一种基于活体肺切片的抗流感病毒或抗炎药物筛选模型的构建方法及应用

摘要

本发明公开了一种基于活体肺切片的抗流感病毒或抗炎药物筛选模型，其特征在于，包括以下步骤：先将病毒感染活体肺切片，再将待检测药物作用于感染了病毒的所述活体肺切片，最后通过检测病毒滴度和相关细胞因子的变化来验证所述待检测药物的效果。本发明还公开了一种该筛选模型的构建方法，该方法包括：肺切片的制备、肺切片的厚度优选、神经氨酸酶活性与病毒滴度相关性评价以及炎症因子的选择。通过该发明，构建了一种基于活体肺切片的药物筛选方法，比传统的细胞模型更加符合真实的机体情况，准确有效。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，更具体的涉及一种基于活体肺切片的抗流 感病毒或抗炎药物筛选模型的构建方法及应用。

背景技术

流感病毒感染严重威胁着人类健康，给社会带来严重的经济损失。1918 年流感大流行，全世界范围内约有5亿人感染，导致5000万～1亿人死亡。 2009年爆发的猪流感波及200多个国家，导致约18000人死亡。2013年， 出现在中国的高致病性禽流感H7N9再次引起人们对流感病毒及如何控制流 感的关注。除了流感大爆发外，每年的季节性流感也给社会带来很大的损 失，在全球范围内约25万人～50万人死于流感。目前，流感的主要治疗策 略是抗病毒药物治疗。现在全世界广泛使用的抗流感病毒药物只有两种： 一种是M2离子通道抑制剂，如金刚烷胺和金刚乙胺；一种是神经氨酸酶抑 制剂，如奥司他韦和扎那米韦。金刚烷胺耐药性已经广泛存在，奥司他韦 也开始出现部分毒株耐药。因此开发新型抗流感病毒药物是十分必须的。

目前研究认为，流感病毒感染后过强的炎症反应是导致病人呼吸衰竭， 进而死亡的主要原因。炎症因子是炎症反应的重要效应分子。这类炎症因 子包括：TNF-、MCP-1、IL-1、IL-6、RANTES、IL-10、MIP-3、IL-8以及 IP-10等。但是这些因子在这些病毒感染引发炎症中的作用机理都不十分清 楚。近几年，有关抗炎药物应用于流感病毒治疗的研究不断增多，新型抗 炎药物的发现可能给流感治疗提供新的策略。

抗流感病毒及抗炎药物的筛选和评价模型以往使用的是细胞模型和动 物模型。动物模型中，动物使用量，昂贵的化学药物都使得经济开销大。 此外，对于病毒感染的动物模型，还需要特殊的安全措施，如生物安全二 级或者更高实验室。而细胞模型中由于离体的单细胞失去其所在的组织环 境，因此不能较好地模拟它在体内的相关功能，评价不准确。在细胞上有 效的药物往往不能在动物体内发挥相应的效果。虽然有人用活体组织切片 进行毒理的研究，但目前尚未有利用活体组织切片培养进行药物筛选的相 关研究。另外，虽然有报道流感可以在猪肺片复制，但是没有到把它发展 为药物评价模型。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种基 于活体肺切片的抗流感病毒或抗炎药物筛选模型的构建方法及其应用，其 目的在于构建一种利用活体肺切片进行抗流感病毒或抗炎药物筛选的模 型，而快速有效的对抗流感病毒或抗炎药物进行筛选。

按照本发明的一个方面，提供了一种基于活体肺切片的抗流感病毒或 抗炎药物筛选模型，其特征在于，包括以下步骤：先将病毒感染活体肺切 片，再将待检测药物作用于感染了病毒的所述肺切片，最后通过检测相关 细胞因子的变化来验证所述待检测药物的效果。

本发明还提供了一种药物筛选模型的构建方法，其特征在于，具体步 骤包括：

(1)肺切片的制备：

利用活体鼠肺制备得到不同厚度规格的肺切片样本，以不同编号分别 标记，并且所述厚度规格控制为微米量级；

(2)肺切片的厚度优选：

利用步骤(1)所得到的多个肺切片样本，流感病毒感染后执行冲洗， 添加新鲜培养液，并在12小时～72小时之后采集肺切片样本的培养基上清； 然后，根据所述培养基上清中的病毒滴度以及肺切片的厚度规格，选择225 μm～275μm的样本作为厚度优选后的肺切片样本备用；

