一种新的具有抗Xa因子活性的磺酸化五糖化合物

摘要

本发明涉及一种具有抗Xa因子活性的磺酸化五糖化合物及其制备方法和用途，此化合物为具有抗凝血作用的五糖化合物的衍生物，具有显著的抗Xa因子活性。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种新的化合物，具体涉及一种新的具有抗Xa因子活 性的磺酸化五糖化合物。

技术背景

血栓性疾病是严重危害人类健康的疾病，根据血栓形成部位、条件与性质，主要分为动 脉血栓与静脉血栓。动脉血栓形成是从动脉血管壁动脉粥样硬化病变与血小板激活开始，其 导致的严重临床疾病主要为急性心肌梗死、脑卒中；静脉血栓由静脉血管中多种原因诱发形 成，可导致静脉血栓栓塞，其主要临床表现为深静脉血栓形成和肺栓塞。大规模临床试验证 据显示，抗凝治疗可阻止血栓的蔓延和复发，并进一步降低脑卒中、肺栓塞等的发生率和死 亡率。因此，抗凝治疗已成为目前临床预防和治疗血栓栓塞性疾病的核心和基础，而抗凝药 物的研发也始终是新药研发的热点。

目前，正在研发或已经上市的新型抗凝药物主要包括直接凝血酶抑制剂、Xa因子抑制剂、 IX因子抑制剂、组织因子抑制剂以及新型维生素K拮抗剂。其中，直接凝血酶抑制剂和Xa 因子抑制剂是最具代表性的抗凝新药。

磺达肝癸钠是一种人工合成的选择性活化因子(Xa)抑制剂，通过与AT III的选择性结 合，增强了AT III对因子Xa固有的中和作用，因子Xa的中和作用可干扰凝血级联系统，并 能同时抑制凝血酶形成和血栓发展，其化学结构式如下(用D、E、F、G、H分别表示从左 至右5个单糖)：

发明内容

本发明目的在于提供一种具有抗Xa因子活性的磺酸化五糖化合物(以下简称为化合物 A)。

本发明所述的化合物A，经测定其具有非常好的抗Xa因子活性，其抗Xa效价为612 IU/mg，约是磺达肝癸钠的1.5倍，具有极高的药用价值和显著的治疗效果。

本发明所述的化合物A，其化学结构式如下(用D、E、F、G、H分别表示从左至右5 个单糖)：

本发明的另一个目的在于提供化合物A的制备方法。

具体的，本发明的化合物A的合成路线如下：

本发明所述的化合物A的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，D的制备：

将D1以适量无水二氯甲烷溶解，加入三氯乙腈，加入DBU，室温反应0.5h，得产品D；

步骤2，DEF的制备：

,将D和EF溶于适量无水二氯甲烷中，加入适量干燥4A分子筛，室温下搅拌30分钟后， 于氮气保护、-20℃下加入三氟甲磺酸三甲基硅酯的二氯甲烷溶液，反应30分钟，得DEF1。 将DEF1溶于适量乙酸酐中，于氮气保护、0℃下加入三氟甲磺酸三甲基硅酯的二氯甲烷 溶液，室温反应3小时；再加入氨水，室温反应4小时；最后加入适量三氯乙腈和DBU， 氮气保护，室温反应3小时，得产品DEF；

步骤3，GH的制备：

,将G、BSP和4A分子筛溶于无水二氯甲烷，氮气保护下室温搅拌30min，降温至-60℃， 缓慢滴加Tf₂O，滴毕后，温度升至-40℃，加入用无水二氯甲烷溶解稀释后的H，-40℃反 应1h，得产品GH1。将GH1溶于适量无水二氯甲烷中，在室温下加入三乙胺，反应3h， 得产品GH；

步骤4，DEFGH的制备：

,将DEF和GH溶于适量无水二氯甲烷中，加入适量干燥4A分子筛，室温搅拌30分钟后，于 氮气保护、-20℃下加入适量三氟甲磺酸三甲基硅酯的二氯甲烷溶液，反应1小时，加入适 量三乙胺，搅拌30分钟，过滤，滤液浓缩至干，加入适量二氯甲烷溶解，依次用水洗，无 水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩至干，过硅胶柱，得产品DEFGH；

