一株高效降解阿特拉津的短小芽孢杆菌

摘要

一株高效降解阿特拉津的短小芽孢杆菌，它涉及一株高效降解阿特拉津的芽孢杆菌。它为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年12月29日，保藏号为CGMCC No.10252。它为一种抗逆性很强的微生物，施用此微生物后明显加速土壤中残留阿特拉津的降解，减轻或避免阿特拉津残留对下茬敏感作物的危害，从而提高作物的产量，获得更高的经济效益。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及一种能够修复阿特拉津污染土壤的芽孢杆 菌的发现。

背景技术

阿特拉津属于均三氮苯类除草剂，是一种选择性内吸传导型苗前、苗后除草剂，近年 来在我国广泛使用，但其属于长效除草剂，残留时间较长，易对生态环境造成污染，且其 残留对后茬敏感作物有严重的药害，是农业生产以及生态环境中得一个重要问题。我国近 年屡次发生阿特拉津对后茬敏感作物(甜菜、甜瓜、小麦、大豆等)危害事件，直接造成 严重的经济损失。

微生物是降解有机污染物能力较强的生物类群。自1982年以来，学者们先后在细菌、 真菌和藻类中分离得到能够降解阿特拉津的微生物,且研究较为详细，在放线菌方面研究 的相对较少。目前已报道的能够降解阿特拉津的主要细菌有假单胞菌属(Pseudomonas  sp.)、产碱杆菌属(Alcaligens sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、不动杆菌属(Acinetabacter  sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)等。能够降解阿特拉津的 主要真菌有微紫青霉(Pencillium janthinellum)、红垂蘑菇(Hypholoma fasciculare)、烟曲霉 (Aspergillus fumigatus)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、黄丙曲霉(Aspergillus flavipes)、斜 卧青霉(Penicillium decumbens)等。

随着人们对微生物降解阿特拉津研究的深入，一些问题也逐步显现，如在实验室中， 微生物对阿特拉津的降解效果很好，但是到环境中却达不到预期效果，甚至与试验室效果 相反；微生物降解的次生产物的毒性问题等。本文针对阿特拉津残留的农田污染问题，研 究其微生物降解方法，采用摇瓶富集驯化方法分离筛选出降解菌株，应用形态、生理生化 和分子方法对筛选出的菌株进行分类地位鉴定，明确降解菌株的生长特性和营养特性，同 时并采用盆栽法(最大限度接近自然环境)对降解菌株的降解效果进行了评价。本研究在 降解土壤中阿特拉津，减轻其残留对下茬作物的危害，保障农产品安全生产，减轻生态环 境污染等方面均具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一株高效降解阿特拉津的芽孢杆菌,其是从土壤中筛选出能够降解土壤 中阿特拉津，减轻或避免阿特拉津残留对下茬敏感作物的危害的菌株，从而达到加速土壤 残留的阿特拉津的降解，确保作物正常生长，保障农产品安全生产，减轻生态环境污染等 目的。

本发明的一株高效降解阿特拉津的短小芽孢杆菌，它为短小芽孢杆菌(Bacillus  pumilus)gy201401，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址 是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年12月29日，保藏号为CGMCC  No.10252。

本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401菌株生理生化指标如表1所示。

表1 生理生化指标

分子鉴定：将本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401菌株进行16SrDNA 鉴定，序列长度为1576bp(如序列表SeqIDNo：1所示)，其序列提交至GenBank，以 确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) 的16SrDNA序列的同源性最高，保守区相似性为99％，通过结合菌体形态特征、生长条 件、生理生化鉴定结果确定它属于芽孢杆菌属，为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。有 100个序列与获得序列的相似性为99％，均为芽孢杆菌属，其中有51个序列为短小芽孢 杆菌(Bacillus pumilus)。

将菌株的16SrDNA序列与GenBank数据库中己知菌株16SrDNA序列进行同源性比 对，用CLUSTALX程序进行序列对比，用MEGA5.05软件生成系统进化树如图3所示。

本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401降解菌在28～38℃能良好生长， 最适生长温度为36℃；菌株在pH4～9能生长，最适pH为6.0；通气量越大，菌体生长越 好，说明其是一株好氧菌。其最适碳氮源分别为蔗糖和牛肉膏。

本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上， 如图2所示，降解菌菌落圆形，边缘近似圆形，表面光滑，中间为黄色，不透明。

