microRNA-548k抑制剂在治疗和/或预防食管鳞状细胞癌中的用途

摘要

本发明涉及microRNA-548k抑制剂在治疗和/或预防食管鳞状细胞癌中的用途。另一方面，本发明涉及microRNA-548k作为分子标记物用于诊断食管鳞状细胞癌。

说明书

技术领域

本发明涉及microRNA-548k抑制剂在治疗和/或预防食管鳞状细胞 癌的技术领域。另一方面，本发明涉及microRNA-548k作为分子标记 物用于诊断食管鳞状细胞癌的技术领域。

背景技术

食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌， 其是全世界癌症死亡的第六大原因，参见Kamangar,F.,G.M.Dores,等 人(2006)."Patterns of cancer incidence,mortality,and prevalence across  five continents:defining priorities to reduce cancer disparities in different  geographic regions of the world."J Clin Oncol24(14):2137-2150。全球大 约70%的食管癌发生在中国，而在中国90%的食管癌的为食管鳞状细 胞癌。到目前为止，对食管鳞状细胞癌的发生发展机制了解甚少，因 此针对食管鳞状细胞癌早期诊断及治疗的手段和方法非常有限，食管 鳞状细胞癌患者的5年生存率只有10%，参见Xu,Y.,X.Yu,等人 (2012)."Neoadjuvant versus adjuvant treatment:which one is better for  resectable esophageal squamous cell carcinoma?"World J Surg Oncol10: 173；Zhang,S.W.,M.Zhang,et al.(2012)."An Analysis of Incidence and  Mortality of Esophageal Cancer in China,2003～2007."China Cancer21(4): 241-247。分子靶向治疗为近年来研究热点，并在部分恶性肿瘤治疗中 取得突破性进展。如吉非替尼（Irresa）治疗非小细胞肺癌，尤其女性、 不吸烟、腺癌患者预后更佳；伊马替尼治疗胃肠道间质瘤,特别是对于 有Kit外显子11突变者可获得更好的疗效，参见Nilsson B,S.K., Kindblom LG,等人(2007)."Adjuvant imatinib treatment improves  recurrence-free survival in patients with high-risk gastrointestinal stromal  tumours(GIST)."Br J Cancer96:1656-1658(Nilsson B2007)；C225联合 放疗治疗局部晚期头颈部癌，较单纯放疗，生存率提高近1倍，参见 Bonner JA,H.P.,Giralt J,等人(2006)."Radiotherapy plus cetuximab for  squamous-cell carcinoma of the head and neck."N Engl J Med354: 567-578。因此，阐明食管鳞状细胞癌发生发展的分子机制是人类攻克 食管鳞状细胞癌的前提。

MicroRNA由18-25个核苷酸组成，系非编码RNA分子，可以通 过和mRNA结合抑制mRNA功能，调节翻译过程。MicroRNA在肿瘤 中的发生和发展中均发挥了重要作用，并且有些MicroRNA还与肿瘤 的预后相关，如在慢性淋巴瘤，急性髓细胞样白血病，非小细胞肺癌， 胰腺癌，神经母细胞瘤，结肠癌，小细胞肺癌中得到证实：miRNA对 预后影响显著。

microRNA-548k定位于11号染色体，含有22个核苷酸，其genbank 登录号为：Gene ID:100313770，在文献中未见报道对其相关功能的 研究。

本发明人运用高通量测序和比较基因组杂交技术对我国食管鳞状 细胞癌的基因组进行了研究，出人意料的发现，11q13.3-13.4这个区域 在48.1%的样本中存在扩增，且与淋巴结转移相关，此外，在这个区域 中存在microRNA-548k的同步高表达。随后我们的功能实验表明， microRNA-548k在食管鳞状细胞瘤细胞系中普遍存在高表达，并且 microRNA-548k能正性调节食管鳞状细胞瘤细胞的恶性表型。因此， microRNA-548k有望可以作为食管鳞状细胞癌诊断的分子标志物和治 疗的靶点。