(3)神经氨酸酶活性与病毒滴度相关性评价：

利用步骤(2)中厚度优选后的肺切片样本，执行流感病毒的感染，并 测试感染所引发的病毒滴度变化以及相应神经氨酸酶的活性变化，由此确 认神经氨酸酶的活性与流感病毒滴度在肺切片样本上具有相关性；

(4)炎症因子的选择：

用流感病毒感染活体小鼠，1天～7天后检测小鼠体内的多种炎症因子 水平；此外，同样利用步骤(2)中厚度优选后的肺切片样本，执行流感病 毒的感染，利用肺切片样本上清检测体外的多种炎症因子水平；接着，根 据所述多种炎症因子的体内外相关系数，选择炎症因子IP-10、RANTES和 MIP-3ɑ作为评价抗炎药物的指标，同时结合步骤(3)所确认的神经氨酸酶 活性，由此一共完成对所述抗流感病毒药物筛选模型的构建过程。

优选地，对于步骤(1)而言，所述肺切片的具体制备过程如下：

(1)将小鼠处死并消毒。分离小鼠气管，将预热至37℃的低熔点凝胶 从气管注射到小鼠肺部，直至肺部充盈到标准大小；

(2)整只小鼠放置在冰上至低熔点凝胶初步凝固，剪断小鼠气管，小 心取出小鼠的心脏和整个肺脏，并将之放入预冷至4℃的培养基，直至低熔 点凝胶完全凝固；分离小鼠的心脏和肺脏，选用左肺叶；在肺脏的支气管 尾端的肺部做一个横切面，然后在肺部另一端距该切面0.8cm处做另一个 横切面，取中间0.8cm的肺块备用；

(3)将步骤(2)制备所得的肺块固定在切片机标本托盘上，并放入 预冷至4℃的培养基中，按照切片机设定的厚度执行切片操作，得到未清洗 的肺切片；将所述未清洗的肺切片置于48孔细胞培养板中并加入培养基， 每小时更换培养基并重复3次～5次，以清洗切片过程导致的细胞碎片，最 后制备得到所需的肺切片。

优选地，对于步骤(3)而言，所述评价方法的具体步骤包括：

(1)用200μl 10⁵PFU/ml的流感病毒感染肺切片样本。2小时后， 弃病毒液，磷酸缓冲液冲洗肺切片样本两次后，添加新鲜培养液至肺切片 样本中；

(2)在12小时～120小时之间，每间隔一断时间采集步骤(1)得到 的肺切片样本上清液；

(3)采用组织半数感染量(TCID₅₀)检测步骤(2)采集得到的上清液 的病毒滴度，结果显示，病毒在48小时后达到复制高峰，并进入稳定复制 阶段；

(4)取步骤(2)采集得到的上清液40μl并加入20μM的MUNANA 20μl进行反应，在96孔黑色optiplate板中37℃孵育2小时；终止 反应，然后检测上清液与MUNANA反应后的荧光强度；结果显示，荧光强度 在48小时后到达高峰，此变化趋势和组织半数感染量的变化趋势相同；由 于MUNANA是神经氨酸酶的特异性荧光底物，可用来指示神经氨酸酶的活性， 结合荧光强度和步骤(3)中组织半数感染量的变化趋势，提示神经氨酸酶 活性可以代表流感病毒在肺切片样本上的复制情况。

优选地，步骤(4)中炎症因子的选择方法具体步骤包括：

(1)小鼠经腹腔注射麻醉后，鼻腔感染H1N1病毒。感染后1、3、5 天分别收集肺洗液，并以未感染的小鼠肺洗液为阴性对照；检测体内不同 炎症因子的水平，所述不同炎症因子分别为：TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1 β、IFN-γ、MIP-3α、IP-10和RANTES；检测结果显示第3天的炎症因子 水平与阴性对照组差别最为显著，所以选择第3天的炎症因子水平作为体 内炎症因子水平与体外炎症因子水平相比较；

(2)200μL 10⁵PFU/ml的H1N1病毒感染肺切片样本，并以未感染 病毒的所述肺切片样本作为阴性对照；2小时后，弃病毒液，磷酸缓冲液洗 两次后，添加新鲜培养液；分别在24小时以及48小时后收集上清并检测 与步骤(1)中相对应的所述不同炎症因子的水平，检测结果为体外炎症因 子水平；

(4)采用Gragh Pad 5.0的线性相关模型分析体内炎症因子水平和 体外炎症因子水平的相关性，根据体内外相关系数，最后选择炎症因子 IP-10、RANTES和MIP-3ɑ作为在肺切片上评价抗炎药物的指标。