本发明包含以下有益效果：

本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401是一种抗逆性很强的微生物，施 用此微生物后明显加速土壤中残留阿特拉津的降解，减轻或避免了阿特拉津残留对下茬敏 感作物的危害，从而提高作物的产量，获得更高的经济效益。

本发明通过分离筛选得到一株能够降解阿特拉津的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) gy201401，其对阿特拉津降解率能到达36.14％。该菌株降解阿特拉津的作用尚未见报道。 在其它报道中，发现假单胞菌属、蜡状芽孢杆菌、烟曲霉、白腐真菌和纤维藻等对阿特拉 津有降解作用。

本发明通过对土壤残留阿特拉津施用该菌并同时种植敏感作物甜菜，进一步评价了短 小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401对土壤中阿特拉津残留污染的修复能力及减轻或 避免作物的危害作用。研究表明，当阿特拉津残留量分别为30μg/kg、60μg/kg时，施用 该降解菌，甜菜总干物质量相对于没有加入降解菌的处理分别增加24.42％和60.98％，相 对于空白分别降低1.5％和4.71％；当阿特拉津残留量为90μg/kg时，加入该降解菌的甜 菜总干物质量相对于没有加入降解菌的处理增加413.46％，相对于空白降低15.32％。由 此可见，在本试验条件下，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401施用在低浓度阿特 拉津残留的土壤中，能够完全消除药害作用，并能缓解高浓度阿特拉津(90μg/kg)对甜 菜的药害作用。从曾经测定的土壤残留阿特拉津量来看，其残留量都小于50μg/kg，因此， 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401具有高效降解土壤中阿特拉津，减轻甚至避免 阿特拉津残留对作物的毒害作用。

附图说明

图1为降解菌gy201401的获取流程图；

图2为降解菌gy201401在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落形态；

图3为降解菌gy201401的系统发育树图；

图4为降解菌gy201401BLAST比对结果图；

图5为出苗14天甜菜幼苗在不同浓度阿特拉津残留中的生长状况正视图；

图6为出苗14天甜菜幼苗在不同浓度阿特拉津残留中的生长状况俯视图；

图7为出苗18天甜菜幼苗在不同浓度阿特拉津残留中的生长状况正视图；

图8为出苗18天甜菜幼苗在不同浓度阿特拉津残留中的生长状况俯视图；

图9为出苗26天甜菜幼苗在不同浓度阿特拉津残留中的生长状况正视图；

图10为出苗26天甜菜幼苗在不同浓度阿特拉津残留中的生长状况俯视图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一株高效降解阿特拉津的短小芽孢杆菌，它为短小芽 孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年12月29日， 保藏号为CGMCCNo.10252。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同 样也可以实现发明的目的。

本实施方式的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401是通过以下方式进行筛选的 (筛选流程图如图1所示)：

一、驯化：向土壤(黑龙江大学呼兰校区试验田未被除草剂污染过的黑土)中加入 10000倍阿特拉津，在温度为30℃、湿度为70％的条件下培养一个月；

二、富集：取步骤一驯化后的5g土样，加到含有浓度为100mg/L的阿特拉津的100mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，然后置于250mL三角瓶，在36℃振荡培养箱中160r/min振荡 培养72h；

三、转接：将步骤二富集后的培养液按10％的转接量加到含有浓度为100mg/L的阿特 拉津基础无机盐液体培养基中(阿特拉津作唯一氮源)，在250mL三角瓶中加入100mL 上述培养基，然后在温度为36℃、转速为160r/min的条件下振荡培养(培养条件下同)； 每72h取10％培养液接种到新鲜的无机盐培养基中，同时每次培养的无机盐培养基中的阿特 拉津含量都增加100mg/L，连续驯化培养一直到阿特拉津终浓度增加到600mg/L；

四、固体培养基选择培养：将步骤三最终培养的菌液做梯度稀释，对不同梯度的菌液 各取100μL涂布于基础无机盐固体培养基平板上(以阿特拉津作为唯一氮源)，于36℃ 恒温培养箱中培养；

五、筛选出目标菌株：根据菌落外观形态，挑选出外观形态不同的菌落，将这些不同 菌落分别纯化三次，得到纯化菌株。

六、将得到的纯化菌株进行降解率测定：将得到的纯化菌株制备成菌悬液，接种到含 有浓度为200mg/L阿特拉津的50mL基础无机盐液体培养基中，36℃振荡培养箱中 160r/min振荡培养72h后，用高效液相色谱检测阿特拉津的残留量，测得降解率为36.14％ 后，收集菌株；其中，液相色谱条件：色谱柱(25cm×4.6mm(id))不锈钢柱，内填C18 (5μm)，温度室温，检测波长222nm，流动相为甲醇：水＝55：45，流速，0.7mL/min， 出峰时间约17.3min。

