫星侧翼保守序列设计成引物，通过初步筛选获得30对有效SSR引物，另收集公开发表的茶树SSR引物328对(Jian-Qiang Ma,Ming-Zhe Yao,Chun-Lei Ma,etc.Construction of a SSR-Based Genetic Map and Identification of QTLs for Catechins Content in Tea Plant(Camellia sinensis).Plos one 9(3): e93131. doi:10.1371/journal.pone.0093131)。

适制乌龙茶的茶树种质主要分布在我国福建、广东、台湾等地（黄福平,梁月荣,陆建良,等.乌龙茶种质资源种群遗传多样性AFLP评价.茶叶科学,2004,24(3):183-189)，按照上述步骤（1）至步骤（4）获得福建以及部分广东、台湾60个茶树种质合计358个位点上的基因型（上述358对SSR引物)。在TM352、TM445位点上这些种质均共包括8种基因型，且呈现规律性的分型特点，4种基因型为适制乌龙茶的茶树种质，其余4种基因型均为不适制乌龙茶的茶树种质，推测TM352、TM445位点与控制茶树种质乌龙茶适制性的基因（quantitative trait locus,QTL）连锁或共分离。

乌龙茶有别于其他茶类的最主要特征是具有自然幽雅的花香，形成这种品质特征的基础是茶树品种。乌龙茶产业的发展，在很大程度上取决于适制乌龙茶的茶树品种的选育与应用，而选育适制乌龙茶的茶树品种，其关键技术是对茶树种质进行乌龙茶适制性鉴定。对茶树种质进行乌龙茶适制性鉴定，至今仍采用直接鉴定法。该方法通过采摘茶树鲜叶加工制做乌龙茶样品，然后对样品进行感官审评确定品质，最后根据品质鉴定结果确定茶树种质乌龙茶适制性。直接鉴定法先要种植茶树种质，一般需要经过2～3年的扩繁与生长，才可进行单株或株系采制试验，品质鉴定需要重复3年。从茶树种植至获得品质鉴定结果至少需要5～6年。直接鉴定法存在鉴定时间长，耗费人力、物力、财力较大，鉴定效率较低等缺点。

将TM352、TM445位点上的4种基因型作为适制乌龙茶的茶树种质的基因型（图1，A、B、C、D；图2，a、b、c、d），可对茶树种质进行乌龙茶适制性快速鉴定。应用这种方法可在茶树生长的幼龄期（苗期）采摘微量的茶树组织（1～2g）进行分子标记基因型鉴定，通过简单的实验操作和分析即可筛选出适制乌龙茶的茶树种质，整个过程仅需要1-2个工作日即可，相比直接鉴定法（5～6年）极大的缩短了鉴定周期，可以减少乌龙茶品种选育过程人力、物力、财力的浪费。应用本方法进行分子标记辅助选择育种（Molecular Marker-Assisted Selection,MAS），可以一定程度上实现乌龙茶品种定向育种，减少乌龙茶新品种选育的盲目性。应用本方法还可以初步掌握多个待鉴定茶树种质间的遗传背景与亲缘关系。该方法可作为快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法，可在茶树生长的幼龄期（苗期）快速鉴定茶树种质的乌龙茶适制性，减少乌龙茶品种选育过程人力、物力、财力的浪费。在一定程度上实现乌龙茶定向育种，减少乌龙茶新品种选育的盲目性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

包含以下具体步骤：

（1）待鉴定茶树种质基因组DNA提取

将研钵中加入3mL1.5%CTAB溶液，取2.0g样品放到研钵中研磨均匀，吸取1.0mL研磨溶液转入2.0mL离心管中，置65℃水浴1h，间隔15min轻轻混匀1次。

冷却后，加入600uL的氯仿：异戊醇，其体积比为24:1，混匀，12000r/min，离心15min。

吸上清，转入新的1.5mL离心管，重复步骤1次。

吸上清，转入新的离心管中，加入1/3体积的3mol/L NaAc和1mL-20℃预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃静置30min。