发明内容

本发明提供了microRNA-548k抑制剂用于制备治疗和/或预防食管 鳞状细胞癌的药物中的用途。

优选地，根据本发明的microRNA-548k抑制剂是核酸抑制剂；进 一步优选地，本发明的核酸抑制剂是与microRNA-548k序列互补的反 义核酸分子。

另一方面，本发明提供了一种或多种特异地检测microRNA-548k 表达水平的引物和/或探针在制备用于诊断食管鳞状细胞癌患者的试剂 中的用途。

更进一步地，根据本发明所述引物和/或探针包含与 microRNA-548k序列互补的核苷酸序列，或由与microRNA-548k序列 互补的核苷酸序列组成。

优选地，根据本发明的诊断食管鳞状细胞癌患者的用途中其进一 步包括：

a）提供来自个体的食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织的样品；和

b）确定样品中如microRNA-548k的表达水平；

c）比较癌组织和癌旁组织的样品中microRNA-548k的表达水平。 优选地，在上述用途中，其中在所述步骤b)中使用选自宏阵列筛选、 微阵列筛选、纳米阵列筛选、逆转录PCR、实时PCR或原位PCR的 方法进行。

优选地，根据本发明所述的用途，其中所述食管鳞状细胞癌指哺 乳动物中的食管鳞状细胞癌。

进一步优选地，根据本发明所述的用途，其中所述哺乳动物是人。

另一方面，本发明提供了一种治疗和/或预防哺乳动物食管鳞状细 胞癌的方法，包括向遭受所述癌症的患者给药治疗有效量的 microRNA-548k抑制剂。

附图说明

图1表明人食管鳞状细胞癌的肿瘤组织分析的电泳结果。

图2表明改变microRNA-548k表达后对细胞生长的影响情况。其 中，miR-NC指microRNA阴性对照。

图3A-3F表明改变microRNA-548k表达后对细胞克隆形成的影响 情况。图3A和3B表明在KYSE30细胞系中microRNA-548k表达的改 变对细胞克隆形成的影响；图3C和3D表明在KYSE150细胞系中 microRNA-548k表达的改变对细胞克隆形成的影响；图3E和3F表明 在KYSE410细胞系中microRNA-548k表达的改变对细胞克隆形成的 影响。

图4A-4I表明改变microRNA-548k表达后对细胞迁移及侵袭的影 响情况。图4A-4C表明microRNA-548k表达的改变对KYSE30细胞系 迁移及侵袭的影响；图4D-4F表明microRNA-548k表达的改变对 KYSE150细胞系迁移及侵袭的影响；图4G-4I表明microRNA-548k表 达的改变对KYSE410细胞系迁移及侵袭的影响。

具体实施方式

本发明涉及一重要基因microRNA-548k用于研究食管鳞状细胞癌 发生发展的研究。具体的，基因microRNA-548k在食管鳞状细胞癌发 生发展中发挥重要作用。基因microRNA-548k在食管鳞状细胞癌中普 遍高表达。高表达基因microRNA-548k可以促进食管鳞状细胞癌细胞 系的生长、克隆形成、迁移及侵袭能力，而抑制基因microRNA-548k 表达后则能明显的下调食管鳞状细胞癌细胞系的生长、克隆形成、迁 移及侵袭能力。因此，基因microRNA-548k在食管癌的诊断及治疗中 都将有重要的作用。

本发明涉及的检测方法包括DNA提取、二代全基因组测序、比较 基因组杂交、RNA提取、qRT-PCR、生长曲线、克隆形成及transwell 等。鉴于发明人已经找到和验证了基因microRNA-548k在食管鳞状细 胞癌发生和发展中的作用，在今后科研研究及临床应用中，microRNA 提取及qRT-PCR两种技术运用的较为普遍。这两种方法对于本领域的 技术人员为常规操作。因此，该成果在在科研和临床中容易被运用。

本发明的具体实施方案中，检测待测样品中microRNA-548k表达 情况的大致方法如下：

1）提取患者新鲜食管鳞状细胞癌组织及匹配血液中的全DNA；

2）二代全基因组测序技术及比较基因组杂交芯片检测肿瘤组织及 匹配血液标本；

3）二代全基因组测序数据及芯片数据处理：对二代全基因组测序 数据及芯片数据根据hg19数据库进行注释，然后全基因组测序数据用 SegSeq及DNAcopy方法处理而获得基因拷贝数改变情况(Venkatraman  and Olshen2007;Chiang,Getz et al.2009).，比较基因组杂交芯片数据用 SegMNT及DNAcopy方法处理而获得基因拷贝数改变情况(Olshen, Venkatraman et al.2004;Venkatraman and Olshen2007)；将肿瘤组织样 本中基因拷贝数改变情况比对匹配的血液样本中基因拷贝数改变情 况，最终获得肿瘤组织样本中基因拷贝数改变的真实情况。