步骤5，化合物A的制备

,将DEFGH溶于THF，加入纯化水，之后滴加NaOH溶液，反应18小时，滴加盐酸中和， 然后加入三氯甲烷萃取，取有机相，减压浓缩至干。所得样品溶于DMF，加入三氧化硫 三甲胺络合物，氮气保护，反应18小时，减压浓缩，滤液上样至葡聚糖凝胶LH-20层析 柱除盐，将收集的产品液减压蒸馏，并上样至732钠型强酸性阳离子交换树脂层析柱，将 收集的产品液减压浓缩至干。将所得样品、纯化水和10％钯碳加入氢化釜中，釜内加氢至 1.5MPa，反应68小时，反应结束后，过滤，将滤液减压浓缩。将浓缩剩余物移至反应釜 中，加入纯化水，将三氧化硫吡啶络合物分批加入反应釜中，反应7小时，至溶液澄清透 明后，过滤，上样至葡聚糖凝胶G-25层析柱脱盐，将收集的产品液减压蒸馏，并上样至 732钠型强酸性阳离子交换树脂层析柱，将收集的产品液减压浓缩至干，经制备纯化后得 化合物A。

优选的，本发明化合物A的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，D的制备：

将D1(18.0g，42.1mmol)溶于90ml无水二氯甲烷中，加入三氯乙腈(21ml，209.4mmol)， 加入DBU(1.3ml，8.7mmol)，室温反应0.5h。减压浓缩至干，过硅胶柱，得产品D(22.6g， 39.6mmol)。

步骤2，DEF的制备：

将D(22.6g，39.6mmol)和EF(17.5g，29.2mmol)溶于200ml无水二氯甲烷中，加入 40g干燥4A分子筛，室温下搅拌30分钟后，于氮气保护、-20℃下加入TBSOTf(2.7ml， 11.8mmol)的二氯甲烷溶液，反应30分钟，过硅胶柱，得DEF1(19.0g，18.8mmol)。将 DEF1(19.0g，18.8mmol)溶于95ml乙酸酐中，于氮气保护、0℃下加入TBSOTf(0.9ml， 3.9mmol)的二氯甲烷溶液，室温反应3小时；再加入氨水2ml，室温反应4小时；最后 加入三氯乙腈(11.3ml，113.0mmol)和DBU(0.4ml，2.7mmol)，氮气保护，室温反应3 小时，过硅胶柱，得产品DEF(11.1g，9.2mmol)。

步骤3，GH的制备：

将G(30.0g，41.8mmol)、BSP(11.4g，54.6mmol)和30g干燥的4A分子筛溶于150ml 无水二氯甲烷，氮气保护下室温搅拌30min，降温至-60℃，缓慢滴加Tf₂O(9.6ml， 58.5mmol)，滴毕后，温度升至-40℃，加入用无水二氯甲烷溶解稀释后的H(23.1g， 50.4mmol)，-40℃反应1h，过硅胶柱，得产品GH1(16.5g，15.8mmol)。将GH1(16.5g， 15.8mmol)溶于150ml无水二氯甲烷中，在室温下加入三乙胺(55ml，294.7mmol)，反 应3h，过硅胶柱，得产品GH(11.8g，14.0mmol)。

步骤4，DEFGH的制备：

将DEF(11.1g，9.2mmol)和GH(9.3g，11.0mmol)溶于100ml无水二氯甲烷中，加入20g 干燥的4A分子筛，室温搅拌30分钟后，于氮气保护、-20℃下加入TMSOTf(0.7ml，3.9mmol) 的二氯甲烷溶液，反应1小时，加入适量三乙胺，搅拌30分钟，过滤，滤液浓缩至干，加 入适量二氯甲烷溶解，依次用水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩至干，过硅胶柱， 得产品DEFGH(12.2g，6.4mmol)。

