神经鞘氨醇磷酸胆碱在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用

摘要

本发明公开了一种神经鞘氨醇磷酸胆碱在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用；其中有效促进内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞的神经鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)浓度为5μM。本发明提供的应用为研制开发促心肌分化的新型药物奠定了基础，所述神经鞘氨醇磷酸胆碱还可作为一种有效的工具，用于内源心脏干细胞的分化的分子机制的研究。

说明书

技术领域

本发明涉及神经鞘氨醇磷酸胆碱(sphingosylphosphorylcholine，SPC)的新应用，尤其涉 及神经鞘氨醇磷酸胆碱在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用。

背景技术

神经鞘氨醇磷酸胆碱(sphingosylphosphorylcholine，SPC)分子式为：C₂₃H₄₉N₂O₅P，分 子量为：464.62，结构式如下：

SPC是一种具有生物活性的鞘磷脂，天然存在于血液内，是高密度脂蛋白(HDL)和低 密度脂蛋白的组成成分。SPC除了作为生物膜的组成成分外，也可以作为调节细胞外和细胞 内信号转导的信号分子存在。已有报道表明，SPC能抑制血管平滑肌细胞痉挛，调节血管内 皮细胞的凋亡，分化和增殖，表现出对心血管细胞的重要生物学活性。例如SPC结合HDL 后可以显著地降低小鼠瞬时心脏缺血/再灌注模型中心脏梗死面积，保护心脏免受心肌缺血和 再灌注中的伤害并产生抗炎症与抗凋亡作用。但是在已公开的报道中有关SPC在干细胞分化 过程中的研究甚少，虽有报道SPC可以诱导间充质干细胞向血管平滑肌细胞分化，但对于SPC 在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用目前国内外尚未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种神经鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)在 制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用。

本发明所述神经鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞 药物中的应用。

其中：有效促进内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞的神经鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)浓 度优选为5μM。

本发明提供的SPC的应用为研制开发促心肌分化的新型药物奠定了基础。本发明所述的 SPC还可以作为一种有效的工具，用于内源心脏干细胞的分化的分子机制的研究。

为了更好地理解本发明的实质，下面结合SPC的药理实验和细胞生物学和分子生物学的 方法及结果来阐明其在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用。

1.内源性Sca-1⁺心脏干细胞的制备：以磁珠分选法提取并培养小鼠的sca-1⁺心脏干细胞。

结果显示：第一代(P1)细胞Sca-1⁺阳性率为84.8％，第五代(P5)96.8％，Sca-1⁺细 胞CD34阳性率约0.8％，CD45阳性率约3.5-7.3％。表明该制备方法提取的细胞为Sca-1⁺的 心脏干细胞，而非造血干细胞。

2.本发明所述SPC药用溶液的制备：配制为5mg/ml的储液。

3.倒置相差显微镜下定时观察SPC对心脏干细胞形态的影响。

结果表明：与溶剂对照组和正常组相比，5μM的SPC可以促进sca-1⁺心脏干细胞 拉长。

4.QPCR检测心肌细胞标志物mRNA水平的变化。

结果表明：5μM SPC处理2-3周能显著上调心肌细胞的marker Gata4，Nkx2.5，CTnt， Mef2c等的表达。

5.激光共聚焦技术检测结合western blot，检测心肌细胞标志物蛋白水平变化。

结果表明：5μM SPC能促进细胞内应力纤维的形成，并上调CTnt的蛋白水平表达。

另外，5μM SPC能显著促进心肌特异性转录因子GATA4的入核。

6.QPCR及流式细胞术从mRNA及蛋白水平检测内皮细胞标志物的变化

结果表明：5μM SPC处理2-3周能显著上调内皮细胞的marker CD31及vWF等mRNA 水平的表达，及CD31蛋白水平的表达。

由上述实验及其结果，可以得出如下结论：

分别用不同浓度的SPC处理Sca-1⁺心脏干细胞2，3，6周的结果显示，5μM的SPC处 理sca-1⁺心脏干细胞2-3周相对于其他浓度，能明显的促进心脏干细胞向心脏谱系的细胞分 化。而SPC处理6周以后促进分化的作用不是很明显。所以本说明书所确立的SPC应用浓度 时5μM，处理时间为2-3周，即从2周开始就会出现心脏干细胞的分化。因此本发明为研究 内源鞘磷脂类诱导心脏干细胞分化的机制提供了理论和实验依据，本发明涉及的SPC可以作 为一种有效的工具，用于内源心脏干细胞的分化的分子机制研究，同时本发明为研制开发有 关促心肌再生的新生药物奠定了基础，为临床药物的开发应用提供了可靠的理论依据。