优选地，在步骤(4)之后，还可以执行筛选模型的验证，其具体步骤 包括：

(1)用流感病毒感染肺切片样本，2小时后弃去病毒液并用磷酸缓冲 液冲洗2次～4次，得到感染后的肺切片样本；

(2)将含有待检测药物的培养基，加入步骤(1)中感染后的肺切片 样本，得到药物作用的肺切片样本；

(3)将步骤(2)中药物作用的肺切片样本培养48小时后，检测培 养基上清中神经氨酸酶活性和IP-10水平，以确定药物的体外抗病毒或抗 炎效果；

(4)将步骤(3)检测得到的体外抗病毒或抗炎效果与药物的体内已 知效果相比较，结果显示两者之间的一致性，故证实该筛选模型可行。

按照本发明的另一方面，还提供了一种抗流感病毒或抗炎药物的筛选 模型，其具体步骤包括：

(1)用流感病毒感染肺切片样本，1小时～4小时后弃去病毒液并用 磷酸缓冲液冲洗2次～4次，得到感染后的肺切片样本；

(2)将含有待检测药物的培养基，加入步骤(1)中感染后的肺切片 样本，得到药物作用的肺切片样本；

(3)将步骤(2)中加入培养基的肺切片培养12小时～120小时后， 通过检测培养基上清中病毒滴度以及相关炎症因子的变化水平，以确定药 物的抗病毒或抗炎效果。

优选地，步骤(3)中所述炎症因子包括：MIP-3ɑ、RANTES或IP-10。

总体而言，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、选择了肺切片样本作为筛选模型，比细胞模型更接近机体的真实的 生理和病理状况的特点，而同时比动物模型更加节省动物和药物的使用量；

2、通过对肺块部分的选择和切片厚度的筛选，在保证实验效果的前提 下节省了实验材料；

3、通过与体内病毒炎症因子的相关性，选择了适当的炎症因子作为评 价指标，提供了一种抗炎症药物评价的有效途径。

附图说明

图1为流感病毒感染不同厚度肺切片样本后，肺切片上清中的病毒滴 度值对比。

图2为流感病毒感染肺切片12小时～120小时后，肺切片上清中的病 毒滴度变化。

图3为实施例3中2'-(4-甲基伞形酮)-α-D-乙酰神经氨酸作用于病 毒上清液后，通过荧光特征的变化表现出神经氨酸酶的活性变化。

图4为实施例4中H1N1病毒(PR8)感染活体小鼠后，肺洗液中不同 炎症因子变化水平。

图5为实施例4中H1N1病毒(PR8)感染肺切片后24小时和48小时， 切片上清中的炎症因子含量的变化水平。

图6为实施例4中不同炎症因子在肺切片上以及在体内的相关性分析。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图 及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体 实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的 本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可 以相互组合。

实验材料

试剂

15-去氧-△-(12,14)前列腺素J2和利巴韦林购自Sigma-Aldrich；表 没食子儿茶素没食子酸酯，吉吗酮购自四川省维克奇生物科技有限公司； P38抑制剂SB203580、ERK抑制剂U0126购自上海碧云天生物科技有限公 司；奥司他韦(GS 4071)购自Toronto Research Chemicals,Canada；盐 酸双环胺(dicyclomine hydrochloride)购自Sigma试剂公司；非诺贝特 (fenofibrate)，克霉唑(clotrimazole)、盐酸苄达明(benzydamine  hydrochloride)购自上海金穗生物科技有限公司；普罗地芬(proadifen)、 草酸萘呋胺(nafronyl oxalate)购自北京百灵威科技有限公司。所有药品 都溶解在二甲基亚砜(DMSO，Sigma-Aldrich)中。IP-10检测用Duoset ELISA 试剂盒(R&D)；DMEM/F12培养基购自GIBCO公司；抗核壳蛋白(NP)抗体 购自santa cruz公司；TRITC荧光标记的兔抗小鼠IgG购自武汉飞羿科技 有限公司；低熔点琼脂糖购自Bio-Rad；2'-(4-甲基伞形酮)-α-D-乙酰神 经氨酸(MUNANA)购自Sigma。

动物和病毒

20g左右体重的BALB/c小鼠购自湖南省长沙市长沙实验动物中心； H1N1流感毒株A/PuertoRico/8/34(PR8)和H3N2流感毒株 A/Human/Hubei/3/2005(Hubei)冻存于-80℃冰箱。