步骤5，化合物A的制备：

将DEFGH(12.2g，6.4mmol)溶于150ml四氢呋喃中，加入80ml纯化水，之后滴加1N 氢氧化钠溶液120ml，室温反应18小时，滴加1N盐酸中和，然后加入三氯甲烷萃取，取 有机相，减压浓缩至干。所得样品溶于100ml N,N-二甲基甲酰胺中，加入三氧化硫三甲胺 络合物(15.5g，112.0mmol)，氮气保护，60℃反应18小时，减压浓缩，滤液上样至葡聚 糖凝胶LH-20层析柱除盐，将收集的产品液减压蒸馏，并上样至732钠型强酸性阳离子 交换树脂层析柱，将收集的产品液减压浓缩至干。将所得样品、360ml纯化水和10.8g 10％ 钯碳加入氢化釜中，釜内加氢至1.5MPa，30℃反应68小时，反应结束后，过滤，将滤液 减压浓缩。将浓缩剩余物移至反应釜中，加入纯化水，将三氧化硫吡啶络合物(9.5g， 59.7mmol)分批加入反应釜中，10℃反应7小时，至溶液澄清透明后，过滤，上样至葡聚 糖凝胶G-25层析柱脱盐，将收集的产品液减压蒸馏，并上样至732钠型强酸性阳离子交 换树脂层析柱，将收集的产品液减压浓缩至干，经制备纯化后得化合物A(2.6g，1.5mmol)。

本发明的另一个目的在于提供一种含有化合物A的药物组合物。

本发明的药物组合物中的药物活性物质为本发明的化合物，其在制剂中所占重量百分比 可以是0.01-99.99％，其余为药物可接受的载体。

本发明的药物组合物，在使用时可以根据需要制备成任何药物制剂形式，如口服制剂形 式，注射剂形式等。

本发明的药物组合物在制备成药物制剂时，根据需要可以加入药学上可接受的载体。

本发明的药物组合物，以单位剂量的制剂形式存在，所述单位剂量是指制剂的单位，如 片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋，注射剂的每支等。

本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜 衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸 剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、 喷雾剂、滴剂、滴丸剂、贴剂。

本发明的药物组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、 稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。

适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀 粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸 镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

本发明可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使 活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。

口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者 可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的 添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维 素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶； 非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙 二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可 含有常规的香味剂或着色剂。

对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度， 可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将 其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和 缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻， 并在真空下将水除去。

本发明的药物组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述 药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半 胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、 醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、 木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍 生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、 碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β－环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬 脂酸钙、硬脂酸镁等。

优选的，本发明药物剂型为注射剂。

本发明所述注射剂，单位制剂中化合物A的含量为1.5mg-6.5mg。

本发明的另一个目的在于提供化合物A的药物用途。

本发明所述的化合物A在在制备具有抗Xa因子活性的药物中的应用。

本发明所述的化合物A在制备治疗血栓性疾病的药物中的应用。

本发明所述血栓性疾病主要分为动脉血栓与静脉血栓性疾病。

本发明还提供化合物A化学结构和纯度的测定方法。

本发明所述化合物A的纯度测定方法，包括以下步骤：

采用高效液相色谱仪，以季铵阴离子薄壳树脂为填充剂的聚合阴离子交换柱，水和氯化 钠溶液为流动相，检测化合物A的纯度。

本发明的具体检测方法请见说明书实施例2.