附图说明

图1：为分离的sca-1⁺心脏干细胞纯度。P1，P5表示传代次数。

图2：为sca-1⁺心脏干细胞在正常培养条件下，倒置相差显微镜下显示的SPC处理2-3周后 细胞的形态变化图。

其中：nor：正常培养组

ctr：溶剂对照组

spc：5μM SPC处理组

图3：是SPC处理sca-1⁺心脏干细胞后，心肌细胞特异性marker的mRNA水平的变化。

其中：

A.1，2，5μM SPC处理心脏干细胞3周，QPCR检测心肌细胞转录因子gata4，Nkx2.5表 达水平的变化。确立有效的诱导浓度为5μM。

B.以5μM SPC处理sca-1⁺心脏干细胞2，3，6周，再次检测心肌细胞转录因子gata4，Nkx2.5 表达水平的变化。确立有效的诱导时间为2-3周。

C.以5μM SPC处理sca-1⁺心脏干细胞2-3周，检测其它心肌细胞marker CTnt，Mef2c的 mRNA水平的变化。

图4：是SPC处理sca-1⁺心脏干细胞后，心肌细胞特异性marker在细胞内的分布及蛋白水平 的变化。

其中：ctr：溶剂对照组；spc：5μM SPC处理组。

A.激光扫描共聚焦显微镜结合免疫荧光化学显示5μM SPC对cTnt的细胞内分布的影 响。

B.Western blot显示5μM SPC能促进cTnt的表达。ctr：溶剂对照组；spc：5μM SPC处理 组。

C.激光扫描共聚焦显微镜结合免疫荧光化学显示5μM SPC促进细胞特异性转录因子 Gata4的入核。

D.柱形图分析显示对照组Gata4的入核率约为20％，SPC处理组Gata4的入核率约为80％。

图5：是SPC处理sca-1⁺心脏干细胞后，内皮细胞特异性marker在mRNA及蛋白水平的变化。

其中：nor：正常培养组；ctr：溶剂对照组；spc：SPC处理组。

A.QPCR检测不同浓度SPC处理sca-1⁺心脏干细胞不同时间对CD31及vWF mRNA水平的 影响。确立有效的浓度为5μM，有效的作用时间为2-3周。

B.5μM SPC处理3周，流式细胞仪检测SPC对CD31的影响。

具体实施方式

实施例1Sca-1+心脏干细胞的提取及流式细胞仪检测其纯度

①10周龄左右的C57/BL小鼠断颈处死，迅速用酒精消毒取心脏，清洗，剪碎，剪到大 约1mm³大小。

②37℃胰酶液消化30min。

③消化完加少许胎牛血清终止消化，用200目的细胞筛过滤，加入少量的cell staining  buffer悬浮过滤的细胞，进行细胞计数。

④将滤液350g离心8min，用cell staining buffer重悬细胞，使密度达到2×10⁷/ml，向 溶液中加入生物素标记的sca-1抗体.，每1×10⁷个细胞加5μl抗体，冰上孵育20min。

⑤用过量体积的1xBD IMag^TXbuffer洗涤标记的细胞,350g,离心8min,并小心吸去上 清。

⑥彻底涡旋BD IMag^TX Streptavidin Partides Plus-DM，每1×10⁷个细胞加25μl,混匀， 然后4℃孵育45min。

⑦用1×BD IMag^TXbuffer，将标签量提高到20-80×10⁶/ml。

⑧将EP管移到BD IMag^TX架上，吸附8min。(不超过1ml)，吸出上清，再次加入1xBD  IMag^TXbuffer，轻轻重悬，再放架子上吸附8min。重复该步骤，用培养基悬浮细胞，将细胞 移入24孔板内培养。选取1-5代生长状态良好的、且处于对数生长期的细胞备用。

⑨对第一代，第五代心脏干细胞进行流式检测干细胞纯度。收集细胞，300g，离心5min 去除废液，用cell staining buffer重悬细胞，加入PE-Cy5-CD45抗体，FITC-sca-1+抗体， PE-CD34抗体冰上染色30min，300g离心5min，洗两次，最后再次加入cell staining buffer 重悬细胞，利用流式细胞术检测(结果见图1)

结果显示：第一代(P1)细胞Sca-1⁺阳性率为84.8％，第五代(P5)96.8％，Sca-1⁺细胞 CD34阳性率约0.8％，CD45阳性率约3.5-7.3％。表明我们提取的细胞为Sca-1⁺的心脏干细胞， 而非造血干细胞。