将收集的菌株进行16SrDNA鉴定，序列长度为1576bp(如序列表Seq ID No：1 所示)，其序列提交至GenBank，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列 与短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的16SrDNA序列的同源性最高，保守区相似性为99％， 通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定它属于芽孢杆菌属，为短小 芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。有100个序列与获得序列的相似性为99％，均为芽孢杆菌 属，其中有51个序列为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。

通过以上分析可以确定，筛选的菌株即为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，我们将 其命名为小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401，并对其进行保藏，具体保藏信息为： 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年12月 29日，保藏号为CGMCC No.10252。

所述的基础无机盐培养基组分为：K₂HPO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄ 0.2g，NaCl 0.2g，葡萄糖5.0g，阿特拉津为唯一氮源，蒸馏水1000mL，pH7.0±0.2。

对上述筛选得到的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401菌株进行功能验证：

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401降解菌对阿特拉津甜菜药害消除：

1、试验方法

本试验施用到土壤的阿特拉津浓度分别为0、30、60、90、120μg/kg，按照农药浓度 由低到高依次将配制好的药液均匀喷洒在土上，使土壤与药液混拌均匀，配好的土壤按 2％接种量分别接种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401菌株，同时设加阿特拉津 不加菌株的处理和不加阿特拉津的清水处理，每个处理3次重复，每隔3天补充适量水 份，保持一定含水量。于25℃下进行静态培养一周。

本试验选用的甜菜品种为巴士森，挑选颗粒饱满的种子，消毒后恒温箱中浸种催芽，3 天后，每盆挑选已出芽的12粒甜菜种子种到培养好的土壤中，在光照培养室进行培养，培 养条件：白天温度25℃、夜间温度19℃、湿度60％、光辐射强度420μmolm^-2s^-1、光照14h/ 天。

观察甜菜的出苗和生长发育情况，测定出苗率与死亡率。

出苗率＝(甜菜出苗数/播种数)×100％；

死亡率＝(甜菜死亡数/出苗数)×100％；

在出苗后26天取样测定干物质量、叶绿素含量和净光合速率。

叶绿素含量测定参照植物生理学实验指导。

光合速率(Pn)采用LCA-4便携式光合系统分析仪测定。

2、试验结论

2.1、阿特拉津和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401降解菌对甜菜的出苗及存 活状况的影响。

试验结果看出，空白对照出苗率为97.22％，阿特拉津处理的出苗率按浓度从低到高 的顺序依次为97.22％、94.44％、94.44％、94.44％，接种了降解菌gy201401后的出苗率 分别为94.44％、94.44％、97.22％、97.22％。经过方差分析不同的处理与对照相比差异不 明显。这表明实验设计的不同浓度阿特拉津对甜菜的出苗并没有明显影响；菌液的加入 也未对甜菜出苗产生影响。因此在本试验条件下，降解菌与阿特拉津对甜菜的出苗也没 有影响。

由图5～10可知(图中的Y2是指短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401)，虽然 阿土壤中特拉津和降解菌对出苗率的影响不大，但随着时间的推移对幼苗的生长开始产生 影响。在出苗14天时，在土壤中阿特拉津残留量为60μg/kg处理中，药害并不明显；但 在90μg/kg处理中，没有施用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401处理中已有大部 分甜菜幼苗死亡，而施用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401的处理没有发生甜菜 幼苗死亡现象。

在出苗18天时，在土壤中阿特拉津残留量为60μg/kg处理中，已经能够看出药害对 甜菜幼苗生长产生了影响；在90μg/kg处理中，没有施用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) gy201401处理的甜菜幼苗生长受到严重的抑制，而施用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) gy201401处理的甜菜幼苗生长仅受到轻微的抑制作用。

在出苗26天时，在土壤中阿特拉津残留量为60μg/kg处理中，能够明显看出阿特拉 津对甜菜的药害现象，同时施用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401的处理并不明 显；在90μg/kg处理中，没有施用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401处理的甜菜 幼苗几乎没有生长，而施用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401处理的甜菜幼苗跟 对照相比，长势良好。

2.2、阿特拉津和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401降解菌对甜菜的幼苗干 物重的影响。