仪器设备

眼科剪，眼科镊，18号注射器针头，2.5mL注射器，缝合线，脱脂棉。

震荡切片机(莱卡公司VT 1200S)；Perkin Elmer Wallac Envision 多标记读板机读板；双光子共聚焦显微镜(尼康公司A1MP⁺)。

实施例1 肺切片的制备

(1)小鼠经腹腔注射戊巴比妥(75mg/kg)麻醉后，腹腔主动脉放血 处死。腹部皮肤用酒精棉球擦拭消毒。暴露气管后，用眼科镊分离气管， 并用眼科剪在气管处(离心端)做“V”型切口。在“V”型切口处插入18 号打磨过的注射器针头，并用缝合线固定。然后在肺部充盈1.3ml的提前 预热至37℃的低熔点凝胶。

(2)整只小鼠放置在冰上10分钟，以使胶初步凝固。胶凝固后剪断 气管，小心取出心脏和整个肺脏，放入预冷的DMEM/F12培养基中，4℃放 置15分钟，使胶完全凝固。分离肺脏，选用左肺叶。用眼科剪在肺脏的支 气管尾部一端做一个横切面，然后在距该切面0.8cm处肺脏的另一端做另 一个横切面，取得厚度为0.8cm的肺块备用。

(3)将步骤(2)制备所得的肺块固定在莱卡切片机的标本盘上，放 入预冷的DMEM/F12培养基，设定切片厚度为125μm制作肺切片。将肺切 片于48孔板中进行培养，每孔一片肺切片。每小时更换DMEM/F12培养基 一次，至少三次，去除切片过程导致的细胞碎片。即得到厚度为125μm的 肺切片，标记为样本1。

(4)以不同的厚度计重复步骤(3)分别制备得厚度为250μm、500 μm以及1000μm的肺切片，分别标记为样本2、样本3和样本4。

实施例2 肺切片的厚度优选

(1)用10⁵PFU/ml的H1N1病毒感染实施例1制备所得的肺切片样本 1、样本2、样本3和样本4。感染2小时后，弃病毒液，磷酸缓冲液洗两 次后，添加新鲜培养液。

(2)48小时后采集上清。采用组织半数感染量(TCID₅₀)检测切片上 清中的病毒滴度，病毒滴度的计算采用Reed–Muench方法(Reed,L.J., Muench,H.,1938.American Journal of Epidemiology 27,493-497.)。 结果如图1所示，可以看出，样本1-4中的log₁₀TCID50值分别为2.375、 3.25、3.5和3，其中样本2上清的病毒粒子比样本1的肺切片上清中的病 毒粒子多了7.5倍，但与样本3和样本4差别并不明显。而样本2-样本4 中，样本2的厚度最小，可以从每只鼠上获得更多切片，更加节省实验材 料。

实施例3 神经氨酸酶(NA)活性与病毒活性相关性评价

(1)用10⁵PFU/ml的H1N1病毒或者H3N2病毒感染实施例1制备所 得的肺切片样本2。感染2小时后，弃病毒液，磷酸缓冲液洗两次后，添加 新鲜培养液。

(2)在12小时、24小时、48小时、72小时、96小时以及120小时 后分别采集肺切片样本上清液。

(3)采用组织半数感染量(TCID50)检测步骤(2)采集所得上清中 的病毒滴度，病毒滴度的计算采用Reed–Muench方法。结果如图2a、2b 所示，病毒在48h达到复制高峰，并进入稳定复制阶段。

(4)2'-(4-甲基伞形酮)-α-D-乙酰神经氨酸(MUNANA)是神经氨酸 酶(NA)的特异性荧光底物，用于表现神经氨酸酶的活性。将步骤(2)采 集所得的病毒上清40μl和20μM的MUNANA 20μl放入96孔黑色 optiplate板。37℃孵育2小时后，加100μl终止液(0.14M氢氧化钠 溶于83％酒精)终止反应。然后用Wallac Envision多标记读板机读板(激 发光355nm，发射光485nm)。结果如图3a和3b所示，荧光强度在48小 时到达高峰，此变化趋势和图2相同，提示神经氨酸酶活性可以代表流感 病毒在切片上的复制情况。