4）基因扩增验证：利用根据microRNA-548k基因序列设计的引物 行qRT-PCR扩增。

5）功能实验验证：提取食管鳞状细胞癌细胞系及永生化正常食管 细胞RNA,根据microRNA-548k基因序列设计的引物行qRT-PCR扩 增，比较食管鳞状细胞癌细胞系及永生化正常食管细胞中 microRNA-548k基因扩增情况。根据qRT-PCR结果挑选合适细胞系分 别高表达及抑制microRNA-548k基因表达，通过生长曲线、克隆形成、 迁移及侵袭实验研究microRNA-548k基因在食管鳞状细胞癌发生发展 中的作用。

本发明将在下面的实施例中进一步描述，但本发明并不局限于这 些实施例。

实施例1：检测microRNA-548k基因表达情况的方法

1.样本Total RNA提取–Trizol法提取组织、细胞总RNA

（1）样本处理（细菌、细胞不用研磨）；

在铝箔中将1cm2大小左右的组织样本敲碎，移至已加入钢珠的 Eppendorf管中，使用研磨仪（301/s，8min）进行研磨

注：此步操作应尽可能在低温液氮环境下操作，细菌、细胞样本 不用研磨。

（2）在研磨后的Eppendorf管中加入1ml Trizol，振荡混匀；

（3）将混匀后溶液移至一新Eppendorf管中，加入200μl氯仿， 振荡混匀；

（4）离心：4℃，12000rpm，15min；

（5）将离心后上清液移至一新Eppendorf管中，加入500μl异丙 醇，轻轻混匀，室温静置15min；

（6）离心：4℃，12000rpm，15min；

（7）倒掉上清液，加入1ml75%乙醇，振荡混匀；

（8）离心：4℃，7500rpm，5min；

（9）倒掉上清液，并在超净台中将乙醇挥发干净；

（10）加入40～60μl DEPC H2O，65℃5min助溶；

（11）-20℃冷冻保存。

2.Total RNA质量检测

（1）NanoDrop测定Total RNA浓度（2μl Total RNA上样）

（2）1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量

甲醛变性琼脂糖凝胶：30ml1×TBE Buffer中加入0.45g琼脂糖， 微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀（肉眼观察无颗粒状 悬浮物），冷却至60℃左右时加入600μl甲醛，混匀，倒入RNA专 用的制胶器中（7.5×5.5cm），室温静置30min左右即可使用。

电泳条件：120～130V，15～20min。

3.miRNA逆转录：

（1）逆转录反应体系

（2）逆转录程序：16℃30min，37℃30min，70℃10min，4℃for  ever。

4.miRNA RealTime PCR反应

（1）miRNA RealTime PCR反应体系

（2）miRNA RealTime PCR程序

（3）miRNA RealTime PCR产物1.5%非变性（不加甲醛）琼脂糖 凝胶电泳检测

miRNA RealTime PCR产物         2～4μl

2×Loading Buffer           4μl

总体积约为6～8μl

非变性琼脂糖凝胶：80ml1×TBE Buffer中加入1.2g琼脂糖，微 波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀（肉眼观察无颗粒状悬 浮物），冷却至60℃左右时加入2μl EB（原液）混匀，倒入制胶器中 （15×15cm），室温静置30min左右即可使用。

电泳条件：100V，25～30min。

5.数据收集及处理：采用U6RNA作为内标，进行归一化处理。

实施例2：microRNA-548k在人食管癌细胞系中的表达水平

利用实时PCR方法测得microRNA-548k在食管鳞状细胞癌细胞系 和正常食管细胞中的表达情况（参见图1）。其中，横坐标代表正常细 胞系（NE2及H5E973）和人类食管癌细胞系。与正常细胞系相比，人 食管癌细胞系中microRNA-548k的表达水平增加。

实施例3：改变microRNA-548k表达后对细胞生长的影响情况

在本实施例中，microRNA-548k序列互补的反义核酸作为抑制剂 使用;在“拟态”的情况中，通过转染与microRNA-548k同样的序列 而导致细胞内microRNA-548k的表达水平上升。在使用抑制剂及拟态 的情况下，细胞中microRNA-548k的表达水平分别下调了约2-11倍， 或上调了约5万倍。在miR-NC阴性对照的情况中，采用转染入线虫 的microRNA序列，因为它与人的不是同源的而人也没有相关的 mircroRNA，所以可以作为阴性对照。