12000 r/min，离心10min，弃上清。

加入75%乙醇洗涤2次，置于吸水纸上倒置晾干。

加入50uLddH₂O溶解，即为DNA。

（2）特定的SSR荧光标记引物合成

 TM352、TM445标记引物信息（位点信息）如表1。

表1 标记引物信息

 TM352、TM445标记引物荧光染料为表2中的任意一种。

表2 标记引物荧光染料种类

（3）以待鉴定茶树种质基因组DNA为模板，分别利用特定的SSR荧光标记引物进行PCR扩增

PCR反应体系：ddH₂O 16μL，10×Buffer 3μL，10 mmolL^-1 dNTP 3μL，MgCl₂ 2μL，10μmolL^-1F、R引物各1.5μL，0.5U Taq酶1μL，模板DNA 2 μL。

PCR热循环程序：94℃预变性5min，使模板DNA充分变性，然后进入下列温度循环：94℃变性1min，52 ℃退火1min，72℃延伸1min，重复35个热循环；72℃延伸20min，最后4℃保存。

（4）PCR扩增产物检测，分别获得待鉴定茶树种质特定位点上的基因型

 ROX500分子量标准工作液的配制：50ul ROX500分子量标准原液加950ul Hi-Di，配成1ml ROX500分子量标准工作液，4℃备用，-20℃长期保存。

在96孔板内加入1ul样品与10ul ROX500分子量标准工作液，震荡混匀，离心，使用3730xl型DNA分析仪检测PCR扩增产物，分别获得待鉴定茶树种质在TM352、TM445位点上的基因型。

（5）分析待鉴定茶树种质基因型

首先按照上述步骤（1）至步骤（4）分别获得待鉴定茶树种质在TM352、TM445位点上的基因型。

然后将其与适制乌龙茶的种质在TM352、TM445位点上的基因型比较，如果待鉴定茶树种质在这两个位点上的基因型与适制乌龙茶的种质在TM352、TM445位点上的基因型共同一致，则判定该茶树种质为适制乌龙茶的种质。

本发明的优点在于：（1）可在茶树生长的幼龄期（苗期）采摘微量的茶树组织（1～2g）进行分子标记基因型鉴定，通过简单的实验操作和分析即可筛选出适制乌龙茶的茶树种质，整个过程仅需要1-2个工作日即可，相比直接鉴定法（5～6年）极大的缩短了鉴定周期，可以减少乌龙茶品种选育过程人力、物力、财力的浪费；（2）在乌龙茶新品种选育过程中应用本技术进行分子标记辅助选择育种（Molecular Marker-Assisted Selection,MAS），可以一定程度上实现乌龙茶品种定向育种，减少乌龙茶新品种选育的盲目性；（3）应用本发明可以初步掌握多个待鉴定茶树种质间的遗传背景与亲缘关系。该发明可作为快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法。

附图说明

图1适制乌龙茶的茶树种质在TM352位点上4种基因型（A、B、C、D）。

图2适制乌龙茶的茶树种质在TM445位点上4种基因型（a、b、c、d）。

图3茶树新品系春桃香在TM352、TM445位点上的基因型。

图4茶树新品系茗科3号在TM352、TM445位点上的基因型。

具体实施方式

（1）待鉴定茶树种质基因组DNA提取

将研钵中加入3mL1.5%CTAB溶液，取2.0g样品放到研钵中研磨均匀，吸取1.0mL研磨溶液转入2.0mL离心管中，置65℃水浴1h，间隔15min轻轻混匀1次。

冷却后，加入600uL的氯仿：异戊醇，其体积比为24:1，混匀，12000r/min，离心15min。

吸上清，转入新的1.5mL离心管，重复步骤1次。

吸上清，转入新的离心管中，加入1/3体积的3mol/L NaAc和1mL-20℃预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃静置30min。