本发明还提供化合物A的结构测定。

本发明通过核磁和质谱鉴定化合物A的结构。从核磁氢谱看，与磺达肝癸钠相比，2.74 处多了一个甲基峰，H糖2位的氢化学位移由3.25移向低场3.66，H糖3位的氢由3.62移向3.93， 其他位置变化不大。从核磁碳谱看，与磺达肝癸钠相比，32.76处多了一个碳峰，H糖2位的碳 由60.37移向62.85，H糖1位和3位的碳也有不同程度的变化，其他位置变化不大。通过高分辨 质谱检测，推断该化合物的精确分子量为：1740.7864，分子式为C₃₂H₄₅N₃Na₁₀O₄₉S₈。结合质 谱可以推断与H糖2位相连的氨基上的氢被甲基取代，使得H糖2位的氢的化学位移移向低场， 同时，H糖1位与3位也发生了变化。

本发明按照国家食品药品监督管理局颁布的，低分子量肝素钙的国家药品标准WS1- (X-147)-2005Z中效价测定法测定化合物A的抗Xa因子(FXa)活性。测定化合物A的抗Xa 因子效价为612IU/mg，磺达肝癸钠效价为400IU/mg，低分子量肝素钙效价为105IU/mg。

化合物A属于新的化合物，目前国内外文献专利未对其进行报导。通过对化合物A 的抗Xa因子活性进行测定，其抗Xa效价为612IU/mg，大约是磺达肝癸钠的1.5倍，其表 现出更好的抗Xa因子活性，未来有可能成为磺达肝癸钠的升级或更新换代品种。

此外，作为新的化合物，化合物A可能还具有其它潜在的药理方面的作用，从长远考虑， 经过更加深入的研究，其还会有更高的价值。

本发明的化合物A与现有产品相比较，具有生物活性强，副作用少等特点。如比磺达肝 癸钠和低分子肝素钙具有更强的生物活性；化合物A属于单一化合物，比属于混合物的低分 子肝素钙的副作用少。

本发明所述化合物D1，EF、G,、H，属于现有产品，可以在市场上购买到。

对文中所述的名词作进一步的解释：

DBU：1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯

TBSOTf：三氟甲磺酸三甲基硅酯

TMSOTf：三氟甲磺酸三甲基硅脂

BSP：1-(苯基亚硫酰基)哌啶

上述原料属于现有产品，可以在市场上买到。

附图说明

图1：本发明化合物A的液相色谱图

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明作进一步的解释，但不作为本发明的限制。

实施例1：化合物A的制备

步骤1，D的制备：

将D1(18.0g，42.1mmol)溶于90ml无水二氯甲烷中，加入三氯乙腈(21ml，209.4mmol)， 加入DBU(1.3ml，8.7mmol)，室温反应0.5h。减压浓缩至干，过硅胶柱，得产品D(22.6g， 39.6mmol)。

步骤2，DEF的制备：

将D(22.6g，39.6mmol)和EF(17.5g，29.2mmol)溶于200ml无水二氯甲烷中，加入 40g干燥4A分子筛，室温下搅拌30分钟后，于氮气保护、-20℃下加入TBSOTf(2.7ml， 11.8mmol)的二氯甲烷溶液，反应30分钟，过硅胶柱，得DEF1(19.0g，18.8mmol)。将 DEF1(19.0g，18.8mmol)溶于95ml乙酸酐中，于氮气保护、0℃下加入TBSOTf(0.9ml， 3.9mmol)的二氯甲烷溶液，室温反应3小时；再加入氨水2ml，室温反应4小时；最后 加入三氯乙腈(11.3ml，113.0mmol)和DBU(0.4ml，2.7mmol)，氮气保护，室温反应3 小时，过硅胶柱，得产品DEF(11.1g，9.2mmol)。

步骤3，GH的制备：

将G(30.0g，41.8mmol)、BSP(11.4g，54.6mmol)和30g干燥的4A分子筛溶于150ml 无水二氯甲烷，氮气保护下室温搅拌30min，降温至-60℃，缓慢滴加Tf₂O(9.6ml， 58.5mmol)，滴毕后，温度升至-40℃，加入用无水二氯甲烷溶解稀释后的H(23.1g， 50.4mmol)，-40℃反应1h，过硅胶柱，得产品GH1(16.5g，15.8mmol)。将GH1(16.5g， 15.8mmol)溶于150ml无水二氯甲烷中，在室温下加入三乙胺(55ml，294.7mmol)，反 应3h，过硅胶柱，得产品GH(11.8g，14.0mmol)。