2.2.1阿特拉津对甜菜的幼苗干物重的影响。

阿特拉津药害盆栽试验结果表明，阿特拉津的施用对甜菜的出苗并没有影响，但对甜 菜幼苗具有很大的危害，到收获时即出苗后26天，阿特拉津浓度为120μg/kg时，甜菜幼 苗全部死亡；阿特拉津浓度为90μg/kg时，甜菜幼苗的死亡率为86.11％；低浓度的阿特 拉津即使未导致甜菜幼苗死亡，但是也严重降低了甜菜幼苗生物量。甜菜在阿特拉津残留 浓度为30μg/kg、60μg/kg和90μg/kg时，总干物质量相对于空白分别降低18.42％、40.81％ 和83.51％。

2.2.2短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401施用后各处理甜菜的幼苗干物积累 情况。

当阿特拉津残留量为30μg/kg时，加入短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401的 甜菜总干物质量相对于没有加入短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401处理的甜菜总 干物质量24.42％，相对于空白增加1.50％。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401 的施用完全消除了阿特拉津对甜菜的药害作用。

当阿特拉津残留量为60μg/kg时，加入短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401的 甜菜总干物质量相对于没有加入短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401处理的甜菜总 干物质量60.98％，相对于空白分别4.71％。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401 的施用几乎消除了阿特拉津对甜菜的药害作用。

在阿特拉津残留量为90μg/kg时，加入短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401的 甜菜总干物质量相对于没有加入短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401处理的甜菜总 干物质量413.46％，相对于空白降低15.32％。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401 的施用，能够缓解阿特拉津对甜菜的药害作用。

2.3、阿特拉津和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401对甜菜光合作用的影响

2.3.1、阿特拉津和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401对甜菜叶片叶绿素含量 的影响

甜菜在阿特拉津残留浓度为30μg/kg、60μg/kg和90μg/kg时，总叶绿素含量相对于空 白分别降低了5.34％、8.75％和11.86％。

在阿特拉津残留量为30μg/kg时，加入短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401的 甜菜总叶绿素含量相对于没有加入降解菌处理的甜菜总干物质量增加6.10％，相对于空白 增加0.44％；在阿特拉津残留量为60μg/kg时，加入短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) gy201401的甜菜总叶绿素含量相对于没有加入短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401 处理的甜菜总干物质量增加9.54％，相对于空白降低0.04％；在阿特拉津残留量为90μg/kg 时，加入短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401的甜菜总叶绿素含量相对于没有加入 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401处理的甜菜总叶绿素含量增加12.48％，相对 于空白降低0.86％。

由此说明，阿特拉津残留对甜菜叶绿素的形成有抑制作用，短小芽孢杆菌(Bacillus  pumilus)gy201401在阿特拉津残留量为30μg/kg和60μg/kg时，消除了阿特拉津对甜菜 叶绿素形成的抑制作用，在90μg/kg时缓解了抑制作用。

2.3.2、阿特拉津和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401对甜菜叶片净光合速率 的影响

甜菜在阿特拉津残留浓度为30μg/kg、60μg/kg和90μg/kg时，甜菜的净光合速率相对 于空白分别降低了2.18％、10.13％和16.76％。

在阿特拉津残留量为30μg/kg时，加入短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401的 甜菜净光合速率相对于没有加入短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401处理的甜菜净 光合速率增加2.55％，相对于空白增加0.31％；在阿特拉津残留量为60μg/kg时，加入短 小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401的甜菜净光合速率相对于没有加入短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus)gy201401处理的甜菜净光合速率增加8.50％，相对于空白降低2.49％； 在阿特拉津残留量为90μg/kg时，加入短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401的甜菜 净光合速率相对于没有加入短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401处理的甜菜净光合 速率增加7.77％，相对于空白降低10.29％。

由此说明，阿特拉津残留对甜菜的净光合速率有抑制作用，短小芽孢杆菌(Bacillus  pumilus)gy201401在阿特拉津残留量为30μg/kg时，消除了阿特拉津对甜菜净光合速率 的抑制作用，在60μg/kg和90μg/kg时缓解了抑制作用。

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401施用对阿特拉津残留的污染具有显著的修 复作用，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)gy201401的施用可保证敏感作物甜菜的正常总 干物质量、叶绿素含量和净光和速率。在本试验条件下，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) gy201401施用在低浓度阿特拉津残留的土壤中，能够完全消除药害作用，并能缓解高浓 度阿特拉津(90μg/kg)对甜菜的药害作用。