实施例2 SPC储液的配制

由sigma公司提供的SPC粉末配制浓度为5mg/ml的储液，分装到1.5ml的eppendorf 管中，用液氮吹干，-20℃储存。

实施例3 SPC对sca-1⁺心脏干细胞形态影响的检测

将提取出的sca-1⁺心脏干细胞种于24孔板中，7天后长满，均匀传入小皿中，用含有生 长因子和10％胎牛血清的IMDM培养，长满后进行传代，取1-5代干细胞用于实验。将贴壁 24小时的细胞加入不同浓度(1，2，5μM)的SPC作为实验组。加入乙醇的作为溶剂对照 组，而不做任何处理的作为正常组。培养条件：37℃，CO₂孵箱内培养。

每隔三天换一次培养液并持续加入所述浓度的SPC，培养2-3周后在倒置相差显微镜下 定时观察(结果见图2)。

结果表明：与正常组和溶剂对照组相比，5μM SPC处理细胞2-3周，细胞拉长变细。

实施例4心肌细胞标志物RNA水平的检测

将提取出的sca-1⁺心脏干细胞种于24孔板中，7天后长满，均匀传入小皿中，用含有生 长因子和10％胎牛血清的IMDM培养24小时。待细胞贴壁后，弃废液，用1×PBS清洗，加 入新鲜培养液，并分别加入1，2，5μM的SPC作为实验组。加入乙醇的作为溶剂对照组， 而不做任何处理的作为正常组。培养条件：37℃，CO₂孵箱内培养。

每隔三天换一次培养液并持续加入所述浓度的SPC，培养2-3周后加入trizol，提取总 RNA，反转录出cDNA，进行QPCR检测mRNA水平的变化(结果见图3)。

结果表明：5μM的SPC处理2-3周可以有效的上调心肌细胞marker CTnt，GATA4，Mef2c， Nkx2.5的mRNA的表达。**p<0.01。

实施例5心肌细胞标志物蛋白水平的检测

将提取出的sca-1⁺心脏干细胞种于24孔板中，7天后长满，均匀传入小皿中，用含有生 长因子和10％胎牛血清的IMDM培养24小时。待细胞贴壁后，弃废液，用1×PBS清洗，加 入新鲜培养液，并加入5μM的SPC作为实验组。加入乙醇的作为溶剂对照组。

①弃废液，0.1×PBS清洗三遍后，用4％的多聚甲醛固定15分钟，清洗后，山羊血清封 闭20分钟，加入CTnt的一抗4℃孵育过夜，0.1×PBS清洗三遍后，加入二抗，37℃孵育1h， 清洗后，在激光扫描共聚焦显微镜观察心肌细胞标志物——CTnt的分布变化。

②提取总蛋白，western blot检测心肌细胞marker CTnt的蛋白水平。

③弃废液，0.1×PBS清洗三遍后，用4％的多聚甲醛固定15分钟，清洗后，山羊血清封 闭20分钟，加入GATA4的一抗4℃孵育过夜，0.1×PBS清洗三遍后，加入二抗，37℃孵育 1h，清洗后，在激光扫描共聚焦显微镜观察心肌细胞标志物——GATA4的分布变化。

④随便选取6张GATA4免疫荧光的图片，计算其入核率。(结果见图4)。

结果表明：5μM的SPC能促进细胞内应力纤维的形成，并上调的心肌细胞marker CTnT。 另外，激光扫描共聚焦显微镜结合免疫荧光化学显示5μM SPC促进细胞特异性转录因子 Gata4的入核；柱形图分析显示对照组GATA4的入核率约为20％，SPC处理组GATA4的入 核率约为80％。**p<0.01。

实施例6内皮细胞特异性marker的RNA及蛋白水平的检测

将提取出的sca-1+心脏干细胞种于24孔板中，7天后长满，均匀传入小皿中，用含有生 长因子和10％胎牛血清的IMDM培养24小时。待细胞贴壁后，弃废液，用1×PBS清洗， 加入新鲜培养液，并加入1，2，5μM的SPC作为实验组。加入乙醇的作为溶剂对照组。而 不做任何处理的作为正常组。培养条件：37℃，5％CO₂培养箱内培养。

①每隔三天换一次培养液并持续加入所述浓度的SPC，培养2-3周后加入trizol，提取总 RNA，反转录出cDNA，进行QPCR检测mRNA水平的变化。

②5μM SPC处理sca-1+心脏干细胞3周，收集细胞，300g，离心5min去除废液，用cell  staining buffer重悬细胞，加入FITC-sca-1⁺抗体，PE-CD31抗体冰上染色30min，300g离心 5min，洗两次，最后再次加入cell staining buffer重悬细胞，利用流式细胞术检测(结果见图 5)。

结果表明：QPCR检测不同浓度SPC处理sca-1⁺心脏干细胞不同时间对CD31及vWF  mRNA水平的影响。确立有效的浓度为5μM，有效的作用时间为2-3周。*p<0.05，**p<0.01。 5μM SPC处理3周，流式细胞术表明SPC促进内皮细胞marker CD31的蛋白质水平的表达。