步骤4，DEFGH的制备：

将DEF(11.1g，9.2mmol)和GH(9.3g，11.0mmol)溶于100ml无水二氯甲烷中，加入20g 干燥的4A分子筛，室温搅拌30分钟后，于氮气保护、-20℃下加入TMSOTf(0.7ml，3.9mmol) 的二氯甲烷溶液，反应1小时，减压浓缩至干，过硅胶柱，得产品DEFGH(12.2g，6.4mmol)。

步骤5，化合物A的制备：

将DEFGH(12.2g，6.4mmol)溶于150ml四氢呋喃中，加入80ml纯化水，之后滴加1N 氢氧化钠溶液120ml，反应18小时，滴加1N盐酸中和，然后加入三氯甲烷萃取，取有机 相，减压浓缩至干。所得样品溶于100ml N,N-二甲基甲酰胺中，加入三氧化硫三甲胺络合 物(15.5g，112.0mmol)，氮气保护，反应18小时，减压浓缩，滤液上样至葡聚糖凝胶 LH-20层析柱除盐，将收集的产品液减压蒸馏，并上样至732钠型强酸性阳离子交换树脂 层析柱，将收集的产品液减压浓缩至干。将所得样品、360ml纯化水和10.8g 10％钯碳加 入氢化釜中，釜内加氢至1.5MPa，反应68小时，反应结束后，过滤，将滤液减压浓缩。 将浓缩剩余物移至反应釜中，加入纯化水，将三氧化硫吡啶络合物(9.5g，59.7mmol)分 批加入反应釜中，反应7小时，至溶液澄清透明后，过滤，上样至葡聚糖凝胶G-25层析 柱脱盐，将收集的产品液减压蒸馏，并上样至732钠型强酸性阳离子交换树脂层析柱，将 收集的产品液减压浓缩至干，经制备纯化后得化合物A(2.6g，1.5mmol)。

实施例2通过高效液相色谱仪器检测化合物A

色谱柱为Dionex CarboPac^TM PA1(250×4mm)，流速为1.0ml/min，检测波长为210nm， 柱温为35℃，以水为流动相A(1000ml水中加入约10μl二甲亚砜)，116.9g/l氯化钠溶液为流 动相B，梯度如表所示：

化合物A的纯度检测结果如附图1所示：保留时间为16.304min，纯度为99.73％。

实施例3：通过核磁和质谱对化合物A进行结构鉴定

仪器检测条件：Agilent 6520 Q-TOF LCMS高分辨质谱仪，流速1ml/min，进样1μl，离 子源ESI；BRUKER 400MHz核磁共振仪；溶剂：D₂O；内标：TMS。检测数据如下：

表1氢谱与碳谱数据

表2高分辨质谱数据

从核磁氢谱看，如表1所示，与磺达肝癸钠相比，2.74处多了一个甲基峰，H糖2位的氢化 学位移由3.25移向低场3.66，H糖3位的氢由3.62移向3.93，其他位置变化不大。从核磁碳谱看， 与磺达肝癸钠相比，32.76处多了一个碳峰，H糖2位的碳由60.37移向62.85，H糖1位和3位的 碳也有不同程度的变化，其他位置变化不大。通过高分辨质谱检测，如表2所示，推断该化合 物的精确分子量为：1740.7864，分子式为C₃₂H₄₅N₃Na₁₀O₄₉S₈。结合质谱可以推断与H糖2位相 连的氨基上的氢被甲基取代，使得H糖2位的氢的化学位移移向低场，同时，H糖1位与3位也 发生了变化。由此确定，化合物A的结构式如下：

实施例4：化合物A的Xa因子(FXa)活性检测

按照国家食品药品监督管理局颁布的，低分子量肝素钙的国家药品标准WS1-(X-147) -2005Z中效价测定法测定，即体外通过抗凝血酶III(AT III)与低分子肝素(LMWH)标准 品比较以测定供试品加速抑制Xa因子(FXa)的活性。具体方法如下：