实施例4 炎症因子的选择

(1)小鼠经腹腔注射戊巴比妥(75mg/kg)麻醉后，经鼻腔滴20μl 10⁵PFU/ml H1N1病毒(PR8)。分别在病毒感染后1、3、5天收集肺洗液，以 未感染的小鼠肺洗液为阴性对照。剖开小鼠胸腔，分离气管，并托出肺脏 后，用2mL含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲液通过气管灌洗 3次后，收集肺洗液，并检测细胞因子TNF-α，IL-6，IL-10，IL-1β，IFN- γ，MIP-3α，IP-10和RANTES(检测所用的ELISA试剂盒购自武汉博士德)， 结果如图4所示，流感病毒感染小鼠后炎症因子发生变化。结果显示流感 病毒感染小鼠后第3天的炎症因子分泌，相比较对照组变化最为显著(8个 因子中7个显著上升)，而第5天，个别因子开始下降。所以选择第3天 的炎症因子水平进行体内体外比较。

(2)200μL 10⁵PFU/ml的H1N1病毒感染实施例1制备所得的肺切 片样本2，并以未感染病毒的上述肺切片作为阴性对照。感染2小时后，弃 病毒液，磷酸缓冲液洗两次后，添加新鲜培养液。分别在24小时以及48 小时后收集上清并检测细胞因子TNF-α，IL-6，IL-10，IL-1β，IFN-γ， MIP-3α，IP-10和RANTES，结果如图5所示。图5a、5b为感染后24小时 后的细胞因子变化，除了IL-1β和IL-10外，其他因子都显著上升。其 中IFN-γ的水平超出了试剂盒的检测低限。TNF-α，MIP-3α，IL-6，RANTES 和IP-10的上升倍数分别是2.1、3.3、2.4、1.7以及8.9。图5c、5d为 感染后48小时后的细胞因子变化，可以看出，上述因子的上升倍数高于感 染后24小时更高，分别是4、4.4、3、4以及19。

(4)将流感病毒诱导后的炎症因子水平减去其相应的对照组水平，采 用Gragh Pad 5.0的线性相关模型分析体内(肺洗液)和体外(切片上清) 的炎症因子水平的相关性。结果显示，感染后24小时切片上清中的炎症因 子含量和小鼠肺洗液中的炎症因子含量呈显著正相关，相关系数为0.75， 如图6a。感染后48小时切片上清中的炎症因子含量和小鼠肺洗液中的炎症 因子含量也呈显著正相关，相关系数为0.61，如图6b。其中IP-10，RANTES 和MIP-3ɑ体内体外的相关性较好，因此它们可作为在肺切片上评价抗炎药 物的指标。

实施例5 筛选模型的验证

(1)200μL 10⁵PFU/ml的的H1N1病毒或者H3N2病毒感染实施例1 制备所得的肺切片样本2。

(2)感染2小时后，弃病毒液，磷酸缓冲液洗两次后，添加含有表1 中各种药物的新鲜培养基各200μL。

(3)48小时后分别收集上清并检测神经氨酸酶活性和IP-10水平，结 果汇总见表1：

表1

表中：

^aCC₅₀：50％毒性浓度；

^bNA-EC₅₀：50％有效抑制NA活性浓度；

^cIP-10-EC₅₀：50％有效抑制IP-10产生的浓度；

^dIn vivo：药物对流感感染小鼠的死亡保护效果；

^e药物机制：药物发挥作用的可能机制；

^f–：NA无活性，IP-10因子被完全抑制或者对小鼠无死亡保护效果。

^g+：药物可以提高流感感染小鼠存活率。

其中利巴韦林、奥司他韦和吉吗酮为抗流感病毒药物；ERK通路抑 制剂U0126和表没食子儿茶素没食子酸酯兼有抗病毒和抗炎作用；P38抑制 剂SB203580和15-去氧-△-(12,14)前列腺素J2(15d-PGJ₂)只有抗炎效果。 以上已经被文献证实，可以通过抑制流感病毒复制或抑制炎症保护流感感 染小鼠。而盐酸双环胺，克霉唑，非诺贝特，普罗地芬，盐酸苄达明和草 酸萘呋胺，尽管能在细胞水平表现出抗病毒效果，但不能对活体小鼠发挥 作用(An,L.,etc Antiviral Res.109,54-63.)。

从表1可以看出，这些药物的抗病毒或抗炎效果，与以往的研究结果 一致。

实施例6 抗流感病毒或抗炎药物的筛选

以所述的相同步骤重复实施例5，区别在于，步骤2中添加的各种药物 为待检测药物。

通过检测样本的神经氨酸酶活性，可用来评价待检测药物的抗病毒效 果。

通过检测样本的IP-10、RANTES或MIP-3ɑ水平，可用来评价待检测药 物的抗病毒或抗炎效果。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等 同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。