12000 r/min，离心10min，弃上清。

加入75%乙醇洗涤2次，置于吸水纸上倒置晾干。

加入50uLddH₂O溶解，即为DNA。

（2）特定的SSR荧光标记引物合成

 TM352、TM445标记引物信息（位点信息）如表1。

 TM352、TM445标记引物荧光染料为表2中的任意一种。

（3）以待鉴定茶树种质基因组DNA为模板，分别利用特定的SSR荧光标记引物进行PCR扩增

PCR反应体系：ddH₂O 16μL，10×Buffer 3μL，10 mmolL^-1 dNTP 3μL，MgCl₂ 2μL，10μmolL^-1F、R引物各1.5μL，0.5U Taq酶1μL，模板DNA 2 μL。

PCR热循环程序：94℃预变性5min，使模板DNA充分变性，然后进入下列温度循环：94℃变性1min，52 ℃退火1min，72℃延伸1min，重复35个热循环；72℃延伸20min，最后4℃保存。

（4）PCR扩增产物检测，分别获得待鉴定茶树种质特定位点上的基因型

 ROX500分子量标准工作液的配制：50ul ROX500分子量标准原液加950ul Hi-Di，配成1ml ROX500分子量标准工作液，4℃备用，-20℃长期保存。

在96孔板内加入1ul样品与10ul ROX500分子量标准工作液，震荡混匀，离心，使用3730xl型DNA分析仪检测PCR扩增产物，分别获得待鉴定茶树种质在TM352、TM445位点上的基因型。

（5）分析待鉴定茶树种质基因型

首先按照上述步骤（1）至步骤（4）分别获得待鉴定茶树种质在TM352、TM445位点上的基因型。

然后将其与适制乌龙茶的种质在TM352、TM445位点上的基因型比较，如果待鉴定茶树种质在这两个位点上的基因型与适制乌龙茶的种质在TM352、TM445位点上的基因型共同一致，则判定该茶树种质为适制乌龙茶的种质。

实施例1、茶树新品系春桃香（品系编号115）的判定

春桃香是福建省农业科学院茶叶研究所采用杂交育种法育成的茶树无性系新品系，品系比较试验及区域适应性试验均表明该品系适制乌龙茶（[1]郭吉春,等.乌龙茶品系比较鉴定与选择.茶叶科学简报,1994, (145) 4:13-21.[2]郭吉春,等.乌龙茶新品种区域试验初报.茶叶科学技术，1995,149(4):15-20）。

按照上述步骤（1）至步骤（4）分别获得茶树新品系春桃香在TM352、TM445位点上的基因型(图3，Ⅰ、Ⅱ)，然后将其与适制乌龙茶的茶树种质在TM352、TM445位点上的基因型比较，该基因型与适制乌龙茶的茶树种质基因型(图1A，图2d)共同一致，判定茶树新品系春桃香适制乌龙茶，这说明应用本发明方法的鉴定结果与直接鉴定法的结果一致。

实施例2、茶树新品系茗科3号（品系编号511）的判定

闽科3号是福建省农业科学院茶叶研究所采用杂交育种法育成的茶树无性系新品系，区域适应性试验表明该品系适制红、绿茶，不适制乌龙茶(周富裕.茶树杂交种茗科3号全国区试贵州点试验报告.福建茶叶,2009,4:5-7)。

按照上述步骤（1）至步骤（4）分别获得茶树新品系茗科3号在TM352、TM445位点上的基因型(图4，Ⅰ、Ⅱ)，然后将其与适制乌龙茶的茶树种质在TM352、TM445位点上的基因型比较，虽然该种质在TM445位点上的基因型（图4，Ⅱ）与适制乌龙茶的茶树种质在TM445位点上的基因型（图2，a）一致，但该种质在TM352位点上的基因型(图4，Ⅰ)与适制乌龙茶的茶树种质在TM352位点上的基因型（图1，A、B、C、D）均不一致，判定茶树新品系茗科3号不适制乌龙茶，这说明应用本发明方法的鉴定结果与直接鉴定法的结果一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  福建省农业科学院茶叶研究所，王让剑

 

<120>  一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法

 

<130>  4

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cttcttcctg tcgggttgag                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gtcaacggcc tataacggaa                                                 20

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

cccaaatccc aagctgtaga                                                 20

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

acgatcgagc ctgcaatact                                                 20