在KYSE30、KYSE150和KYSE410细胞系中检测了 microRNA-548k水平的上调对下调对该细胞系生长曲线的影响。分别 计数2000个细胞接种于96E-Plate上，并将接种细胞的E-Plate放入 RTCA-MP仪器中进行培养，仪器将自动每15分钟计数一次细胞数， 最终获得细胞的生长曲线。该实验结果表明，microRNA-548k水平的 上调促进了食管癌细胞的生长，相反地，microRNA-548k水平的下调 抑制了食管癌细胞的生长（参见图2）

实施例4：改变microRNA-548k表达后对细胞克隆形成的影响

在本实施例中，microRNA-548k序列互补的反义核酸作为抑制剂 使用;在“拟态”的情况中，通过转染与microRNA-548k同样的序列 而导致细胞内microRNA-548k的表达水平上升。在使用抑制剂及拟态 的情况下，细胞中microRNA-548k的表达水平分别下调了约2-11倍， 或上调了约5万倍。在miR-NC阴性对照的情况中，采用转染入线虫 的microRNA序列，因为它与人的不是同源的而人也没有相关的 mircroRNA，所以可以作为阴性对照。

在KYSE30、KYSE150和KYSE410细胞系中检测了 microRNA-548k水平的上调对下调对该细胞系细胞克隆形成的影响。 具体实施如下：计数2000个细胞接种于大皿上，置于5%CO2恒温培 养箱中，37°C培养，培养5天，形成肉眼可见的细胞集落。中止培 养，PBS漂洗2次，甲醇固定10min，用0.5%结晶紫染色20min，流 水冲洗，空气干燥。照相并计数克隆数。结果运用t-test进行统计。P<0.05 为有统计学差异。该实验结果表明，microRNA-548k水平的上调显著 地促进了食管癌细胞的克隆形成，相反地，microRNA-548k水平的下 调显著地抑制了食管癌细胞的克隆形成（参见图3A-3F）（请确认此处 是否正确。

实施例5：改变microRNA-548k表达后对细胞迁移及侵袭的影响

在本实施例中，microRNA-548k序列互补的反义核酸作为抑制剂 使用;在“拟态”的情况中，通过转染与microRNA-548k同样的序列 而导致细胞内microRNA-548k的表达水平上升。在使用抑制剂及拟态 的情况下，细胞中microRNA-548k的表达水平分别下调了约2-11倍， 或上调了约5万倍。在miR-NC阴性对照的情况中，采用转染入线虫 的microRNA序列，因为它与人的不是同源的而人也没有相关的 mircroRNA，所以可以作为阴性对照。

在KYSE30、KYSE150和KYSE410细胞系中检测了 microRNA-548k水平的上调对下调对该细胞系细胞迁移和侵袭的影 响。具体实施如下：

在侵袭实验中，用无血清培养基配制2%浓度的matrigel（将 matrigel在4℃中融解，同时将无血清的培养基、EP管、枪头预冷处理）； 将配好的2%matrigel培养基加入Transwell的上室（各100ul），之后 放入孵箱中孵育1小时以上；将预处理的细胞（饥饿处理6小时后） 用胰酶消化后，用无血清培养基重悬细胞，吹打均匀，细胞计数；在 Transwell的下室中加入含20%血清的培养基600-800ul，将计数好的细 胞加入上室中，并将上室的体积用无血清培养基定容于100-200ul；将 Transwell板放入孵箱中孵育6-10小时后，取出Transwell板，并将上 室上面没有穿过的细胞刮去；将上室放入70%的甲醇中固定约20分钟， 1xPBS洗涤5分钟；0.25%的结晶紫染色40分钟，去离子水洗涤小室。 正置显微镜观察穿透过的细胞，并进行拍照，计数细胞。

在迁移实验中，细胞计数后，在Transwell的下室中加入含20%血 清的培养基600-800ul，将计数好的细胞加入上室中，并将上室的体积 用无血清培养基定容于100-200ul；将Transwell板放入孵箱中孵育6-10 小时后，取出Transwell板，并将上室上面没有穿过的细胞刮去；将上 室放入70%的甲醇中固定约20分钟，1xPBS洗涤5分钟；0.25%的结 晶紫染色40分钟，去离子水洗涤小室。正置显微镜观察穿透过的细胞， 并进行拍照，计数细胞。结果运用t-test进行统计。P<0.05为有统计学 差异。

该实验结果表明，microRNA-548k水平的上调显著地促进了食管 癌细胞的迁移和侵袭，相反地，microRNA-548k水平的下调显著地抑 制了食管癌细胞的迁移和侵袭（参见图4A-4I）。