一、溶液配制

三羟甲基氨基甲烷-氯化钠缓冲液(pH 7.4)：取三羟甲基氨基甲烷6.08g和氯化钠8.77g 加水500ml使溶解，加牛血清白蛋白10g，用盐酸调节pH值至7.4，加水稀释至1000ml。

三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四醋酸二钠缓冲液(pH 8.4)：取氯化钠5.12g、三羟甲基氨基 甲烷3.03g和乙二胺四醋酸二钠1.4g，加水250ml使溶解，用盐酸调节pH值至8.4，加水稀释 至500ml。

LMWH标准品及供试品溶液的配制：用三羟甲基氨基甲烷-氯化钠缓冲液(pH 7.4)分别 将标准品(S)和供试品(T)稀释成4个不同浓度的溶液，各剂量间的剂距比一般为1:0.7～ 1:0.6该浓度应在log剂量-反应的线性范围内。一般为每1ml中含0.025IU～0.2IU。

抗凝血酶(AT III)溶液：以三羟甲基氨基甲烷-氯化钠缓冲液(pH 7.4)制成每1ml中含1IU 的溶液。

发色底物s-2765(或其他FXa特异性发色底物)：溶液用水制成0.003mol/L的溶液，临用 前用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四醋酸二钠缓冲液(pH 8.4)稀释至0.0005mol/L。

Xa因子(FXa)溶液：用三羟甲基氨基甲烷-氯化钠缓冲液(pH 7.4)，配制FXa溶液， 调试其浓度，使之在用0.9％氯化钠溶液代替LMWH的抗Xa因子实验中，在405nm的波长处 的吸收值在0.6～0.7。

二、测定法

取小试管16支，分别标记T₁、T₂、T₃、T₄及S₁、S₂、S₃、S₄。各浓度平行做两管。每管分 别加人4种浓度的供试品(T)或标准品(S)稀释液50μl，及抗凝血酶溶液50μl，混匀(不 得产生气泡)。按S₁、S₂、S₃、S₄、T₁、T₂、T₃、T₄、T₁、T₂、T₃、T₄、S₁、S₂、S₃、S₄顺序 排列，37℃平衡1分钟。每管加FXa溶液100μl，混匀，37℃平衡1分钟，加发色底物溶液250 μl，混合，37℃准确保温4分钟后，各加30％醋酸溶液375μl，终止反应。用1cm光程的半微 量比色池，以三羟甲基氨基甲烷-氯化钠缓冲液(pH 7.4)为空白，在405nm的波长处测定每 管的吸光度。以三轻甲基氨基甲烷-氯化钠缓冲液(pH 7.4)代替供试品溶液(平行做两管) 同法操作作为空白对照管，在16支管开始和结尾时，分别测定空白对照管的吸光度。两者的 吸光度不得有显著性差异。以吸光度为纵坐标，标准品溶液(或供试品溶液)浓度的对数值 为横坐标分别作线性回归，按生物检定统计法(中国药典2005年版二部附录X IV)中的量反 应平行线原理4×4法实验设计，计算效价及实验误差。平均可信限率(FL％)不得大于15％。 三、试验结果

经上述方法测定，化合物A的抗Xa因子效价为612IU/mg，磺达肝癸钠效价为400IU/mg, 低分子量肝素钙效价为105IU/mg。与磺达肝癸钠相比，化合物A的抗Xa因子效价约为其1.5 倍。

实施例5化合物A注射液

处方：

制备工艺：

步骤1，在无菌条件下，取处方量80％注射用水，加入处方量氯化钠溶解，以0.1M氢氧 化钠或盐酸溶液调节pH至5.0-8.0；

步骤2，在无菌条件下，取处方量化合物A加入上述溶液中，搅拌，使溶解；

步骤3，在无菌条件下，向上述所得溶液中加入注射用水至全量；

步骤4，在无菌条件下，向上述所得溶液加入0.1％药用炭，保温，搅拌30分钟；

步骤5，在无菌条件下，将上述所得溶液分装至玻璃安瓿中，即得成品。